Abstrakt
I en tid med målrettede terapi, mutation profilering af kræft er et afgørende aspekt af at gøre terapeutiske beslutninger . Til karakterisering cancer på et molekylært niveau, anvendelse af formalin-fikseret paraffinindlejret væv er vigtig. Vi testede Ion AmpliSeq Cancer Hotspot Panel v2 og NCounter Copy Number Variation Assay i 89 formalinfikserede paraffinindlejrede mavekræft prøver at afgøre, om de gælder i arkivering kliniske prøver til personlig målrettede behandlinger. Vi valideret resultaterne med Sanger-sekventering, real-time kvantitativ PCR, fluorescens in situ hybridisering og immunhistokemi. Ofte opdages somatiske mutationer inkluderet TP53 Henvisning:. Kim S, Lee J, Hong mig, IG, Kang SY, Ha SY, et al. (2014) High-Throughput sekventering og Kopier nummer Variation Detection Brug Formalin Fixed Embedded Tissue i metastatisk gastrisk kræft. PLoS ONE 9 (11): e111693. doi: 10,1371 /journal.pone.0111693 Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan Modtaget: April 28, 2014 Accepteret: September 29, 2014; Udgivet: 5. november 2014 Copyright: © 2014 Kim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af en bevilling fra Korea Healthcare Technology R & D Project, Ministeriet for Sundhed & Welfare anliggender, Republikken Korea (A101130) og en Samsung Biomedical Research Institute tilskud (# SBRI-SP1B20112). Denne undersøgelse blev også støttet af en Samsung Medical Center intramuralt tilskud, 20 x 20 Project (# GFO1140111). Medforfattere Seokhwi Kim, Jeeyun Lee, Min Eui Hong, In-Gu gøre, så Young Kang, Sang Yun Ha, Seung Tae Kim, Se Hoon Park, Won Ki Kang, Min-Gew Choi jun Ho Lee, Tae Sung Sohn , Jae Moon Bae, Sung Kim og Kyoung-Mee Kim er ansat af Samsung Medical center. Medforfatter Duk-Hwan Kim er ansat af Samsung Biomedical Research Institute. Samsung Biomedical Research Institute og Samsung Medical Center ydet støtte i form af lønninger til forfatterne Seokhwi Kim, JL, meh, IgD, SYK, SYH, STK, SHP, WKK, MGC, JHL, TSS, JMB, Sung Kim, KMK og DHK , men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. De specifikke roller disse forfattere er formuleret i »forfatter bidrag« sektion Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser: Denne undersøgelse blev finansieret delvist af Samsung Biomedical Research Institute og Samsung Medical Center. Medforfattere Seokhwi Kim, Jeeyun Lee, Min Eui Hong, In-Gu gøre, så Young Kang, Sang Yun Ha, Seung Tae Kim, Se Hoon Park, Won Ki Kang, Min-Gew Choi, Jun Ho Lee, Tae Sung Sohn , Jae Moon Bae, Sung Kim og Kyoung-Mee Kim er ansat af Samsung Medical center. Medforfatter Duk-Hwan Kim er ansat af Samsung Biomedical Research Institute. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer. Mens mavekræft er den fjerde mest almindelige kræftform i verden, det er den anden hyppigste dødsårsag. [1] Dens forekomst er betydeligt højere i de asiatiske lande, herunder Korea, hvor det er den anden mest almindelige kræftform. [2] For nylig har flere målrettede lægemidler til mavekræft blevet opdaget, som giver yderligere muligheder for læger og patienter [3] - [5] I en tid med målrettede terapi, mutation profilering af sygdomsfremkaldende kræft. er afgørende for terapeutiske afgørelser. Forsøg på at profilere mutationer er blevet gjort ved hjælp af traditionel Sanger sekventering; det er imidlertid ikke en optimal metode i kliniske omgivelser som følge af omkostninger, tid og arbejde, som kræves. Desuden Sanger-sekventering kræver betydelige mængder DNA; evaluere små mængder prøvemateriale i flere gener på samme tid er ikke mulig. Indførelse af næste generations sekventering (NGS) metoder har løst dette problem ved multiplex, high-throughput sekventering af mange prøver til flere gener samtidigt. [6], [7] En af NGS platforme Ion Torrent AmpliSeq Cancer Panel, afhængig af ikke-optiske detektering af hydrogenioner i en halvleder-enhed [8], og er i stand til at opdage 2.855 onkogene mutationer i 50 almindeligt muterede gener (tabel S1). Det er bedre end andre massespektroskopi-baserede sekventeringsmetoder, tilvejebringelse sekventering resultater hurtigere og med lavere omkostninger. [8] Den finder anvendelse i formalin-fikserede paraffin-indlejrede (FFPE) vævsprøver med små mængder DNA. Fordi det sikrer høj følsomhed i screening kendt onkogene mutationer, [9], [10] Ion Torrent AmpliSeq Cancer Panel er valget af 5 store kræftcentre i USA for molekylær diagnostik i målrettet terapi [11]. Amplifikation af onkogener er en vigtig mekanisme til gen overekspression og bidrager til tumorudvikling. [12] Som eksempler kan nævnes forstærkning af HER2 bedre skræddersyet kræftbehandling kan forbedre patientens udfald. Patient tumorprøver vil være påkrævet for at karakterisere kræft på et molekylært niveau og identificere sygdommen undergrupper, der skal modtage forskellige behandlinger. Brugen af FFPE væv er vigtige for at muliggøre sådanne undersøgelser. [16] Her testede vi AmpliSeq og NCounter brugerdefinerede CNV-paneler i FFPE gastrisk kræft prøver at afgøre, om de gælder i arkivering kliniske prøver til personlig målrettede behandlinger. prøver Tumor celleprocenten med mere end 75% blev dissekeret under mikroskopi fra 4 mm ufarvede sektioner ved sammenligning med en H &E-farvede objektglas, og genomisk DNA blev ekstraheret ved hjælp af et Qiagen DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktioner fra 96 patienter med fremskreden gastrisk cancer. Efter ekstraktion, vi målte koncentration samt 260/280 og 260/230 nm ratio med spektrofotometer (ND1000, NanoDrop Technologies, ThermoFisher Scientific, MA, USA). Hver prøve blev derefter kvantificeret med qubit'en fluorometer (Life Technologies, Carlsbad, California). Genomisk DNA med > 10 ng målt ved qubit fluorometer blev udsat for biblioteket forberedelse og syv prøver undladt at konstruere biblioteker og blev udelukket fra denne undersøgelse. Endelig blev 89 sager endeligt analyseret og omfattede 31 kvindelige og 58 mandlige patienter. Tabel 1 viser de kliniske og patologiske træk ved de patienter i dette studie. Gentagelse eller metastase udviklet i 11 patienter med median follow-up periode på 76 måneder (spændvidde 5,5-149,3). Undersøgelsen blev godkendt af den institutionelle Review Board (IRB) på Samsung Medical Center. Alle kliniske undersøgelse blev udført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen. Den skriftlige informerede samtykke blev givet afkald af IRB grundet retrospektiv analyse og anonyme data. Prøver blev indsamlet som en del af en rutinemæssig medicinsk procedure og blev opsamlet ved forfatterne til denne undersøgelse. Prøver fra afdøde patienter eller levende patienter blev alle de-identificeret, herunder fjernelse af enhver og alle demografiske informationer, før analyse og informeret samtykkeerklæring blev fastsat af IRB. Vi brugte Ion AmpliSeq Cancer Panel v2 (Ion Torrent) at opdage hyppige somatiske mutationer, der blev udvalgt på grundlag af litteraturgennemgang. Den undersøger 2855 mutationer i 50 almindeligt muterede onkogener og tumorsuppressorgener (tabel S1). Først 10 ng DNA fra hver af 89 FFPE tumorprøver undergik enkelt-rør, multiplex-PCR-amplifikation ved anvendelse af Ion AmpliSeqCancer Primer Pool og Ion AmpliSeqKit reagenser (Life Technologies). Behandling af de resulterende amplikoner med FUPA Reagent delvist fordøjet primerne og phosphorylerede amplikonerne. Det phosphorylerede amplikoner blev ligeret til Ion adaptere og renset. For barcoded bibliotek forberedelse, vi erstattet stregkodede adaptere fra Ion Xpress Barcode adaptere 1-96 Kit til ikke-barcoded adapter mix leveres i Ion AmpliSeq Library Kit. Den ligeret DNA undergik nick-translation og forstærkning for at fuldføre forbindelsen mellem adaptere og amplikoner og skabe tilstrækkeligt materiale til nedstrøms skabelon forberedelse. To runder af Agencourt AMPure XP Reagent bindende 0.6 og 1.2 volumen nøgletal perle-til-prøve fjernet input DNA og ikke-inkorporerede primere fra amplikoner. De endelige bibliotek molekyler var 125~300 bp i størrelse. Vi overført derefter bibliotekerne til Ion OneTouch System til automatiseret skabelon forberedelse. Sekventering blev udført på Ion PGM sequencer ifølge producentens anvisninger. Vi brugte IonTorrent Software til automatiseret analyse af data. For at måle følsomheden og specificiteten af Ion AmpliSeq kræft panel, hele exome sekventering resultater fra 4 gastriske prøver kræft med kendt mutation status blev brugt [17]. NCounter Copy Number variation kodesæt til påvisning af CNV, NCounter Copy Number variation kodesæt blev brugt med 300 ng renset genomisk DNA ekstraheret fra 2-3 sektioner af 4-um-tykke FFPE repræsentant tumorblokke hjælp QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). DNA blev fragmenteret via AluI fordøjelse og denatureret ved 95 ° C. Fragmenteret DNA blev hybridiseret med kodesættet af 86 gener i NCounter Cancer CN Assay Kit (Nanostring Technologies) i 18 timer ved 65 ° C og bearbejdet i overensstemmelse med producentens anvisninger. Den NCounter Digital Analyzer tælles og tabelform signalerne fra reporter sonder og gennemsnitlige tæller antal > 3 blev kaldt og bekræftet af IHC, FISH eller real-time PCR IHC for HER2, EGFR (HER1) og CCNE1. til validering af CNV resultater opnået fra NCounter, vi spillede IHC for HER2 i alle tilfælde, og EGFR og CCNE1 i udvalgte tilfælde. Efter afparaffinering og rehydrering, blev 4 sektioner mm på silan-coatede objektglas immunfarvet for HER2. Den HercepTest (Dako, Glostrup, Danmark) blev anvendt ifølge producentens vejledning som tidligere beskrevet. [18] For EGFR brugte vi anti-NCL-L-EGFR-384 mus monoklonalt primært antistof (1:100 fortynding Novocastra /Vision Biosystems, Newcastle, UK) og for CCNE1 vi brugte anti-CCNE1 /Cyclin E1 antistof (klon HE12; 1:200 fortynding Thermo Fisher Scientific, MA). Ventana BenchMark XT automatiseret slide-system blev anvendt ifølge producentens protokol. En ekspert patolog (KMK) evalueret resultaterne FISH for HER2 FISH blev udført ved hjælp af dual-farve DNA-specifikke prober fra PathVision ™ (Abbott /Vysis:. LSI HER2 SpectrumOrange ™ og CEP 17 SpectrumGreen ™) som tidligere beskrevet i tilfælde med tvetydige HER2 overekspression. [19] Vi tælles hybridiseringssignalerne i 20 kerner per prøve under et fluorescensmikroskop (Zeiss Axioskop) under anvendelse filtersæt anbefalet af Vysis (DAPI /Spectrum Orange dual bandpass, DAPI /Spectrum Green dual bandpass). Alle overlappende kerner blev udelukket, og kun kerner med en tydelig nukleare grænse blev evalueret. HER2 Vi brugte DNA opnået fra FFPE gastrisk karcinom tumorvæv. Reaktionsblandingen indeholdt 2 pi genomisk DNA-template, 10 pi Taqman universal PCR Master-blanding (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA) og 0,2 uM af hver primer. For nøjagtig detektering af KN ændringer, vi analyserede tre forskellige regioner i KRAS Vi målte kopiantal forstærkning ved hjælp af følgende profil: 2 minutter ved 50 ° C, denaturering ved 95 ° C i 10 min, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 sek og 60 ° C i 1 min. Vi bestemt relativ kvantificering ved hjælp af 7900 HT hurtig real-time PCR-system i fire eksemplarer. En RNaseP assaykit (Applied Biosystems) blev anvendt som kontrol. Efter forstærkning, importerede vi eksperimentets resultater, der indeholder tærskel-cyklus værdier for antal kopier og reference assay i CopyCaller Software (Applied Biosystems) for post-PCR dataanalyse som tidligere beskrevet. [22] Vi tildelt KN gain status og antallet af KRAS Vi udelukkede alle synonyme ændringer efter en automatiseret mutation-ringer algoritme blev anvendt til at påvise formodede mutationer. Tilbagevendende opkald i mere end 10 af 89 prøver blev anset for falsk positive og blev udelukket. Vi brugte cutoff værdier på mere end 6% variant frekvens og mere end X100 dækning til at opdage sande mutationsmønstre ændringer i overensstemmelse med tidligere undersøgelser og vores egne erfaringer. [9], [10] Vi filtreret ud enkelt nukleotid polymorfier efter manuel gennemgang af hver polymorfi i Katalog over somatiske mutationer i Cancer (COSMIC, http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic) ( Figur 1). For kendte gener muteret i gastriske carcinomer ( TP53 Resultater Resultater af Ion AmpliSeq kræft panel koncentrationerne af DNA, deres koncentration fold, gennemsnitlig dækning af prøverne, samlede antal baser, > Q20 baser, læser, betyder læse længde, kortlagt læser, on target rate (%), betyder dybde og ensartethed af resultaterne er beskrevet i tabel S2. I alt opnåede vi 8178 variant opkald fra 89 prøver, blandt dem 3554 opkald var ikke-synonyme ændringer. Efter at filtrere tilbagevendende opkald, < 6% af variant-allel frekvens, < 100X dækning og de i intron region, blev udvalgt 65 variant opkald. Desuden har vi revideret de automatiske opkald i kendte mutationer, såsom BRAF I fire gastriske prøver kræft med kendte mutation frekvenser bestemt af hele exome sekventering og bekræftet af Sanger sekventering identificerede vi somatiske mutationer i TP53 Forstærkning af NCounter og validering af IHC, FISH eller real-time PCR Amplifikationer af HER2 I real-time PCR for KRAS For MET diskussion Ved at bruge Ion AmpliSeq v2 fandt vi, at 39 ud af 89 avancerede gastrisk adenocarcinom prøverne indeholdt somatiske mutationer, hvilket viser, at denne platform er let anvendelig i arkivering FFPE vævsprøver. TP53 mutationsmønstre frekvenser i COSMIC database vise betydelige ligheder med de data, vi fra denne undersøgelse:. TP53 Hotel (32%), PIK3CA Hotel (10%), KRAS Hotel (6%), APC Hotel (6%), CTNNB1 Hotel (5%), CDKN2A Hotel (5%), FBXW7 Hotel (5%), SMO Hotel (4%), ERBB2 Hotel (2%) og STK11 Semiconductor-baserede sekventering har grundlæggende forskelle i sensing og signaltransduktion sammenlignet med massespektrometri -baseret sekventering. I stedet for anvendelse af optiske metoder til påvisning af nukleotidændringer, halvleder-baserede teknik registrerer pH-ændringer ved frigivelse af protoner (H +), når nukleotider integrere i den voksende DNA-strengen. [8] Der er derfor en betydelig reduktion i omkostningerne og den tid, der kræves til databehandling sammenlignet med andre NGS platforme. Giver hurtig og præcis information om mutationer ved lav pris er afgørende for patienter med meget aggressive kræftformer, herunder mavekræft. I denne undersøgelse har vi manuelt revideret de automatiske opkald i kendte mutationer efter anvendelse cutoff værdier af frekvens og dækning, efterfølgende tilføje to opkald med lav-varianten dækning. Selv om deres dækning værdier ikke nåede vores indledende kriterier, deres frekvenser overskredet vores første indstilling (6%) og kvaliteten af de data, var god. Dette understreger vigtigheden af manuel gennemgang efter automatiseret screening. Nyligt offentliggjorte resultater ved hjælp AmpliSeq som det analyserende platform understreger også kompensation for screening data med manuel gennemgang [9], [10]. Personlig målrettet terapi for fremskredne kræftformer primært baseret på begrebet "onkogen afhængighed," i hvilken flere genetiske abnormiteter er afhængige af en eller få gener til tumorceller vedligeholdelse og overlevelse. [28] Et åbent, internationalt, fase 3, randomiseret, kontrolleret ToGA (Trastuzumab for mavekræft) forsøg viste, at trastuzumab i kombination med kemoterapi er en ny standard for patienter med HER2-positiv fremskreden gastrisk eller gastro-øsofageal junction kræft. [29] En præklinisk forsøg viste, at en delmængde af gastrisk kræft med EGFR Sammenfattende vi med succes udført halvleder-baserede sekventering og NCounter CNV analyser i FFPE vævsprøver fra 89 gastrisk adenokarcinomer. High-throughput sekventering og CNV screening i arkivering kliniske prøver muliggør hurtigere, mere præcis og omkostningseffektiv påvisning af hotspot mutationer og CNV i gener. I en tid med personlig genomisk medicin, planlægger vi at bruge disse værktøjer til at screene for gastrisk kræftpatienter, der kan have gavn af målrettede behandlinger.
(28,17%), APC
(10,1%), PIK3CA
(5,6%), KRAS
(4,5 %), SMO
(3,4%), STK11
(3,4%), CDKN2A
(3,4%) og Smad4 Hotel (3,4%) . Amplifikationer af HER2
, CCNE1
, MYC
, KRAS
blev observeret EGFR
gener i 8 (8,9%) , 4 (4,5%), 2 (2,2%), 1 (1,1%) og 1 (1,1%) tilfælde hhv. I de tilfælde med amplifikation, fluorescens in situ hybridisering til HER2
verificeret genamplifikation og immunhistokemi for HER2, EGFR og CCNE1 verificeret overekspressionen af proteiner i tumorceller. Afslutningsvis vi med succes udført halvleder-baserede sekventering og NCounter kopital variation analyser i formalin-fikserede paraffin-indlejrede gastrisk cancer prøver. High-throughput screening i arkivering kliniske prøver giver mulighed for hurtigere, mere præcis og omkostningseffektiv påvisning af hotspot mutationer eller forstærkning i gener
Introduktion
, MET
, FGFR2
KRAS
gener i gastrisk kræft. [13], [14] I påvisning af kopi nummer variationer (CNVs) i kliniske prøver, fluorescens in situ hybridisering (FISH) og /eller immunhistokemi (IHC) har været meget anvendt. Men høje omkostninger og små prøver af biopsi materialer begrænser anvendelsen af disse metoder, og der er stadig et behov for yderligere high-throughput teknologi med let tilgængelighed, høj følsomhed og lave omkostninger. NCounter CNV kodesæt (Nanostring teknologier, Life Sciences, Seattle, WA) giver overlegen præcision og reproducerbarhed for studier af alle størrelser og producere bedre, hurtigere resultater med væsentligt mindre indsats end med real-time kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) eller CNV arrays [ ,,,0],15].
Materialer og metoder
Ion AmpliSeq kræft panel v2
genet blev anses forstærket, når FISH signal forholdet HER2 /CEP17
var større end eller lig med 2,0 [20].
Real-time PCR for KRAS og MET forstærkning
gen: en region i intron 1 (TaqMan Copy Number Assay Hs06943812_cn), en region i intron 2 (Hs002534878_cn), og en region i exon 6 (Hs02739788_cn). . For MET
genet, anvendte vi primerne som beskrevet tidligere [21]
kopier baseret på overensstemmelse mellem resultaterne i mindst to af de tre sonder.
Analysemetoder
, APC
, PIK3CA
, STK11
, CDKN2A
, KRAS
, HRAS
, BRAF
CTNNB1
), blev en manuel gennemgang af automatiserede opkaldsanordninger resultater udført for at fange skadelige mutationer med lidt lav- variant frekvens.
, KRAS
PIK3CA
og kunne spare to variant opkald, der blev udelukket under filtreringen processer. Tredive-ni af de 89 prøver (43,8%), indeholdt mindst en mutation (figur 1). To tilfælde viste 22 og 5 mutationer, hhv. Sidstnævnte tilfælde nærede MLH1
somatisk mutation [missense mutation i exon 20: c.1147A > G (p.M383 V)] og MLH1
promotor hypermethylering med MLH1 tab protein ved IHC hjælp af tidligere beskrevne fremgangsmåder [23], hvilket tyder hypermutated tumor. Selv om de mutationer fundet i det førstnævnte tilfælde øjeblikkeligt variant frekvens og dækning skåret offs, disse mutationer blev ikke bekræftet af Sanger-sekventering, hvilket tyder falsk positiv i dette tilfælde på grund af dårlig kvalitet af DNA. Så blev denne sag udelukket fra endelige analyser af resultaterne. Ofte opdages somatiske mutationer inkluderet TP53 Hotel (24 sager, 27,0%), APC Hotel (9 sager, 10,1%), PIK3CA Hotel (5 tilfælde, 5,6%), %), KRAS
(3 tilfælde, 3,4%), SMO Hotel (4 tilfælde, 4,5%), STK11 Hotel (3 tilfælde, 3,4%), CDKN2A
(3 tilfælde, 3,4%), og Smad4
(3 tilfælde, 3,4%) som vist i tabel 2. tabel 2 også samlet de aminosyreændringer i hyppigt muterede gener. Vi identificerede 19 patienter (21,3%) med to eller flere unikke og samtidige somatiske mutationer.
, ErbB4
CTNNB1
uden falsk-positive opkald i andre gener (tabel S3).
, CCNE1
, MYC
, KRAS
EGFR Salg gener blev observeret i 8 (8,9%), 4 (4,5%), 2 (2,2%), 1 (1,1%) og 1 (1,1%) tilfælde (tabel 3). Vi har ikke observere forstærkning af MET
, FGFR2
, CDK4
og CDK6 i nogen af tilfældene. I tilfælde med forstærkning, IHC for HER2, EGFR og CCNE1 viste overekspression af proteiner i tumorcellerne (figur 2A, B og C). I et tilfælde med HER2 2+ af HercepTest viste FISH heterogen forstærkning af HER2
gener (figur 2D).
, et tilfælde med amplifikation viste forøget kopiantal (36, 37 og 49); i sager, der var negative for KRAS
forstærkning, var der ingen stigning i kopi numre (0,9 til 2,4, betyder 1.4).
gen, finder vi ingen positive tilfælde på grund af deres sjældenhed [21]. Derfor brugte vi yderligere ti (fem hver forstærket og ikke-forstærkede) gastrisk kræft prøver og MET
forstærket gastrisk cancer cellelinjer (MKN45 og SNU5) med kendte kopi numre og mRNA beløb. CNVs opdaget af NCounter korrelerede godt med kopi-numre registreret af real-time PCR (tabel S4) og mRNA-niveauer af MET
gen (Pearsons korrelation test r = 0,874, p = 0,001). (Figur S2)
blev hyppigst fundet mutation, efterfulgt af APC
, PIK3CA
KRAS
. Desuden er vores custom CNV panel held opdaget KN stigninger i HER2
, CCNE1
, MYC
, EGFR
KRAS
gener, som vi bekræftet af IHC og real-time PCR
(2%). Nylige hele exome sekventering undersøgelser af gastrisk adenocarcinom viste noget højere frekvenser af TP53 Hotel (36% og 73%) og PIK3CA
(14% og 20%) mutationer i forhold til vores resultater. [24], [25] Selvom vores mutationsfrekvenser var lavere sammenlignet med exome sekventeringsresultaterne, var der en signifikant stigning i forhold til vores tidligere data om massespektrometri-baseret OncoMap v4. [26] Både AmpliSeq og OncoMap detektere mutationer i hotspot regioner, der forklarer resultaterne af mindre hyppig mutation i nogle onkogener og tumorsuppressorgener. Figur S1 sammenligner AmpliSeq v2 og OncoMap v4 i påviselige mutationsmønstre profiler. Tidligere OncoMap tests i 237 gastrisk adenokarcinomer afsløret, at PIK3CA
mutationer var hyppige i fremskredne stadier af sygdommen (5,1% i trin IV, 6,4% i fase II /III 2,4% i fase IB). [26] I denne undersøgelse observerede vi tre PIK3CA
mutationer hos patienter med stadium III og to i fase II-sygdom, der understøtter deres biologiske rolle i tumor progression. Vi har også observeret HER2 Hotel ( ERBB2
) c.2524G > A (V842I) mutation i et tilfælde af mavekræft. I prækliniske undersøgelser cellelinjer huser V842I mutationen var resistente over for trastuzumab, men var følsomme over for irreversibel HER2-inhibitor, neratinib [27].
eller MET
forstærkning og overekspression reagerer på cetuximab eller MET receptortyrosinkinase-hæmmer behandling. [30] Derudover amplifikationer af cellecyklus mediator CCNE1
tyder potentialet til terapeutisk inhibering af cyclinafhængige kinaser i gastriske cancere. [31] Screening opformerede gener til målrettet terapi med højt gennemløb teknologi er meget vigtigt. Traditionelle metoder såsom fisk og array komparativ genomisk hybridisering lider lav opløsning af genomiske regioner, høje omkostninger og er labora- og tidskrævende. [32] I denne første undersøgelse om NCounter CNV analyser, fandt vi, at denne teknologi kan anvendes i FFPE kliniske prøver og vi valideret resultaterne ved IHC, FISH og real-time PCR. Selvom vi ikke validere alle generne, der anvendes i de brugerdefinerede primere, valideringsresultater i flere udvalgte gener var bemærkelsesværdigt.
Støtte Information
Figur S1.
Sammenligning af dækningen af Ion AmpliSeq v2 kræft panel versus Oncomap v4
doi:. 10,1371 /journal.pone.0111693.s001
(TIF)
Figur S2.
Plots af korrelation mellem MET
CNVs detekteret af NCounter og mRNA-niveauer af MET
gen af real-time PCR
doi:. 10,1371 /journal.pone.0111693.s002 Hotel (TIF)
tabel S1.
Gene List for Ion Torrent AmpliSeq Cancer Panel
doi:. 10,1371 /journal.pone.0111693.s003
(XLS)
tabel S2.
Koncentrationerne af DNA, deres koncentration fold, gennemsnitlig dækning af prøverne, samlede antal baser, > Q20 baser, læser, betyder læse længde, kortlagt læser, on target rate (%), betyder dybde og ensartethed.
doi: 10,1371 /journal.pone.0111693.s004
(XLS)
tabel S3.
Somatiske mutationer i TP53
, ErbB4
CTNNB1
doi:. 10,1371 /journal.pone.0111693.s005
(XLS)
tabel S4.
CNVs opdaget af NCounter korrelerede godt med kopi-numre registreret af real-time PCR
doi:. 10,1371 /journal.pone.0111693.s006
(XLSX)
Mikrobiotamodulation og genetablering af eubiose kan hjælpe med at dæmme op for COVID-19-komplikationer
Coronavirussygdommen (COVID-19), forårsaget af det alvorlige akutte respiratoriske syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2), påvirker mange organer i kroppen. Bortset fra at være en luftvejssygdom, det kan
Forskning viser, at tarmparasitangreb reducerer sværhedsgraden af COVID-19
Vi lærer mere om COVID-19 sygdom hver dag. Voksne i alle aldre med visse underliggende medicinske tilstande har en øget risiko for alvorlig sygdom fra den virus, der forårsager COVID-19. COVID-19, f
Nyt værktøj registrerer og sporer mikrobiomvækst
I løbet af de sidste år har det menneskelige mikrobiom har vundet enorm popularitet på grund af dets rolle i at forme ens helbred. Det er afgørende for menneskelig udvikling, ernæring, og immunitet. D
