Stomach Health > mave Sundhed >  > Gastric Cancer > Gastric Cancer

PLoS ONE: SIRT3 Forbedrer Glycolysis og spredning i SIRT3-udtrykkende Gastric Cancer Cells

Abstrakt

SIRT3 er et centralt NAD + - afhængig protein deacetylase i mitokondrier af pattedyrceller, der fungerer for at forhindre celle aldring og transformation via regulering af mitokondrie metaboliske homeostase. Imidlertid er SIRT3 også fundet at udtrykke i nogle humane tumorer; skal belyses dets rolle i disse SIRT3-udtrykkende tumorceller. Denne undersøgelse viste, at ekspressionen af ​​SIRT3 var forhøjet i en gruppe af gastriske cancerceller sammenlignet med normale gastriske epitelceller. Selvom SIRT3 ekspressionsniveauer blev forøget i de gastriske tumorvæv sammenlignet med de tilstødende ikke-tumorvæv, SIRT3 positive cancerceller var hyppigere påvist i de intestinale gastriske cancere end de diffuse gastriske cancere, hvilket indikerer, at SIRT3 er forbundet med undertyper af gastrisk kræft. Overekspression af SIRT3 fremmet celleproliferation og forbedret ATP generation, glucoseoptagelse, glycogendannelse, MnSOD aktivitet og laktat produktion, der blev inhiberet af SIRT3 knockdown, hvilket indikerer, at SIRT3 spiller en rolle i at omprogrammere bioenergetik i gastriske tumorceller. Yderligere analyse afslørede, at SIRT3 interageret med og deacetyleret lactat dehydrogenase A (IdhA), en central protein i regulering anaerob glycolyse, øge IdhA aktivitet. I konsistens blev en klynge af glycolyse-associerede gener opreguleres i SIRT3-overudtrykkende gastriske tumorceller. Således, ud over de veldokumenterede SIRT3-medieret mitokondrie homeostase i normale celler, kan SIRT3 forbedre glykolyse og celleproliferation i SIRT3-udtrykkende cancerceller

Henvisning:. Cui Y, Qin L, Wu, J., Qu X, Hou C, Sun W, et al. (2015) SIRT3 Forbedrer Glycolysis og spredning i SIRT3-udtrykkende Gastrisk cancerceller. PLoS ONE 10 (6): e0129834. doi: 10,1371 /journal.pone.0129834

Redaktør: Xianglin Shi, University of Kentucky, USA

Modtaget: 16. april, 2015; Accepteret: 13. maj 2015; Udgivet: 29 juni 2015

Copyright: © 2015 Cui et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist støttet af National Natural Science Foundation of China, Key Program (30930105), National 12-5 Support Plan Projekt for Ministeriet for Videnskab og Teknologi Kina (2012BAH30F03), National Natural Science Foundation of China (31.070.740), den 985 og 211 projekter af Xi'an Jiaotong Universitet (JKL), og National Cancer Institute RO1 tilskud CA152313-01-A1 (JJL).

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

sirtuins, en familie af NAD + - afhængige histondeacetylaser (HDAC) i pattedyr celler, er impliceret i en lang række fysiske processer, herunder celleoverlevelse, apoptose, metabolisme, stress reaktioner, aldring og levetid [1,2]. Blandt syv sirtuin medlemmer (SIRT1-7), SIRT3 er den bedst karakteriserede mitokondrie sirtuin, funktion at regulere mitokondrielle proteiner involveret i oxidativ phosphorylering, fedtsyreoxidation, urinstofcyklus, og antioxidanten respons [2-9]. Adskillige undersøgelser har understreget den rolle, SIRT3 i metabolisme og homeostase i normale celler og afslørede nye mål og substrater for SIRT3-afhængig deacetylering [10]. Kim et al rapporterede, at SIRT3 er et centralt mitokondrier protein, og mangel på den SIRT3 ekspression er forbundet med øget mitokondrie-DNA beskadigelse og ældning, samt øget potentiale til Ras-induceret celletransformation og SIRT3-medieret MnSOD aktivering bidrager til mitokondrielle homeostase [11,12]. Til støtte, humane embryonale nyre 293-celler (HEK293) celler udviser en forøget SIRT3 ekspression under oxidativt stress, hvilket fører til deacetylering og aktivering af MnSOD [13]. SIRT3 menes at fungere som et tumorsuppressorgen og spiller en central rolle for forøgelse cellehomeostase mod aldring og carcinogenese.

Men nogle tumorceller viser ekspressionen af ​​SIRT3 og potentielle rolle SIRT3 i disse tumorceller , især dens potentielle forhold til den aggressive fænotype, har været kontroversiel [14]. SIRT3 ekspression er lavere eller uopdaget i et array af humane cancere, herunder brystcancer, glioblastom, coloncancer, og osteosarkom, prostata og ovariecancere [11,15,16]. SIRT3 inducerer vækststandsning og apoptose ved selektiv inaktivering af Bcl-2 i HCT116 celler gennem modulering JNK2 signalvej [17]. Desuden er SIRT3 rapporteret at bidrage til øget følsomhed af humane leukæmiceller til kemoterapi eventuelt gennem induktion af mitokondrier-medieret apoptose [18]. På den anden side, SIRT3 ekspression findes også øges i oral cancer, lymfeknude-positiv brystkræft, kræft i spiserøret, og thyroide carcinomer; og den øgede SIRT3 er forbundet med højere malign fænotype og nedregulering af SIRT3 forbedrer tumor følsomhed over for anti-cancerbehandling [19-23]. Disse resultater advare en anden rolle i SIRT3 i specifikke tumorer, der skal være belyst.

Kræftceller er metabolisk aktive og forbruge mere cellulære brændstof end normale celler. Men kræftceller relay på primært på ATP-syntese ved aerob glycolyse, en funktion kaldet Warburg virkning [24]. En sådan aerob glykolyse menes at beskytte kræftceller danner oxidativ stress, da mitokondrie respiration er den vigtigste kilde til intracellulær ROS [25]. Lactat dehydrogenase A (IdhA) er et enzym kontrollerende interomdannelse mellem pyruvat og L-lactat reversibelt ved det endelige trin af anaerob glycolyse [26]. Inhibering af IdhA formindsker tumorigent potentiale med forøget mitokondriel iltforbrug og nedsat mitokondriske membranpotentiale [26] og samlet cellulær ATP-produktion og glycolyse [27].

I denne undersøgelse undersøgte vi potentielle rolle SIRT3 i gastrisk cancerceller, som udtrykker SIRT3. Ekspression af SIRT3 var forbundet med den aggressive vækst, som blev medieret via SIRT3-deacetyleret og aktiveret IdhA, øge glycolyse og ekspression af en gruppe af glycolyse-associerede gener. Således SIRT3-IdhA-medieret glykolyse metabolisme kan være en potentiel terapeutisk mål til behandling af kræftceller, der udtrykker SIRT3.

Materialer og metoder

cellelinjer og kultur

Menneskelig mavekræft cellelinier MGC-803, HGC-27, SGC-7901 [28] og AGS [29] og immortaliseret human gastrisk epitelcellelinie GES-1 [30] blev holdt i RPMI-1640-medium (Invitrogen) suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin, og dyrket ved 37 ° C under en atmosfære af 5% CO2.

Immunopræcipitation og western blot

Subkonfluente celler blev lyseret, og lysaterne blev inkuberet med protein A /G agaroseperler plus den anbefalede mængde af antistoffer mod enten SIRT3 (Cell Signaling Technology) eller IdhA (Santa Cruze) ved 4 ° C natten over. Prøverne blev centrifugeret og separeret ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese og elektroblottet over på nitrocellulosemembraner. Efter blokering med 5% fedtfri mælk i TBST blev membranerne inkuberet med primært antistof ved 4 ° C natten over efterfulgt af inkubation med sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur. Proteiner af interesse blev visualiseret ved ECL påvisning kit (Thermo Fisher).

Immunhistokemi assay

Patologiske lysbilleder af mavekræft med tilstødende normale væv blev analyseret ved immunohistokemi assay blev udført ved at følge producentens instruktioner. Den Polymer Detection kit til immunhistokemi analyse blev købt fra Zhongshan Golden Bridge Bioteknologi. Kort fortalt blev paraffinsnit afvokset og re-hydreret i ethanol (100%, 90% og 75%). Snittene blev inkuberet med 3% H 2O 2 ved stuetemperatur i 10 minutter og derefter blokeret med ikke-immunt gedeserum ved stuetemperatur i 15 minutter. Snittene blev derefter inkuberet med primært antistof til SIRT3 (Cell Signaling Technology) i 2 timer ved stuetemperatur efterfulgt af anti-kanin sekundært antistof inkubation i 15 minutter ved stuetemperatur. Snittene blev derefter inkuberet med DAB påvisningsreagens i 2 minutter hver, modfarvet med hematoxylin og dehydraded i ethanol (90% og 100%). Snittene blev monteret og farvningen blev analyseret under mikroskopi. Salg

Plasmid konstruktion og celle transfektions- Salg

SIRT3 hele længde cDNA blev syntetiseret under anvendelse af RT-PCR med total RNA ekstraheret fra GES-1-celler som skabelon (primere: 5'CCGCGGTACCATGGCGTTGTGGGGTTG 3 'og 5' CCGCTCTAGACTATTTGTCTGGTCCATCAAGC 3 '). CDNA'et blev derefter klonet ind i pcDNA3.1 + ekspressionsvektor (Invitrogen). Den pGPH1 /GFP /Neo-SIRT3-shRNA plasmid rettet mod menneskelige SIRT3 (5 'CTTGCTGCATGTGGTTGAT 3') og kontrollen shRNA plasmidet blev opnået fra GenePharma. For at generere stabile transfektanter blev AGS og SGC-7901-celler transficeret ved hjælp af Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen), og de stabile transfektanter blev udvalgt ved 400ug /ml G418 (Gibco).

Cell spredning og clonogenicity assay

i proliferationsassay blev celler udpladet i en 6-brønds plade ved 2 x 10 4 celler /brønd. Celleproliferation blev beregnet på dag 2, 4, 6, og 8 efter plating. For clonogenicity assay blev cellerne udpladet i en 6-brønds plade med varieret celleantal og dyrket i 14 dage og kolonier blev derefter farvet med krystalviolet, og antallet af kolonier (> 50 celler /koloni) blev talt efter etablerede metoder [31].

Måling af glucose, lactat og glycogen

phenolrødt frit medium blev anvendt til at dyrke celler i 6-brønds plade i 24 timer og niveauet af glukoseoptagelse og lactat generation blev målt ved anvendelse af Glucose Assay Kit og mælkesyre Kit (Jiancheng Bioengineering Institute). De relative værdier blev normaliseret til celleantal af hver brønd. Cellulære glycogenniveauerne blev påvist under anvendelse af Glycogen Assay Kit (BioVision). Kort fortalt, 1 x 10 6 celler blev homogeniseret i 200 pi vand på is, og homogenaterne blev kogt i 5 minutter for at inaktivere enzymerne og centrifugeret ved 13.000 rpm i 5 minutter ved 4 ° C for at fjerne uopløseligt materiale. Den glykogen produktion blev målt med OD-værdien ved 570 nm.

Måling af ATP produktion

Cellular ATP og ROS niveauer blev målt som beskrevet tidligere [32]. Celler dyrket i en plade med 6 brønde efter forskellige behandlinger, blev lyseret og cellulære ATP-niveauer blev målt med ATP bioluminscensassayet Kit (Sigma). Til måling glycolyse-medieret ATP-produktion, blev celler behandlet med 2 pM rotenon i 24 timer, før målingerne.

Måling af ROS-generering

Cellular ROS generation blev analyseret med 5- (og 6-) carboxy-2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFDA) fremgangsmåde under anvendelse af mikroplade-spektrometer (Thermo Fisher) ved 488 nm /530 nm bølgelængde.

MnSOD aktivitet Salg

Celler dyrket i en 6-brønds plade blev lyseret og MnSOD-aktivitet blev bestemt ved WST-8 ved anvendelsen af ​​et MnSOD-assaykit (Beyotime) ifølge producentens instruktioner.

tumorigenicitet assays i nøgne mus

SGC7901 celler (7,5 x 10 6) med SIRT3 overekspression eller knockdown blev suspenderet i 0,1 ml PBS og inokuleret i enten flanke af 5 uger gamle BALB /c athymiske nøgne mus, og ved 28 th dag efter inokulering, når den maksimale tumorvolumen (~ 1500 mm 3) nåede i kontrolgruppen, blev forsøgene afsluttet og alle tumorer fra hver gruppe blev udskåret og vejet. Den eksperimentelle procedure, der omfatter dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer; Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved Xian Jiao Tong University specifikt godkendt denne undersøgelse (protokolx.181).

Laktatdehydrogenase assay

lactatdehydrogenaseaktivitet blev bestemt efter de etablerede protokol ved måling af nedsættelse i absorbansen ved bølgelængden 340 nm som følge af oxidationen af ​​NADH [27]. Kort fortalt blev celler dyrket i 10 cm skåle og homogeniseret i PBS på is. Homogenaterne blev tilsat til buffer indeholdende 6,6 mM NADH, 30 mM natriumpyruvat og 0,2 M Tris-HCl, pH 7,3 og blandet. Inkuber blandingen i 5 minutter for at opnå temperaturudligning og derefter optage faldet hastigheden for absorbansen ved 340 nm.

SIRT3 in vitro
deacetylering assay

Humant SIRT3 rekombinante enzym ( BPS) blev inkuberet med L-laktatdehydrogenase fra bovine hjerte (Sigma) i reaktionspuffer (50 mM NaCl, 4 mM MgCl 2, 10 mM NAD +, 50 mM DTT, 50 mM Tris, pH 8,0) med /uden SIRT3 inhibitor nicotinamid (NAM, 10 mM) ved 37 ° C i 1,5 timer, hvorefter reaktionerne blev anvendt til IdhA aktivitetsassay beskrevet som ovenfor.

Real-time PCR

totalt RNA blev isoleret under anvendelse TRIZOL Reagent (Invitrogen), efterfulgt af behandling med phenol /chloroform og udfældning med 2-propanol. Total RNA pellet blev derefter vasket med 75% ethanol og resuspenderes i vand. RNA blev underkastet revers transkription med PrimeScript RT-PCR Kit (Takara) og kvantitativ real-time PCR-analyse af gener af interesse blev udført ved anvendelse SYBR PremixExTaq II kit (Takara) ifølge producentens instruktioner. Data blev normaliseret til det niveau af γ-tubulin.

Immunofluorescens

AGS celler podet på dækglasset i en plade med 6 brønde blev fikseret i 4% paraformaldehyd i 10 minutter og blokeret i 1% BSA i 1 time ved stuetemperatur. Cellerne inkuberes med primære antistoffer mod SIRT3 og IdhA ved 4 ° C natten over, efterfulgt af inkubation med fluorescens-konjugeret sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur. Kontrastfarvning blev udført med DAPI hjælp immunofluorescens kit (Beyotime). Celler blev monteret og afbildes af laser scanning konfokal mikroskop.

Statistisk analyse

Data præsenteres som gennemsnit ± SE fra mindst tre uafhængige forsøg. Statistisk analyse blev udført med uparret tohalet Students t-test, medmindre andet er angivet. P
< 0,05 blev betragtet som signifikant.

Resultater

SIRT3 udtryk i gastriske kræftceller

SIRT3 er veldefineret i reguleringen mitokondrie homeostase i anti-aging og anti-transformation. For nylig er forskellige resultater rapporteres om til SIRT3-medieret celle hæmning og spredning, hvilket fører til kontroversen af ​​sine roller i kræft [19,20]. For at bestemme den potentielle rolle SIRT3 i gastrisk kræft, blev opdaget udtryk for SIRT3 i 4 gastrisk cancer cellelinjer AGS, SGC-7901, MGC-803, HGC-27 og en gruppe af mavekræft tumorvæv. Vi fandt, at SIRT3 proteinniveauer var forhøjet i alle 4 gastrisk cancer cellelinjer sammenlignet med de immortaliserede gastriske epitel GES-1-celler (AGS, 1,9-fold; SGC-7901, 1,5-fold; MGC-803, 2,0-fold; og HGC -27, 1,8 gange sammenlignet med GES-1-celler) (fig 1A). I overensstemmelse blev mRNA-niveauer af SIRT3 i disse cellelinier også forøget (AGS, 2,6-fold; SGC-7901, 1,7-fold; MGC-803, 2,5-fold; HGC-27, 2,2 gange) sammenlignet med GES- 1-celler (figur 1b).

Immunhistokemi analyse i tumor og tilstødende ikke-tumor normale væv fra en gruppe af mavecancerpatienter viste, at SIRT3-positive celler var hyppigere påviselige i tumorvæv end i normalt væv. Resultaterne viste, at 55,1% af tumorvæv (7% af normale væv) udviste højt niveau (stærk positiv), 41,4% af tumorvæv (28% af normale væv) udviste medium højt niveau (svagt positive), mens 3,5% af tumor væv og 64% af normale væv var negativ i SIRT3 ekspression (fig 1C og 1D, S1A fig). Interessant SIRT3 udtryk i tarm type tumorvæv (15 sager, 93,3% stærk positiv og 6,6% svagt positiv) var signifikant højere end i diffust type tumorvæv (14 tilfælde; 14,3% stærkt positivt, 78,6% svagt positive og 7,1 % negative) (fig 1C og 1E, S1B fig). Disse resultater tyder på, at SIRT3 udtryk øges i nogle tumorer sammenlignet med beslægtede normale væv og SIRT3 udtryk kan være varierer i individuelle tumorer, som skal undersøges nærmere.

SIRT3 niveauer er forbundet med celleproliferation

Så etablerede vi SIRT3 overekspression og knockdown cellelinjer hjælp AGS og SGC-7901 celler. Ekspressionen af ​​SIRT3 i stabile transfektanter blev bekræftet ved Western blot. Overekspression af SIRT3 forøget cellevækst, mens SIRT3 knockdown inhiberede cellevækst af både gastriske cancercellelinier (Fig 2A). Endvidere overekspression af SIRT3 udløst mere kolonidannelse end kontrol transficerede celler, der var i modsætning til kun færre kolonier dannet i SIRT3 knockdown celler (Fig 2B).

For yderligere at fastlægge den rolle, SIRT3 i tumordannelse evne, injicerede vi SIRT3 overekspression og knockdown SGC-7901 celler i flankerne af nøgne mus og tumorvækst lodes i 28 dage efter celleinokulering (S2 fig). Den gennemsnitlige vægt af tumorerne afledt fra SIRT3 overudtrykker celler var 0.7079g, betydeligt større end den gennemsnitlige tumorvægt af kontrol (NC), s
= 0,015, (fig 2C, venstre panel). I modsætning hertil er den gennemsnitlige vægt af tumorer afledt fra SIRT3 knockdown celler var 0.0588g, betydeligt mindre end den fra scramble shRNA kontrolceller (SCR) (0.2033g; s
= 0,009) (fig 2C, højre panel) . Den gennemsnitlige mængde af tumorer afledt SIRT3 overudtrykkende celler blev øget end fra kontrol celler (NC) (Fig 2C, venstre panel op højre hjørne). Tværtimod den gennemsnitlige mængde af tumorer vokser fra SIRT3 knockdown celler var dramatisk lille i forhold til fra kontrolceller (SCR) (fig 2C, højre panel op højre hjørne).

Udvidet glykolyse i SIRT3 udtrykker gastrisk cancer celler

Vi blev derefter spekulerer på, hvordan cellulære bioenergetik kunne ændres i SIRT3-overekspression gastriske kræftceller. SIRT3 overekspression dramatisk forøget glukoseoptagelse (1,4 gange i AGS og 1,9 gange i SGC-7901), mens SIRT3 knockdown faldt glukoseoptagelse (ca. 40% i begge AGS og SGC-7901) (Fig 3A og 3B). I overensstemmelse med det mønster af glucose forbrug, havde SIRT3 overudtrykker celler forøgede niveauer af lactat sekretion (1,2 gange i AGS og 1,3 gange i SGC-7901), hvorimod SIRT3 knockdown-celler havde nedsat niveau af lactat sekretion (55% i AGS og 45 % i SGC-7901) (fig 3C og 3D). Vi fandt også, at glykogen dannelse var signifikant forhøjet ved SIRT3 overekspression (1,5 gange i AGS og 1,3 gange i SGC-7901), en funktion af hurtig vækst af tumorceller [33], mens reduceret med SIRT3 knockdown (40% i AGS og 70% i SGC-7901) (fig 3E og 3F).

SIRT3 er blevet bevist involveret i deacetylering af globale stofskifte enzymer og vedligeholdelse af basale ATP niveauer i celler både i normal tilstand og i sygdomme [1 , 2]. Total cellulær ATP og glykolyse ATP generation blev fundet i AGS og SGC-7901 celler med enten SIRT3 overekspression eller SIRT3 knockdown. De samlede cellulære ATP-niveauer blev forøget i SIRT3 overudtrykker celler (omkring 1,3 gange i begge cellelinier), men faldt i SIRT3 knockdown celler (ca. 75% i begge cellelinier) sammenlignet med NC eller Scr kontrolceller (fig 4A og 4B) . Derefter behandlet vi celler med rotenon at inhibere oxidativ phosphorylering, og afprøvet ATP produktion fra glykolyse. Som det er vist i fig 4C og 4D, førte SIRT3 overekspression til en stigning i glycolyse ATP-produktion (1,4 gange i AGS og 1,6 gange i SGC-7901), mens SIRT3 knockdown førte til et signifikant fald i glycolyse ATP-produktion (20% i AGS og 40% i SGC-7901) i forhold til NC eller Scr kontrol.

SIRT3 regulerer homeostase af ROS i gastriske kræftceller

en række beviser understøtter, at øget ROS niveau er en kritisk egenskab i cancerceller, som gør kræftceller mere følsomme over for yderligere ROS stress [34]. Her fandt vi, at overekspression af SIRT3 faldt ROS niveauer til 70% og 80% i AGS og SGC-7901 celler, mens hæmning af SIRT3 udtryk øgede ROS niveauer (1,4 gange i AGS celler og 1,6 gange i SGC-7901 celler) henholdsvis (fig 5A og 5B). Efter aftale med litteraturen viser SIRT3 deacetylerer og aktiverer MnSOD (11, 12) i mavens kræftceller blev MnSOD aktivitet forbedret ved SIRT3 overekspression (1,4 gange i AGS celler og 1,2 gange i SGC-7901 celler), men reduceret med SIRT3 knockdown (50% i AGS-celler og 65% i SGC-7901 celler) (fig 5C og 5D), hvilket antyder, at SIRT3 kan beskytte celler mod oxidativ stress-induceret skade ved at genoprette ligevægten intracellulær ROS ved at forbedre MnSOD-aktivitet i gastriske cancerceller.

SIRT3 deacetylerer og aktiverer IdhA

IdhA spiller en central rolle i tumor initiering, vedligeholdelse og progression. Inhibering af IdhA aktivitet blokke tumorigenicitet og tumorprogression [26,27] og IdhA aktivitet kan reguleres ved acetylering /deacetylering modifikation [35]. Vi spørger om SIRT3 er involveret i reguleringen af ​​IdhA aktivitet. Vi fandt, at i gastriske cancerceller, blev IdhA aktivitet steg betydeligt i SIRT3 overudtrykkende celler, hvorimod faldet i SIRT3 knockdown celler sammenlignet med NC eller Scr kontrolceller separat uden påviselig ændring i IdhA proteinniveauet i de stabile transfektanter (fig 6A). Immunofarvning Resultaterne viste, at IdhA og SIRT3 blev co-lokaliseret i cytoplasmaet (fig 6B), og co-IP-analyse med enten IdhA eller SIRT3 antistof afslørede, at SIRT3 er i stand til at interagere med IdhA (Fig 6C). Desuden blev niveauet af IdhA acetylering faldt i SIRT3 overudtrykker celler, men steg i SIRT3 knockdown celler (Fig 6D). Endvidere in vitro
IdhA aktivitetsassay udføres under anvendelse kommercielt humant rekombinant SIRT3 og bovin hjerte L-laktatdehydrogenase indikerede, at IdhA aktivitet blev forøget med tilstedeværelsen af ​​SIRT3 i reaktionen, der blev vendt ved tilsætning af SIRT3 inhibitor , nicotinamid (figur 6E). For at identificere potentielle SIRT3 deacetylering site (s) på IdhA, vi søgte database og fundet, at K5, K14, K57, K81, K118, K126, K222 og K318 er potentielle acetylering steder i IdhA, og tidligere undersøgelse rapporterede, at K5 acetylering /deacetylering var impliceret i reguleringen af ​​IdhA aktivitet [35]. Derefter gjorde vi IdhA aktivitet under anvendelse lysin 5 og lysin 318 acetylering efterligner (K5Q /K318Q) eller deacetylering efterligne (K5R /K318R) mutant IdhA, og fandt, at hverken K5 eller K318 var nødvendig for SIRT3-medieret IdhA aktivering (S3 Fig). Yderligere identifikation af SIRT3-medieret IdhA deacetylering er i nød.

SIRT3 opregulerer gener involveret i cellulær metabolisme

For at karakterisere den molekylære underskrift SIRT3-IdhA medierede bioenergetik i gastrisk kræftceller, målte vi ekspression af gener associeret med glucose transport og glycolyse. Data i figur 7A og 7B viste, at overekspression af SIRT3 i AGS eller SGC-7901 induceret ekspression af HK2 (1,47-fold i AGS celler, 1,3 gange i SGC-7901 celler), MCT4 (2,3 gange i AGS celler, 1,34 fold i SGC-7901 celler) og Glut1 (1,55-fold i AGS celler, 1,38-fold i SGC-7901 celler) på mRNA-niveau testet af real-time PCR. Tværtimod SIRT3 knockdown faldt ekspressionen af ​​genet HK2 til 76%, MCT4 til 73% og Glut1 til 62% i AGS celler, mens HK2 til 80%, MCT4 til 62% og Glut1 til 74% i SGC-7901 celler. Hertil kommer, når SIRT3 blev overudtrykt, blev MCT1 mRNA-niveau steg i AGS celler 1,6 gange, men ikke i SGC-7901 celler, og når SIRT3 blev knockdown, blev MCT1 faldt til 59% i AGS og 65% i SGC-7901 celler henholdsvis.

diskussion

Denne undersøgelse giver bevis for, at SIRT3 udtrykt i nogle kræftceller, såsom gastrisk kræftceller, kan være forbundet med den øgede aggressivitet ved SIRT3-medieret bioenergetik via deacetylering og aktivering af LADH. Selvom akkumulere beviser indikerer, at SIRT3 spiller en central rolle i beskyttelsen af ​​normale celler mod aldring og malign transformation, dens funktion i allerede transformerede celler, såsom tumorceller, som udtrykker SIRT3 skal undersøges [19]. Manglende SIRT3 i MEF'er fører til genomisk ustabilitet og en høj frekvens af celletransformation medieret af Ras med en øget hyppighed af tumor dannelse og ældning, hvilket tyder på, at SIRT3 er nødvendig forebyggelse af cellulær aldring og carcinogenese [11,15]. Desuden er manglende eller lavere ekspression af SIRT3 påvist i adskillige humane cancere og SIRT3 niveau er forbundet med følsomheden af ​​cancerceller til kemo- og stråleterapi [11,15,16]. Men SIRT3 også vist være overudtrykt i humane kræftformer og i forbindelse med terapi modstand [19,21,36]. Disse resultater antyder, SIRT3 kan målrette forskellige proteiner mellem normale celler og cancerceller, og at SIRT3 ekspression kan varieres på forskellige typer af cancer, såsom de nuværende resultater indikerer, at den intestinale type mavekræft udtrykker et højere SIRT3 end den diffuse type mavekræft.

det er blevet almindeligt accepteret, at tumorceller forbruge mere cellulær energi for at støtte den hurtige vækst og proliferation end de normale celler ved hjælp glycolysen som den vigtigste kilde til ATP generation i stedet for oxidative fosforylering [24] . I aktuelle undersøgelse, viste vi, at i gastrisk kræftceller, SIRT3 interagerer med og deacetylerer IdhA, forårsager øget IdhA aktivitet; og SIRT3 overekspression fører til øget cellulær ATP-produktion og MnSOD aktivitet sideløbende med reduceret cellulær ROS niveau, hvilket indikerer en forøget oxidativ scavenger evne SIRT3 eventuelt via deacetylering-medieret MnSOD enzymaktivering. Stigende beviser viser, at SIRT3 er nødvendig for opretholdelse af cellulære og mitokondrier homeostase gennem regulering mitokondrier stofskifte og cellulære redox balance system beskytter celler mod oxidativt stress via regulering af ROS generation, en kritisk mekanisme i aldring, kræft og hjertesygdomme [1,2, 37]. SIRT3 kan deacetylate en gruppe af mitochondrier mål impliceret i reguleringen af ​​både glykolyse og cellulær oxidativ stress. For nylig er SIRT3 fundet kunne deacetylate og øge pyruvat dehydrogenase-aktivitet i cancerceller, hvilket kan øge både mitochondriale bioenergetik og glycolyse [38]. Efter aftale, den aktuelle undersøgelse viser, at SIRT3 kan deacetylate og aktivere IdhA, der kan bruges til både mitokondrielle respiration og glykolyse. På den anden side kan SIRT3 deacetylate og efterfølgende aktivere andre mitochondrie substrater, såsom MnSOD [11,12], Foxo3 [39] og IDH2 [9] til at fjerne ROS produceres af oxidativ phosphorylering, beskyttelse af celler mod oxidativ skade [40] . overensstemmelse med disse resultater, i denne undersøgelse fandt vi også, at overekspression af SIRT3 øger MnSOD aktivitet, som kunne være en grund af reduceret cellulært ROS niveau under skærpet cellemetabolisme tilstand.

IdhA, som en familie medlem af laktat dehydrogenase (LDH), findes fandtes i glycolytiske celler og lokaliseret i mitokondrier i tillæg til cytosolen [41], og hovedsagelig katalysere inter-omdannelse af pyruvat og lactat [42]. IdhA er vist at spille en central rolle i aerob glykolyse og tumorigenicitet i maligne celler [26,27]. I kræftceller, IdhA forbruger hurtigt pyruvat produceret af glycolytisk vej, der fører til øget aerob laktat produktion [26]. Inhibering af IdhA inducerer ROS produktion, falder cellulære ATP-niveauer og inhiberer glycolysen, inhiberer derfor cellevækst og udløser celledød i cancer [27]. Bestående med disse rapporter, fandt vi, at SIRT3 kan interagere og aktivere IdhA. I SIRT3 overudtrykker celler blev IdhA acetylering reduceret med en øget IdhA enzymaktivitet. Selvom nøjagtige mekanisme forårsager SIRT3-medieret IdhA regulering skal undersøges nærmere, disse resultater viser, at IdhA kontrolleret glykolyse vej, der accelererer tumor bioenergetik kan påvirkes af SIRT3 ekspressionsniveauerne.

Vores nuværende undersøgelse viste også, at ekspressionen af en gruppe af gener, såsom MCT1, MCT4, HK2 og Glut1, kendt som vigtige regulatorer af energimetabolisme i cancer er også steget i SIRT3-overekspression gastriske cancerceller, hvilket viser en potentiel rolle SIRT3 i styrkelsen glycolyse i tumorceller. HK2 katalyserer phosphorylering af glucose til glucose-6-phosphat ved det indledende trin af glycolyse [43]. Glucose transporter (GLUT) styrer transporten af ​​glucose over plasmamembranen, der fungerer som den første hastighedsbegrænsende trin for glucosemetabolisme [44]. MCT1 og MCT4, medlemmer af monocarboxylater (såsom laktat og pyruvat) transporter familie, er også involveret i væksten i glycolyse tumorer [45]. Tilsammen udgør disse resultater tyder på en potentiel samspil mellem SIRT3 og en gruppe af glycolyse-associerede gener i signalering tumor aggressive vækst, som skal undersøges nærmere.

Som konklusion, selv om SIRT3 er godt karakteriseret i mitokondrie homeostase mod celle aldring og transformation, udtryk for SIRT3 i tumorceller er forbundet med øget proliferation og aggressiv vækst af gastriske kræftceller. SIRT3 interagerer og aktiverer IdhA, hvilket fører til øget glykolyse og ATP-produktion, som sammen med forøget mitokondriel antioxidant MnSOD aktivitet og nedsat intracellulær ROS niveau (en hypotetisk model foreslås i figur 7C). Således vækst-stimulerende funktion af SIRT3 viser et potentielt mål at behandle tumorer med SIRT3 udtryk.

Støtte Information
S1 Fig. Repræsentative patologiske dias til bestemmelse af SIRT3 udtryk i humane mavekræft prøver.
A, paraffin-indlejret human mavekræft og parrede tilstødende patologisk normale vævsprøver blev udsat for immunhistokemi farvning med SIRT3 antistof (brun) efterfulgt af kerner kontrastfarve med hæmatoxylin ( blå, hver tumor blev vist med tilstødende normale væv i én række med 20 × og 40 ×). B, repræsentative billeder af SIRT3 udtryk i tarm og diffuse typer af mavekræft. Scale bar, 50 um
doi:. 10,1371 /journal.pone.0129834.s001
(TIF)
S2 Fig. Overekspression af SIRT3 fremmes tumorbyrde in vivo.
SGC-7901 celler med SIRT3 overekspression (A) eller knockdown (B) blev subkutant injiceret i højre flanke af nøgne mus med de relative kontrolceller (NC eller SCR) i den venstre flanke. Xenotransplantattumorer blev udskåret og vejet på den 28. dag efter celleinokulering. Billeder af højre panel viste xenotransplantattumorer in vivo ved slutningen af ​​eksperimentet. Billeder viste tumorvækst i mus
doi:. 10,1371 /journal.pone.0129834.s002
(TIF)
S3 Fig.

Other Languages