PLoS ONE: Reg IV Er et direkte mål for intestinal Transcriptional Factor CDX2 i Gastric Cancer

Abstrakt

REG4
, som koder Reg IV protein, er medlem af calcium-afhængige lektin superfamilien og potent aktivator af den epidermale vækstfaktorreceptor /Akt /aktivator-protein-1-signalering pathway. Adskillige humane cancere overudtrykker Reg IV, og Reg IV ekspression er forbundet med intestinal fænotype differentiering. Men regulering af REG4
transskription fortsat uklart. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi, om CDX2 regulerer Reg IV ekspression i gastrisk cancer (GC) celler. Ekspression af Reg IV og CDX2 blev analyseret ved Western blot og kvantitativ revers transkription-polymerasekædereaktion i 9 GC cellelinjer og 2 kolon cancercellelinjer. Funktionen af ​​5'-flankerende region af REG4
gen blev karakteriseret ved luciferase assay. I 9 GC cellelinjer, blev endogent Reg IV og CDX2 ekspression godt korrelerede. Brug en østrogen receptor-regulerede form for CDX2 blev hurtig induktion af Reg IV udtryk observeret i HT-29 celler. Reportergenassays afslørede en vigtig rolle i transkription for konsensus CDX2 DNA-bindende elementer i 5'-flankerende region af REG4
gen. Chromatin immunopræcipitationsanalyser viste, at CDX2 binder direkte til 5'-flankerende region i REG4
. Disse resultater indikerer, at CDX2 protein direkte regulerer Reg IV ekspression

Henvisning:. Naito Y, Oue N, Hinoi T, Sakamoto N, Sentani K, Ohdan H, et al. (2012) Reg IV Er et direkte mål for intestinal Transcriptional Factor CDX2 i Gastric Cancer. PLoS ONE 7 (11): e47545. doi: 10,1371 /journal.pone.0047545

Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA

Modtaget: 24. maj 2012; Accepteret: 12. september 2012; Udgivet: November 2, 2012 |

Copyright: © 2012 Naito et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud-in-Støtte til forskning fra Ministeriet for uddannelse, kultur, videnskab, sport og teknologi i Japan, og dels af en Grant-in-Støtte til tredje Omfattende 10-årig strategi for Cancer Kontrol og for Cancer Research fra Ministeriet for sundhed, arbejde og velfærd i Japan, og for National Institute of Biomedical Innovation (Program til fremme af de grundlæggende Studier i Health Sciences). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Gastrisk cancer (GC) er en af ​​de mest almindelige humane cancere i verden. Kræft udvikler sig som et resultat af flere genetiske og epigenetiske ændringer [1]. Vi har tidligere udført seriel analyse af genekspression (SAGE) af fire primære GCS og identificeret flere GC-specifikke gener [2]. Af disse gener, regenererende ø-afledte familiemedlem 4
( REG4
, som koder Reg IV protein) er en kandidat gen for kræft-specifikke udtryk [3]. REG4
er medlem af REG
gen familie, som hører til calcium-afhængige lektin superfamilien. REG4
blev oprindeligt identificeret ved high-throughput sekvensanalyse af en stor inflammatorisk tarmsygdom cDNA-bibliotek [4]. Reg IV er en potent aktivator af den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR) /Akt /aktivator-protein-1 (AP-1) signalvejen i colon cancerceller og forøger ekspression af Bcl-2, Bcl-xl og survivin, som er proteiner forbundet med inhiberingen af ​​apoptose [5]. Forstærkning af REG4
gen er blevet rapporteret i bugspytkirtelkræft [6]. Reg IV er blevet identificeret som en af ​​de gener opreguleret i cancer-initierende celler [7]. Vi har tidligere undersøgt effekten af ​​tvungen udtryk for Reg IV i GC-cellelinje. Vi viste, at Reg IV inhiberer 5-fluorouracil (5-FU) -induceret apoptose gennem EGFR-aktivering i GC-celler [8]. I modsætning hertil Reg IV-overudtrykkende celler ikke signifikante forskelle i proliferation og invasion aktivitet sammenlignet med celler transficeret med tom vektor [8]. Disse resultater støtter den tanke, at Reg IV protein deltager i gastrisk carcinogenese

GC kan opdeles i fire fænotyper efter mucin udtryk:. Gastrisk eller foveolar fænotype; intestinal fænotype; tarm og gastrisk blandet fænotype; og hverken gastrisk eller intestinal fænotype [9]. Distinct genetiske ændringer synes at være forbundet med gastrisk og intestinal fænotype GC [10]. I vores tidligere bemærkninger, blev Reg IV udtrykt i 30% af GC sager og var korreleret med intestinal fænotype [11]. En række immunohistokemiske analyser af Reg IV er blevet rapporteret i humane cancere [11] - [20]. Generelt rapporterede disse analyser, at Reg IV udtrykkes i adenocarcinom-celler, som viser en intestinal fænotype. Det er blevet rapporteret, at Reg IV ekspression induceres af GLI1, hvilket er en afgørende transkriptionel faktor i pindsvinesignaleringsvejen [21] eller af vækstfaktorer, såsom EGF, transformerende vækstfaktor-α (TGF-α), hepatocytvækstfaktor (HGF), eller basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) [22]. Men disse molekyler er usandsynligt, at redegøre for sammenhængen mellem Reg IV udtryk og tarm fænotype differentiering,.

Vi har tidligere fundet, at ekspressionen af ​​Reg IV var korreleret med CDX2 udtryk [11]. CDX2 er en mammal kaudalt-relateret intestinal transkriptionsfaktor og vigtigt for opretholdelsen af ​​intestinale epitelceller [23], [24]. Adskillige former for evidens tyder på, at intestinal metaplasi af mave og tarm fænotype GC er forbundet med ektopisk CDX2 udtryk [9], [25]. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi, om CDX2 regulerer Reg IV ekspression i GC og konstateret, at CDX2 direkte binder til 5'-flankerende region i REG4
genet og øger promotoraktivitet.

Resultater

Reg IV og CDX2 Expression er korreleret i GC Celler

Vi først undersøgte induktion af Reg IV udtryk ved CDX2 i GC cellelinjer. Western blot analyse af CDX2 i 9 GC cellelinier afslørede, at ingen eller lav-niveau ekspression af CDX2 blev detekteret i MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, og KATO-III (fig. 1A). For at bestemme om CDX2 og Reg IV ekspression stramt var korreleret i GC-celler, Western blot og kvantitativ revers transkription-polymerasekædereaktion (QRT-PCR) analyser af Reg IV blev udført på 9 GC cellelinier. Som vist i fig. 1A, Reg IV proteinekspression blev kun fundet i de 3 cellelinjer med høje niveauer af REG4
udskrifter målt ved QRT-PCR. Af de 5 GC cellelinjer med CDX2 proteinekspression, 2 cellelinier (MKN-1 og MKN-28) manglede påviselig udtryk for REG4
udskrifter og protein. De cellelinier med målbart CDX2 proteinekspression (MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, og KATO-III) viste ikke REG4 Salg transkripter eller protein (fig. 1A).

Dernæst genererede vi en polyklonal population af MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, og KATO-III-celler udtrykker høje niveauer af CDX2 ved infektion af cellerne med replikationsdefekte retrovira, der bærer et uforkortet human CDX2 cDNA fordi ingen eller lav-niveau ekspression af CDX2 blev påvist i disse cellelinier. Imidlertid overekspression af CDX2 undladt at aktivere Reg IV ekspression ved Western blot (data ikke vist). Fordi det er muligt, at CDX2 alene ikke er tilstrækkelig til at aktivere Reg IV udtryk, udtryk for CDH17
(kodning LI-cadherin protein), som er et af målene for CDX2 [24], blev også undersøgt. Men aktivering af LI-cadherin ekspression blev ikke fundet i MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, og KATO-III-celler udtrykker høje niveauer af CDX2 (data ikke vist). Fordi vi viste aktivering af LI-cadherin ekspression ved CDX2 i HT-29 coloncancer cellelinie [24], blev induktion af Reg IV ekspression undersøges i den samme cellelinje. Som vist i fig. 1B, induktion af Reg IV-ekspression blev detekteret i HT-29 celler inficeret med retrovira, der bærer en fuld-længde humant CDX2 cDNA. Vi genererede også en polyklonal population af SW480 (coloncancercellelinie) celler, der udtrykker høje niveauer af CDX2 ved infektion af cellerne med replikationsdefekte retrovira, der bærer et uforkortet human CDX2 cDNA. Som vist i fig. 1B, induktion af Reg IV-ekspression blev fundet i SW480-celler inficeret med retrovira, der bærer en fuld-længde humant CDX2 cDNA. Disse resultater antyder, Reg IV-ekspression kan induceres af CDX2 i cellelinjer afledt fra coloncancer. Fordi der i intestinal metaplasi i maven, CDX2 og Reg IV udtryk er godt korreleret [11], anvendelse af en tyktarmskræft cellelinje kunne være egnet til den model af intestinal metaplasi.

For bedre at vurdere forholdet mellem CDX2 og Reg IV udtryk, studerede vi Reg IV udtryk i en HT-29-afledte linie med stramt reguleret CDX2 aktivitet. Vi anvendte et polyklonalt HT-29 cellelinien, der var blevet transduceret med pCDX2-ER vektor. Den pCDX2-ER vektoren koder et kimært protein, hvori fuld længde CDX2 sekvenser fusioneres opstrøms for en muteret østrogenreceptor (ER) ligandbindende domæne. Det muterede ER ligandbindende domæne ikke længere binder østrogen, men bibeholder evnen til at binde tamoxifen. Behandling af HT-29 /CDX2-ER-cellelinie med 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) resulterede i stærk induktion af Reg IV proteinekspression inden for 48 timer (fig. 1c). Disse resultater indikerer, at Reg IV er en direkte eller primær målgen reguleret af CDX2. Men CDX2 alene ikke tilstrækkelig til at aktivere Reg IV udtryk.

Hæmning af CDX2 ved RNA interferens (RNAi) Resultater i nedregulering af Reg IV i GC Celler

For at bestemme om CDX2 er nødvendig for Reg IV ekspression i GC-celler, analyserede vi virkningen af ​​inhibering CDX2 ekspression ved RNAi i niveauet af Reg IV ekspression i HSC-39 cellelinie, fordi høj endogen CDX2 og Reg IV-ekspression blev detekteret i HSC-39 cellelinien. CDX2-specifikke små interfererende RNA (siRNA'er) betydeligt undertrykt CDX2 proteinekspression 3 dage efter transfektion, og ekspressionen af ​​Reg IV afskrift blev nedreguleret ca. 50% af CDX2 siRNAs i HSC-39 sammenlignet med dets niveauer i kontrol siRNA-behandlede celler ( fig. 1D). Disse resultater indikerer, at CDX2 er involveret i at opretholde Reg IV genekspression.

Funktionel karakterisering 5'-flankerende region REG4
Gene af Luciferase Assay

For at identificere potentielle CDX2 -bindende sites i REG4
promoter region, en søgning på de genomiske sekvenser umiddelbart 5 'for den formodede transskription startstedet blev udført ved hjælp af en konsensus bindende element for CdxA kylling caudale
homolog (5'-a, a /T, T, a /T, a, T, a /G-3 ') [26] og en tidligere beskrevet søgealgoritme [27]. Vi fandt fire formodede CDX2-bindende sites i 2 kilobase (kb) 5'-flankerende region af REG4
gen (fig. 2A). Disse var: site A (5'-AATAATA-3 ', fra -1828 til -1834), sted B (5'-CTTTACAG-3', fra -901 til -908), stedet C (5'-TTTTATGG-3 ', fra -114 til -121), stedet D (5'AATAATA -3', fra -90 til -96). For at vurdere betydningen af ​​disse formodede CDX2-bindingssteder i reguleringen REG4
transskription, diverse reporter genkonstruktioner blev genereret. Som vist i fig. 2B, reporter genkonstruktioner indeholdende 2,1, 1,2, eller 0,6 kb af 5'-flankerende sekvens fra REG4
gen udviste kraftig aktivitet i HSC-39 celler, som viser stærk endogen udtryk for REG4
udskrifter og protein. Til sammenligning MKN-1-celler har ringe endogen REG4
transkript og vises lidt eller ingen transkriptionelle aktivitet induceret af 2.1, 1.2 eller 0,6 kb REG4
reporter genkonstruktioner (data ikke vist) . REG4
reporter genkonstruktioner indeholdende basepar -116 til 58 og -87 til 58 havde reduceret aktivitet i HSC-39-celler (Fig 2B.), Hvilket indikerer, at sekvenser mellem basepar -634 og - 116 spiller en central rolle i aktivering REG4
transskription. Endvidere har vi analyseret enkelt og flere mutationer i den formodede CDX2-bindingssteder i 5'-flankerende region af REG4
gen ved anvendelse HSC-39-celler (fig. 2C). Som forventet formodede CDX2-bindingssted C, som er beliggende mellem basepar -634 og -116, spiller en afgørende rolle i aktivering REG4
transkription.

CDX2 binder direkte til 5 ' -flanking region REG4
Gene

for at analysere, om CDX2 binder direkte til de formodede CDX2-bindende steder i REG4
5'-flankerende region, vi udførte kromatin immunofældning (chip) assays under anvendelse af HSC-39-celler. Brug 6 primere for REG4
5'-flankerende region (fig. 3A), vi genvundet DNA-fragmenter, der indeholder REG4
5'-flankerende region ved primer 1, som omfatter formodede CDX2- bindingssted C (fig. 3B). DNA-fragmenter fra 5'-flankerende region i REG4
, der blev dannet ved anvendelse af primere 2, 3, 4, 5 og 6, således at de ikke indeholder formodede CDX2 bindingssteder, blev ikke udvundet ved anti- CDX2 antistof. Specificiteten af ​​genopretning af REG4
promoter regionen efter chip med anti-CDX2 antistof blev vist ved det faktum, at andre irrelevante DNA-fragmenter mangler CDX2-bindingssteder (f.eks exon 3 i CDX1
gen) blev ikke inddrives (fig. 3B). Desuden mock immunopræcipitation (muse-IgG) gav nogle REG4
eller CDX1
-specifikke DNA-fragmenter (fig. 3B). Alle disse resultater tyder på, at CDX2 aktiverer REG4
transskription ved direkte binding til sekvenser i 5'-flankerende region af genet.

Trimethylation af histon H3 lysin 27 (H3K27me3) på REG4
Promotor i GC cellelinjer

Selvom CDX2 proteinekspression blev fundet i MKN-1 og MKN-28 cellelinjer, manglede disse 2 cellelinjer påviselig udtryk for REG4
udskrift og protein. Fordi det er blevet rapporteret, at DNA hypermethylering af CpG-øer er forbundet med inaktivering af adskillige gener [28], undersøger vi, om DNA-methylering induceret transkriptionel inaktivering af Reg IV i MKN-1 og MKN-28-celler. Vi behandlede disse celler med en demethyleringsmiddel, 5-aza-2'-deoxycytidin (Aza-dC) og derefter udførte QRT-PCR. Imidlertid blev Reg IV udtryk ikke gendannet i disse cellelinjer (data ikke vist), hvilket tyder på, at DNA methylering er ikke forventes at påvirke Reg IV udtryk. Det er blevet også rapporteret, at H3K27me3 er blevet forbundet med undertrykt genekspression [29]. Vi yderligere undersøgt H3K27me3 i GC-cellelinjer. For at bestemme berigelsen af ​​H3K27me3 på REG4
promotor i GC cellelinjer, chip assays blev udført. I MKN-1 og MKN-28 cellelinjer, H3K27me3 niveauer på REG4
promotor-regionen var høje, mens der i HSC-39 cellelinie, H3K27me3 niveau på REG4
promotor-regionen var lav (fig. 3C). Disse resultater tyder på, at lukkede kromatin struktur REG4
promotor kan hæmme Reg IV udtryk ved CDX2.

Diskussion

Selv om det er blevet rapporteret, at Reg IV ekspression induceres af GLI1 [21] eller EGF [22], disse molekyler er usandsynligt at forklare sammenhængen mellem Reg IV og intestinal differentiering. I den foreliggende undersøgelse viste vi at endogen CDX2 og Reg IV ekspression var godt korreleret i GC cellelinier. Desuden, ved hjælp af en ER-regulerede form for CDX2, fandt vi, at der var hurtig induktion af Reg IV ekspression efter 4-OHT-behandling. Reportergenassays afslørede en vigtig rolle for konsensus CDX2 DNA bindende elementer i REG4
promoter region i sin transskription. Efterfølgende chip assays viste, at CDX2 binder direkte til REG4
promotor. Vi har tidligere vist, at i primær GC væv og intestinal metaplasi af maven, CDX2 og Reg IV ekspression var godt korreleret [11]. Disse resultater indikerer, at CDX2 protein direkte regulerer Reg IV ekspression i GC og intestinal metaplasi af maven.

CDX2 overudtrykkes i intestinal fænotype GC og i intestinal metaplasi af maven [9], [25]. I modsætning hertil blev der tab af CDX2 udtryk observeret i en delmængde af primær kolorektal kræft, som regel i dårligt differentierede kolorektal kræft [30]. Betydningen af ​​ændringen af ​​CDX2 ekspression i humane cancere er fortsat uklart, og derfor er det vigtigt at definere de målgener, som er nedstrøms for CDX2. Vi har identificeret flere CDX2-regulerede gener såsom CDH17
(som koder LI-cadherin) [24], HEPH
(som koder hephaestin) [31], ABCB1
(som koder multiresistens 1) [32], og DSC2
(som koder desmocollin 2) [33]. Blandt disse gener, ABCB1
blev oprindeligt identificeret som et overudtrykt og amplificeret gen i multiple lægemiddelresistente celler, og dets produkt, P-glycoprotein, synes at spille en kritisk rolle i lægemiddelresistens [34]. Tidligere rapporterede vi, at tvungen ekspression af Reg IV i GC-celler hæmmede 5-FU-induceret apoptose ved induktion af Bcl-2 og dihydropyrimidindehydrogenase [8]. Tilsammen er det muligt, i intestinal fænotype GC, ekspression (eller ektopisk ekspression) af CDX2 inducerer Reg IV og multilægemiddelresistens 1-ekspression, hvilket resulterer i en stigning i lægemiddel-resistens. Faktisk er det blevet rapporteret, at postoperativ kemoterapi ikke er fordelagtig for patienter med intestinal fænotype GC [35].

Selvom vores data understøtter den opfattelse, at CDX2 spiller en rolle i reguleringen REG4
transkription via binding til promotorområdet flere resultater viser, at CDX2 alene ikke er tilstrækkelig til at aktivere REG4
udtryk. I den foreliggende undersøgelse, genereret vi et polyklonalt population af MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, og KATO-III-celler, som udtrykker høje niveauer af CDX2 af infektion med retrovira, der bærer et uforkortet human CDX2 cDNA. Imidlertid overekspression af CDX2 undladt at aktivere Reg IV ekspression. I GC cellelinjer, ingen af ​​cellelinjer med målbart CDX2 proteinekspression havde påviselige REG4
udskrifter og protein. Derfor er CDX2 kræves til Reg IV ekspression, men CDX2 alene ikke tilstrækkelig til at aktivere Reg IV ekspression. I den foreliggende undersøgelse blev ni GC cellelinier undersøgt. Oprindelsen af ​​cellelinjer var som følger. Den MKN-7, MKN-28, og MKN-74 cellelinier blev etableret fra intestinal typen GC. De TMK-1 og MKN-45 cellelinjer blev etableret fra diffuse typen GC. Den KATO-III, HSC-39, og HSC-44PE cellelinjer blev etableret fra signetring celle karcinom. Den MKN-1-cellelinjen blev etableret fra adenosquamøst cellecarcinom. Fordi der i intestinal metaplasi i maven, er CDX2 og Reg IV udtryk godt korreleret, kan GC cellelinjer etableret fra diffuse typen GC eller signetring celle karcinom ikke være egnet til analyse af Reg IV induktion ved CDX2. Faktisk kan Reg IV ekspression induceres af CDX2 i cellelinjer afledt fra coloncancer i den foreliggende undersøgelse. Desuden viste vi, at H3K27me3 niveauer på REG4
promotor-regionen var høje i MKN-1 og MKN-28 GC cellelinjer. Disse 2 cellelinier manglede detekterbar ekspression af REG4
selvom CDX2 proteinekspression blev fundet. Derfor H3K27me3 niveauer på REG4
promoter region kan være høj i MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, og KATO-III celler, hvor overekspression af CDX2 undladt at aktivere Reg IV udtryk.

det er blevet rapporteret, at REG4
mRNA-ekspression blev styrket ved stimulering med TGF-α, EGF, HGF, eller bFGF gennem aktivering af mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) pathway [22] . Således kunne det antages, at Reg IV også reguleres af nedstrøms transkriptionelle faktorer af MAPK pathways. Vi udførte i silico
analyser af REG4
gen 5'-flankerende region, og fundet mindst én formodede AP-1 konsensus sekvenser (ved -883 basepar af REG4
gen 5'-flankerende region), som er en nedstrøms transkriptionel faktor på MAPK signalering. I den foreliggende undersøgelse viste HSC-39 celler tilsvarende transkriptionsaktivitet reportergenkonstruktioner indeholdende 1,2 kb og 0,6 kb af REG4
5'-flankerende sekvens. Da effekten af ​​EGF eller TGF-α på REG4
transskription blev ikke undersøgt i nærværende undersøgelse, yderligere undersøgelser for at klarlægge de signalsystemer mekanismer som inducerer regulering af REG4
transskription.

som konklusion vores nuværende data viser, at CDX2 protein direkte regulerer Reg IV udtryk. Reg IV aktiverer EGFR /Akt /AP-1-signalering pathway. Som intestinal fænotype GC ofte udtrykker EGFR [36], foreslås det, at denne Reg IV-aktiveret pathway spiller en vigtig rolle i denne undertype af GC. Fordi CDX2 også inducerer ekspressionen af ​​multiresistens genet, ABCB1
, anti-EGFR behandling, men ikke kemoterapi kan være gavnligt for patienter med tarm fænotype GC.

Materialer og metoder

Plasmider

CDX2 cDNA blev indsat i det multiple kloningssted i den retrovirale ekspressionsvektor pPGS-CMV-CITE-neo som tidligere [24] beskrevne. Fuldlængde, vildtype CDX2 cDNA blev også subklonet i den retrovirale vektor pBabe-Puro ER som tidligere beskrevet til frembringelse pCDX2-ER [24]. Den pCDX2-ER vektoren koder et kimært protein, hvori fuld længde CDX2 sekvenser fusioneres opstrøms for et muteret ER ligandbindende domæne. Det muterede ER ligandbindende domæne ikke længere binder østrogen, men bibeholder evnen til at binde tamoxifen. Genomiske DNA-sekvenser fra 5'-flankerende region af det humane REG4
genet, blev amplificeret ved PCR under anvendelse af genomisk DNA oprenset fra HSC-39 celler som en skabelon og subklonet i pGL4.10 [luc2] vektor (Promega , Madison, WI). PCR-baserede fremgangsmåder blev anvendt til at indføre mutationer i de formodede CDX2-bindingssteder i pGL4.10-REG4 reportergenkonstruktion vha QuikChange steddirigeret mutagenese kit (Stratagene, La Jolla, CA). Fire formodede CDX2-bindingssteder blev ændret. Alle fragmenter dannet ved PCR blev bekræftet ved automatiseret sekventering. Plasmidet pGL4.74 [hRluc /TK] vektor (Promega) blev anvendt som en kontrol for transfektionseffektivitet i reporter analyser.

cellelinier, retrovirusinfektioner, and Drug Treatment

amfotrope Phoenix pakkecellelinie blev leveret af G. Nolan (Stanford University, Stanford, CA) [37]. Ni cellelinier afledt fra human GC og 2 cellelinjer afledt fra human coloncancer, blev anvendt. TMK-1-cellelinjen blev etableret i vores laboratorium [38]. HSC-39 og HSC-44PE cellelinjer blev oprettet af en af ​​forfatterne (Kazuyoshi Yanagihara) [39], [40]. Fem GC cellelinier af den MKN serien blev venligst stillet til rådighed af Dr. Toshimitsu Suzuki [41], [42]. KATO-III-cellelinien blev venligst stillet til rådighed af Dr. Morimasa Sekiguchi [43]. HT-29 og SW480 tyktarmskræft cellelinjer blev opnået fra American Type Culture Collection. Celler blev opbevaret i flydende nitrogen, indtil indledningen af ​​denne undersøgelse. Efter optøning af frossen bestand blev cellerne holdt ved lav passage gennem hele undersøgelsen. Konsekvent cellemorfologi blev overvåget ved sammenligning af mikroskopiske billeder. Phoenix emballage celler blev transficeret med retrovirale ekspressionskonstruktioner (pPGS-CDX2, pPGS-neo, og pCDX2-ER), og supernatanten indeholdende ikke-replikerende amfotropisk virus blev høstet som beskrevet tidligere [24]. I HT-29 celler, der udtrykker CDX2-ER-fusionsprotein (HT-29 /CDX2-ER), blev CDX2 funktion aktiveret ved tilsætning af 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) (Sigma Chemical, St. Louis, MO) til vækst medium ved en slutkoncentration på 500 nmol. For at undersøge om DNA-methylering induceret transkriptionel inaktivering af Reg IV blev celler behandlet med en slutkoncentration på 1 uM aza-dC (Sigma Chemical) i 5 dage, før de blev høstet til RNA-ekstraktion.

Western blot-analyse

Til Western blot-analyse blev celler lyseret som tidligere [44] beskrevne. Proteinkoncentrationer blev bestemt ved Bradford-proteinassay (BioRad, Richmond, CA) med BSA som standard. Lysaterne (20 ug) blev solubiliseret i Laemmlis prøvebuffer ved kogning og derefter underkastet 12% SDS-polyacrylamidgelelektroforese efterfulgt af elektro-overførsel på et nitrocellulosefilter. Filteret blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med et anti-Reg IV antistof (kanin polyklonale antistof udviklet i vores laboratorium, Ref. 10) eller anti-CDX2 antistof (Biogenex, San Ramon, CA). Peroxidase-konjugeret anti-kanin eller anti-mus IgG anvendtes i den sekundære reaktion. Immunkomplekser blev visualiseret med en ECL Plus Western Blot Detection System (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). β-actin (Sigma Chemical) blev også påvist som en loading kontrol.

QRT-PCR-analyse

Totalt RNA blev ekstraheret med et RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA), og 1 ug totalt RNA blev omdannet til cDNA med en første streng cDNA Synthesis Kit (Amersham Biosciences). Kvantificering af REG4
mRNA-niveauer blev udført af real-time-fluorescens detektion som tidligere [45] beskrevet. PCR blev udført med et SYBR Green PCR Core Reagents Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Real-time detektion af emissionsintensitet SYBR green bundet til dobbeltstrenget DNA blev udført med et ABI PRISM 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems) som beskrevet tidligere [46]. ACTB
-specifikke PCR-produkter blev amplificeret fra de samme RNA-prøver og tjente som en intern kontrol. Sekvenser af primere til REG4
QRT-PCR er vist i tabel 1. QRT-PCR'er blev udført tre gange for hver prøve primersæt, og middelværdien og standardafvigelsen (SD) af de tre eksperimenter blev beregnet som relativ kvantificering værdi. I slutningen af ​​40 PCR-cykler blev reaktionsprodukter separeret elektroforetisk på 8% ikke-denaturerende polyacrylamidgeler for visuel bekræftelse af PCR-produkter.

RNAi

For at knockdown den endogene CDX2, RNAi blev udført . To siRNA-duplexer målretning CDX2 (5'-AACCAGGACGAAAGACAAAUA-3 ', CDX2 siRNA1, og 5'-AAGCCUCAGUGUCUGGCUCUG-3', CDX2 siRNA2) og en nonsilencing siRNA duplex (5'-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3 ') blev syntetiseret (Qiagen). Transfektion blev udført ved anvendelse af Lipofectamin RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge fabrikantens protokol. Kort fortalt blev 60 pmol siRNA og 10 pi Lipofectamine RNAiMAX blandes i 1 ml RPMI-medium (10 nmol /l endelig siRNA koncentration). Efter 20 minutters inkubation blev blandingen tilsat til cellerne, og disse blev udpladet på skåle for hvert assay. Tre dage efter transfektion blev cellerne analyseret for alle forsøg.

reportergenassays Salg

HSC-39 og MKN-1-celler blev podet i 6-brønds plader (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ ). Transfektion af celler ved 50% -80% konfluens blev udført med 3 pi FuGENE6 transfektionsreagens (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), 0,8 ug pGL4.10 reporter genkonstruktioner, og 0,2 ug pGL4.74 [hRluc /TK] vektor (Promega). 48 timer efter transfektion blev celler opsamlet og resuspenderet i passiv lysepuffer (Promega). Luciferaseaktivitet blev bestemt med en dobbelt luciferaseassaykit systemet (GloMax 96 Microplate Luminometer, Promega).

chip assays

De chip assays blev udført ved hjælp af EZ-chip chromatin Immunfældning Kit (Millipore, Billerica , MA) pr fremstilling anvisninger. For at analysere, om CDX2 direkte binder sig til de formodede CDX2-bindende steder i REG4
5'-flankerende region, vi udførte chip assays hjælp HSC-39 celler. Kort fortalt, HSC-39-celler (1-2 x 10 ^{7) var tværbundet med 1% formaldehyd i phosphatpufret saltvand (PBS) i 15 minutter ved 37 ° C, og glycin blev tilsat for at standse reaktive aldehyder. Efter vask cellerne med kold PBS, cellerne blev resuspenderet i SDS-lysepuffer (1% SDS, 10 mM EDTA og 50 mM Tris pH 8,1) med proteinaseinhibitor (Roche Diagnostics). Efter prøver blev sonikeret, blev kromatin ekstrakter indeholdende DNA fragmenter (gennemsnitlig størrelse, 500 basepar) immunpræcipiteret under anvendelse af 2 ug monoklonalt anti-CDX2 antistof (Biogenex) eller 2 ug muse-IgG (Millipore). Hver immunopræcipiterede DNA-prøve blev kvantificeret ved qPCR anvendelse af primere, der er opført i tabel 1. Som en negativ kontrol, en cirka 200 basepar DNA-fragment fra exon 3 i CDX1
genet blev amplificeret ved PCR under anvendelse af specifikke primere (Tabel 1 ).}

for at bestemme berigelsen af ​​H3K27me3 på REG4
promotor i GC cellelinjer, chip assays blev udført ved hjælp af MKN-1, MKN-28 og HSC-39 cellelinjer. I korte, GC-celler (1-2 x 10 ^{7) var tværbundet med 1% formaldehyd i PBS i 15 minutter ved 37 ° C, og glycin blev tilsat for at standse reaktive aldehyder. Efter vask cellerne med kold PBS blev celler resuspenderet i SDS lysis buffer med proteinaseinhibitor (Roche Diagnostics). Efter prøver blev sonikeret, blev kromatin ekstrakter indeholdende DNA fragmenter (gennemsnitlig størrelse, 500 basepar) immunopræcipiteret med 2 ug polyklonalt anti-H3K27me3 antistof (Abcam, Cambridge, MA) eller 2 ug kanin IgG (Millipore). Hver immunopræcipiterede DNA-prøve blev kvantificeret ved qPCR bruge REG4
Primer 1 (tabel 1).}

qPCRs blev udført i tre eksemplarer for hver prøve primer sæt, og middelværdien og standardafvigelsen (SD) af de tre eksperimenter blev beregnet som den relative kvantificering værdi. I slutningen af ​​40 PCR-cykler blev reaktionsprodukter separeret elektroforetisk på 8% ikke-denaturerende polyacrylamidgeler for visuel bekræftelse af PCR-produkter.

Tak

Vi takker hr Shinichi Norimura for fremragende teknisk bistand og rådgivning. Dette arbejde blev udført med den slags samarbejde med Forskningscenter for Molekylær Medicin, Faculty of Medicine, Hiroshima Universitet. Vi takker Analysis Center of Life Science, Hiroshima Universitet, til brug for deres faciliteter.

• PLoS ONE: RhoC Regulerer spredning af mavekræft celler gennem Interaktion med IQGAP1
• PLoS ONE: Differential Expression of Phospholipase C Epsilon 1 er associeret med kronisk atrofisk gastritis og Gastric Cancer