PLoS ONE: MicroRNA-149 Forhindrer spredning og cellecyklusprogression gennem målretning af ZBTB2 i Human Gastric Cancer

Abstrakt

Et stigende mængde af beviser tyder på, at miR-149 både kan undertrykke og fremme tumorvækst afhængigt tumor type. Imidlertid rolle MIR-149 i progressionen af ​​gastrisk cancer (GC) forbliver ukendt. Her rapporterer vi, at MIR-149 er en tumorsuppressor i human gastrisk cancer. MIR-149-ekspression er nedsat hos GC cellelinier og kliniske prøver i sammenligning med normal gastrisk epitelcelle og væv, henholdsvis. Ekspressionsniveauerne af MIR-149 korrelerer også med differentieringen grad af GC celler og væv. Desuden ektopisk udtryk for miR-149 i gastriske kræftceller hæmmer proliferation og cellecyklusprogression af nedregulere ZBTB2
, en potent repressor af ARF-HDM2-p53-p21 vej, med et potentielt bindingssted for mIR-149 i dets mRNA s 3'UTR. Det er også fundet, at ZBTB2 ekspression øges i GC celler og væv sammenlignet med normale gastrisk epitelcelle og væv, henholdsvis. Silencing af ZBTB2
fører til undertrykkelse af cellevækst og cellecyklusstop i G0 /G1 fasen, hvilket indikerer, at ZBTB2 kan fungere som et onkogen i GC. Desuden transfektion af miR-149 efterligner i gastriske kræftceller inducerer nedregulering af ZBTB2 og HDM2, og opregulering af ARF, p53, og p21 i forhold til kontrollerne. Sammenfattende vores data tyder på, at MIR-149 fungerer som en tumorsuppressor i human gastrisk cancer ved, i det mindste delvist gennem, målretning ZBTB2

Henvisning:. Wang Y, Zheng X, Zhang Z, Zhou, J., Zhao G, Yang J, et al. (2012) MicroRNA-149 Forhindrer spredning og cellecyklusprogression gennem målretning af ZBTB2
i Human Gastric Cancer. PLoS ONE 7 (10): e41693. doi: 10,1371 /journal.pone.0041693

Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA

Modtaget: Marts 13, 2012; Accepteret: 25 Juni 2012; Udgivet: 29 oktober, 2012 |

Copyright: © 2012 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr. 30.872.966 og nr. 31.071.135), National Natural Science Foundation of China (nr. 81.000.864, nr. 81.172.290, nr. 91.129.723, nr. 81.090.270, og nr. 81.090.273) , og den kinesiske Postdoc Science Foundation (nr. 20100471776). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft (GC) er en af ​​de mest almindelige kræftformer og hyppigste årsager til kræft død på verdensplan, især i det østlige Asien, ifølge den seneste globale estimering offentliggjort i 2011 [1]. Trods en bemærkelsesværdig nedgang i GC forekomst i de fleste dele af verden, er der stadig en stor byrde fra det store antal GC tilfælde og dødsfald på verdensplan. Den carcinogenese af GC er en meget kompliceret proces [2] - [5] involverer dysregulering af multiple gener [6] - [8], herunder onkogener [9] - [14] og tumorsuppressorer [15] - [18]. Men de molekylære mekanismer, der er nødvendige for GC udvikling og progression har brug for, for at blive undersøgt nærmere.

MikroRNA'er (miRNA) er en gruppe af endogent udtrykt, ikke-kodende små RNA (20-25 nukleotider i længde) er kendt for at negativt regulere genekspression ved at undertrykke translation eller nedsætte stabiliteten af ​​mRNA'er ved direkte binding til 3'-utranslaterede region (3'-UTR) af target mRNA'er [19], [20]. Akkumulerende beviser indikerer, at miRNA spiller en vigtig rolle i udvikling, stofskifte, proliferation, differentiering og apoptose. Desuden er afvigende post-transkriptionel regulering af mRNA'er af miRNA relateret til tumorigenese [21]. er blevet påvist unormal ekspression profiler af miRNA i forskellige typer af humane tumorer, herunder lunge [22], bryst [23], prostata [24], lever [25], colon [26], og gastrisk cancer [27]. Endvidere kan visse miRNA fungere som onkogener eller tumorsuppressorer ved at regulere ekspressionen af ​​målgener, som spiller vigtige roller i cellecyklusprogression, apoptose, eller proliferation. MIR-22 [28], MIR-101 [29], og MIR-7 [30] har alle vist sig at blive nedreguleret i tumorprøver og fungere som tumorsuppressorer; MIR-17 [31] og MIR-21 [32] har vist sig at være opreguleret i tumorprøver og fungere som onkogener. Disse undersøgelser indikerer, at dysregulering af miRNA ofte er involveret i carcinogenese og cancer progression.

Nylige undersøgelser har antydet, at MIR-149 kan spille en vigtig rolle i forskellige sygdomme, herunder udviklingen af ​​maligne tumorer. MIR-149 har vist sig at fungere som både en tumor suppressor [33] og et onkogen [34] i udviklingen af ​​multiple typer af faste tumorer. For eksempel tab af MIR-149 betyder større af funktion af nogle onkogener og korrelerer med tumorklassificering i renalcellecarcinom [35], astrocytomer [36], og prostatacarcinom [37]. Ektopisk ekspression af MIR-149 inducerer apoptose af neuroblastom og HeLa-celler [33]. Forhøjet ekspression af MIR-149 er blevet rapporteret at være vigtig i udviklingen af ​​nasopharyngeal carcinom [38] og melanom-metastase [34]. Endvidere er dysregulering af MIR-149 også impliceret i nogle ikke-neoplastiske sygdomme. For eksempel er nedregulering af MIR-149-ekspression er involveret i udviklingen af ​​primær myelofibrose, polycytæmi vera og essentiel thrombocythemi [39], og tabet af MIR-149 kan undertrykke hepatitis C-virus (HCV) RNA overflod [40]. Imidlertid ekspressionsmønsteret og rolle MIR-149 i udviklingen af ​​GC stadig uklar.

I den foreliggende undersøgelse, fandt vi, at MIR-149 er betydeligt nedreguleret i GC cellelinier og kliniske prøver sammenlignet med normal gastrisk epitelcelle og tilstødende ikke-tumorvæv, hhv. Ektopisk udtryk for miR-149 hæmmer proliferation og inducerer G0 /G1 anholdelse af AGS og SGC7901 celler in vitro
ved at målrette ZBTB2
. Desuden udtømning af ZBTB2
af siRNA resulterer i hæmning af spredning og cellecyklusstop. Ekspressionsmønsteret for MIR-149 og ZBTB2 i GC-cellelinjer og kliniske prøver blev omvendt korreleret, hvilket yderligere antyder, at ZBTB2
er et målgen af ​​MIR-149. Indførelse af miR-149 resultater i ændringer i ekspression af p53, p21, ARF, og HDM2, medlemmer af ARF-HDM2-p53-p21 pathway, som er reguleret af ZBTB2. Sammenfattende disse resultater bekræfter, at MIR-149 nedreguleres i GC-celler og kliniske prøver og foreslå, at MIR-149 fungerer som en undertrykker af gastrisk vækst cancercelle ved at inhibere proliferation og cellecyklusprogression.

Resultater

Angivelse af miR-149 nedreguleres i GC cellelinier og kliniske prøver

for at vurdere betydningen af ​​miR-149 i carcinogenese af GC, vi først brugt kvantitativ RT-PCR til at måle ekspressionen af mIR-149 i humane GC cellelinier (MKN45, GC9811, AGS, SGC7901, og MKN28) og fandt, at mIR-149 blev nedreguleret i GC cellelinjer sammenlignet med en normal gastrisk epitelcellelinje, GES-1 (fig. 1A). Især blev ekspressionsniveauet af MIR-149 positivt korreleret med differentiering graden af ​​GC-celler. Nemlig ekspressionsniveauet af MIR-149 i ringe differentierede cellelinjer, såsom MKN45, GC9811, og AGS, er betydeligt lavere end i moderat og godt differentierede cellelinier. Ekspressionen af ​​MIR-149 i moderat differentierede celler, SGC7901, er lavere end i den veldifferentierede cellelinie, MKN28 (fig. 1A).

For at bestemme, om niveauer af MIR-149 korrelerer også med differentiering graden af ​​tumorer undersøgte vi ekspressionen af ​​miR-149 i 44 humane GC kliniske prøver, herunder 13 dårligt, 16 moderat, og 15 godt differentierede prøver. Vi fandt, at ekspressionen af ​​MIR-149 i gastriske tumorer er bemærkelsesværdigt lavere end i matchede normale tilstødende væv (fig. 1b). Desuden udtryk for miR-149 i mere differentierede tumorer var højere end i mindre differentierede tumorer (Fig 1C, F = 65,391, s
. ≪ 0,001). Desuden nedsat ekspression af MIR-149 korrelerer med lymfeknudemetastaser (* s
= 0,046) og TNM fase (** s
= 0,0011) (tabel 1).

Ektopisk udtryk for miR-149 hæmmer proliferation og inducerer G0 /G1 anholdelse i AGS og SGC7901 celler

for at undersøge betydningen af ​​miR-149 i GC celler, vi udnyttet dårligt og moderat differentierede GC-cellelinjer, AGS og SGC7901 hhv. AGS og SGC7901 celler blev transient transficeret med eithermature MIR-149 efterligner, inhibitor, mock transficeret eller MIR-NC. Som vist i figur 2A, 2D, kvantitative RT-PCR resultater viser, at ekspression af MIR-149 efterligner eller inhibitorer markant opregulere eller nedregulere ekspressionen af ​​MIR-149, henholdsvis i AGS og SGC7901 celler fra den første, femte dag efter transfektion (Fig . 2A, F = 8,429, s
= 0,003;.. figur 2D, F = 8,595, s
= 0,003) sammenlignet med NC og mock kontroller

AGS og SGC7901 celler transficeret med mIR-149 efterligner og inhibitorer viste signifikant lavere og højere niveauer af celleproliferation henholdsvis end NC eller mock grupper som bestemt ved MTT-assayet (fig 2B, F = 27.47, s. < 0,001;. fig 2E, F = 44,061, p < 0,001). Transfektion af AGS og SGC7901 celler med miR-149 efterligner resulterer i signifikant G1 fase anholdelse i forhold til NC og mock kontroller ( s
< 0,05). Desuden behandling med MIR-149 hæmmere ført til færre AGS og SGC7901 celler i G1 anholdelse i forhold til NC og mock kontroller ( s
< 0,05). (Fig 2C, F = 134,177, p
< 0,001;.. figur 2F, F = 58,792, s
= 0,003)

ZBTB2
er et mål for MIR-149

Tidligere data antyder, at mIR-149 kan være en undertrykker af GC cellevækst ved at målrette gener, der styrer proliferation og cellecyklusprogression (33-34) (38). Således har vi søgt efter yderligere potentielle mål for miR-149 fra TargetScanHuman database. Vi identificerede talrige potentielle MIR-149 målgener, herunder ZBTB2
, en POK familie transkriptionsfaktor og potent repressor af ARF-HDM2-p53-p21-vejen (41). ZBTB2
viste sig at have formodede miR-149 bindingssteder inden for sit 3'UTR (fig. 3A). Luciferasereporteren analyser blev udført for at kontrollere, om ZBTB2
er et direkte mål for miR-149 ved hjælp af AGS og SGC7901 celler. Vi co-transficeret AGS og SGC7901 celler med henholdsvis en psiCHECK-2 vektor, der indeholder enten 3'UTR for ZBTB2 eller muteret 3'UTR for ZBTB2, og efterligninger af miR-149 eller hæmmere af miR-149. Vildtype og mutant ZBTB2-3'UTR indeholdende det formodede bindingssted MIR-149 blev klonet ind psiCHECK-2-vektoren nedstrøms fra luciferasegenet (fig. S1). Indførelse af miR-149 væsentligt reduceret luciferaseaktiviteten fra ZBTB2 3'UTR reporter vektor (fig 3B-3C, s
. ≪ 0,001), men påvirkede ikke luciferaseaktiviteten fra mutant ZBTB2-3 'UTR reporter vektor. Disse data antyder, at MIR-149 direkte regulerer ZBTB2
ekspressionsniveauer. Endvidere er der ingen signifikant nedgang i relativ luciferaseaktivitet i celler co-transficeret med MIR-149 inhibitor eller 3'UTR-ZBTB2 /psiCHECK-2-vektoren (fig. 3B-3C). Det er måske på grund af det manglende samspil mellem 3'UTR af ZBTB2 og endogent MIR-149 dermed faldt MIR-149-ekspression ikke steg luciferaseaktiviteten fra ZBTB2-3'UTR reporter vektor. Disse resultater bekræfter endvidere, at miR-149 undertrykker ZBTB2 udtryk ved at målrette 3'-UTR af ZBTB2
mRNA.

miR-149 og ZBTB2 udtryk er negativt korreleret i GC celler og kliniske prøver

for yderligere at undersøge forholdet mellem miR-149 og ZBTB2, undersøgte vi ekspressionen af ​​ZBTB2 i GC celler ved hjælp af western blotting og i GC væv ved hjælp immunhistokemi. Det blev konstateret, at GC celler har signifikant højere ekspressionsniveau af ZBTB2 end den normale gastriske epitelcelle, GES-1 (fig 4A a-b F = 167,843, s
. ≪ 0,001). ZBTB2 ekspression negativt korreleret med differentiering graden af ​​GC celler; dårligt differentierede GC væv viste en signifikant højere ZBTB2 udtryk niveau end godt differentierede GC væv og matchede normale gastriske væv (Fig S2A-B, F = 117,280, s
. < 0,001). ZBTB2
mRNA ekspressionsniveauerne er sammenfaldende med protein niveauer (Fig 4B a, F = 283,355, s
. ≪ 0,001). Desuden er udtryk for miR-149 og ZBTB2 omvendt korreleret (fig. 4B b s
= 0,033, R = -0,908). Vi målte derefter ekspressionsniveauerne af MIR-149 og ZBTB2
brug af kvantitativ RT-PCR i 5 GC cellelinier (MKN45, GC9811, AGS, SGC7901, og MKN28) (fig. 4C a) og 18 GC klinisk prøver (6 dårligt, 6 moderat, og 6 godt differentierede prøver) (fig. 4C b). Resultaterne bekræfter, at mRNA niveau af ZBTB2
negativt korrelerer med miR-149-ekspression (figur 4C en, s
= 0,033, R = -0,847;.. Figur 4C b p
< 0,001, R = -0,908). Desuden AGS (fig. 4D) og SGC7901 celler (Fig. 4E) transficeret med MIR-149 efterligner faldet betydeligt ekspression af ZBTB2 på proteinniveauer (paneler A-B) og mRNA-niveauer (panel C) sammenlignet med mock eller NC celler ( s
< 0,001). Vores resultater viser, at miR-149 direkte kan regulere ekspressionen af ​​ ZBTB2
.

miR-149 undertrykker GC celledeling og cellecyklusprogression ved at målrette ZBTB2

Næste vi bekræftet, at miR-149-medieret proliferation hæmning og induktion af cellecyklus arrest i GC celler kræver målretning af ZBTB2
. ZBTB2
udtryk blev slået ned ved hjælp siRNA'er i AGS og SGC7901 celler. Western blotting (fig. 5A, a-c) og kvantitativ PCR-analyse viste, at udtømning af ZBTB2
efter siRNA transfektion kunne kompenseres væsentligt ved MIR-149-inhibitor og en markant stigning af ZBTB2 blev set i celler transficeret med miR-149-hæmmere (figur 5B, s
. < 0,001). MTT-assay viser, at proliferation af celler transficeret med siRNA-ZBTB2 blev undertrykt og spredning af celler transficeret med MIR-149 inhibitorer kraftigt i forhold til celler transficeret med siRNA-NC (kontrol) og siRNA-ZBTB2 + MIR-149 (fig. 5C ). Desuden hæmning af ZBTB2
udtryk fremmer G0 /G1 anholdelse og undertrykker G0 /G1 cellecyklusstop induceret af miR-149-hæmmer behandling i AGS og SGC7901 celler sammenlignet med NC kontrol celler (Fig. 5D-5E, s
< 0,001). Vores resultater tyder på, at miR-149 hæmmer GC celledeling og cellecyklusprogression ved at hæmme ZBTB2
udtryk.

Indførelse af miR-149 ændret ekspression af ZBTB2 og celle-cyklus-relaterede proteiner

ZBTB2 er blevet rapporteret at være en kraftig repressor af ARF-HDM2-p53-p21-vejen, hvilket er vigtigt i cellecyklusregulering (41). For at undersøge reguleringen af ​​disse proteiner ved miR-149 i GC celler, vi transficeret AGS og SGC7901 celler med miR-149 efterligner eller miR-NC og udført RT-PCR og western blotting analyse for ZBTB2 målgener. Som vist i figur 6A-6B, ektopisk ekspression af MIR-149 nedregulerer ekspressionen af ​​ZBTB og HDM2, og opregulerer ekspressionen af ​​ARF, p53, og p21 ( s Restaurant < 0,001). Disse data er i overensstemmelse med funktionen af ​​ZBTB2 undertrykke transskriptionen af ​​ARF, p53, og p21 og aktivere ekspressionen af ​​HDM2 (41). Endvidere ektopisk ekspression af ZBTB2 ved transfektion vendt MIR-149-medieret reduktion i HDM2 ekspression og forøgelse af ARF, p53, og p21-ekspression i AGS og SGC7901 celler (fig. 6A-B). . Ektopisk ZBTB2 udtryk blev bekræftet i transficerede AGS og SGC7901 celler (Fig S3, SGC7901 celler, F = 806,365, s
< 0,001; AGS celler, F = 1436,300, s
< 0,001). ARF, p53 og p21 fremme cellecyklusprogression derfor deres nedregulering ved ekspression af miR-149 efterligner forklarer G0 /G1 fasen anholdelse i AGS og SGC7901 celler.

Diskussion

Stigende tyder på, at miRNA spiller en kritisk rolle i carcinogenese og cancer progression [21]. Ændrede miRNA ekspressionsniveauer har været impliceret i initiering og udvikling af tumorer; modulering af miRNA, der fungerer som negative regulatorer af onkogener eller tumorundertrykkere resultater i fremme af kræft celledeling og vækst [28] - [32]. Tidligere undersøgelser har vist, at den rolle MIR-149 i progressionen af ​​forskellige typer af tumorer er kontroversiel [33] - [36], [38]. Ekspressionsmønsteret og mål for MIR-149 varierer i forskellige typer af tumorer. MIR-149-ekspression nedreguleres i nogle tumorer, der fungerer som en tumorsuppressor ved at målrette onkogener i nogle kræftformer. For eksempel i klar celle renalcellecarcinom MIR-149 nedreguleres og dens sandsynlige mål blev identificeret som KCNMA1 og LOX (35). Desuden er MIR-149 også nedreguleret i glioblastomceller og er blevet foreslået at fungere som en tumorsuppressor ved at målrette RAP1B, CD47, CCN1, og NXF1 [36]. I modsætning hertil kan MIR-149 også fungere som en tumorsuppressor ved at målrette visse onkogener. Påvisning af miRNA udtryk profiler i forskellige kliniske stadier af nasopharyngeal carcinoma (NPC) og NPC lymfeknudemetastase viser, at ekspressionen af ​​MIR-149 opreguleres i NPC og ekspression af dets målgen, Smad2
, reduceres med progressionen af ​​NPC [38]. En lignende onkogen rolle for MIR-149 blev også set i melanom, hvor opregulering af MIR-149 forårsager nedregulering af GSK3-α og opregulering af Mcl-1, hvilket resulterer i apoptotisk resistens [34]. Hidtil, lidt om den rolle, miR-149 i mavekræft. Her rapporterer vi, at MIR-149 ekspression bemærkelsesværdigt er reduceret i multiple gastriske cancercellelinier og kliniske prøver sammenlignet med den normale gastriske epitelceller og matches tilstødende normale væv, henholdsvis. Vigtigt er niveauet af MIR-149-ekspression er forbundet med differentieringen grad af GC-celler og prøver; ringe differentierede GC celler eller prøver har lavere MIR-149-ekspression sammenlignet med godt differentierede prøver. Ektopisk udtryk for miR-149 hæmmer celler proliferation og cellecyklusprogression ved at målrette ZBTB2
i AGS og SGC7901 celler. miR-149 og ZBTB2 udtryk er negativt korreleret i GC celler og kliniske prøver, og overekspression af miR-149 forårsager nedregulering af ZBTB2
. Udtømning af ZBTB2 resulterer i hæmning af AGS og SGC7901 celler proliferation og cellecyklus progression. Kollektivt viser disse resultater for første gang, at ZBTB2 kan fungere som et onkogen i tumorigenese af gastrisk cancer.

Vores data viser, at indførelsen af ​​MIR-149 i GC-celler inducerer standsning af cellecyklus, hvilket antyder, at mIR-149 mål kan være impliceret i cellecyklusregulering. ZBTB2 er en POK familie transskription faktor, der kan undertrykke ARF-HDM2-p53-p21 vej [41]. ARF, en tumor suppressor [42], kan induceres ved vedvarende mitogenisk stimulering og spiller en central rolle i aktivering p53 selvstændigt og styring stabiliteten af ​​p53 gennem interaktion med HDM2 [43], en vigtig regulator af p53. Tumor suppressor p53 spiller en kritisk rolle i opretholdelsen af ​​cellehomeostase gennem inducere cellecyklus og apoptose, når celler udsættes for stressfaktorer, såsom hypoksi, DNA-skader, og telomer dysfunktion [44]. p21, en p53 målgen, medierer cellecyklussen G1 fasen gennem binding og inhibering af aktiviteten af ​​cyclin-CDK2 eller CDK1 komplekser [45]. ZBTB2 kan undertrykke transskriptionen af ​​ARF, p53, og p21, og inducere HDM2 ekspression [41]. For at validere, om cellecyklussen effekt induceret af MIR-149 ekspression medieres af ZBTB2 tab undersøgte vi ekspressionen af ​​HDM2, ARF, p53 og p21 af AGS og SGC7901 celler transficeret med MIR-149 efterligner. Vi fandt, at ektopisk ekspression af MIR-149 resulterer i forøget ekspression af ARF, p53, og p21 og nedsat ekspression af HDM2 og ZBTB2. Disse resultater understøtter ideen om, at miR-149 udøver sin rolle hæmme GC celler proliferation og cellecyklusprogression ved at målrette ZBTB2
derved modulere ekspressionen af ​​downstream regulatorer af cellecyklusprogression.

Sammenfattende vores data viser, at mIR-149 kan fungere som en tumorsuppressor i gastriske cancerceller og spiller en vigtig rolle i inhibering ZBTB2
. Derfor nedregulering af miR-149 fremmer GC celledeling og cellecyklus progression. Desuden viser vores resultater, at ZBTB2 kan fungere som et onkogen i udviklingen af ​​mavekræft. Men i betragtning af, at hver miRNA kan regulere mange målgener der kan påvirke carcinogenese på forskellige måder, er der behov for flere undersøgelser for at undersøge andre miR-149 mål, som kan have kritiske roller i GC tumorigenese. Den foreliggende undersøgelse giver også nyt indblik i den rolle, miR-149 i human gastrisk cancer progression og indikerer, at miR-149 kan fungere som et terapeutisk mål for mavekræft behandling.

Materialer og metoder

Etik Erklæring

For vævsprøver, skriftligt informeret samtykke blev opnået fra patienter. De procedurer, der anvendes i denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Board i den fjerde Military Medical University og blev tilpasset til Helsingfors-erklæringen, og med lovgivning.

cellelinjer og dyrkningsbetingelser

Gastric cancer linjer AGS blev MKN28, MKN45 købt fra AGCC og GC9811 og SGC7901 cellelinjer blev opnået fra Beijing Institute of Oncology. Alle cellelinier blev opretholdt i vores institut ifølge anbefalede protokoller. Celler blev dyrket i RPMI-1640-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ved 37 ° C i en CO 5% _{2 incubator .}

Menneskelige prøver

Alle eksperimentelle procedurer blev godkendt af Institutional Review Board i den fjerde Military Medical University. Skriftligt informeret samtykke blev opnået for alle patient samples.Human gastrisk kræft prøver (n = 44) og matchede tilstødende ikke-tumor prøver blev opnået fra patienter på Xijing Hospital i Digestive Diseases, den fjerde Military Medical University, med informeret samtykke fra hver patient. Salg

RNA rensning, cDNA-syntese, og kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR)

Totalt RNA fra dyrkede celler blev ekstraheret med TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens protokol og RNA'er blev opbevaret ved -80 ° C før QRT-PCR-analyse. Modent MIR-149-ekspression blev detekteret ved anvendelse af et Mirvana TM QRT-PCR miRNA Detection Kit (Ambion Inc. Austin, Texas), med U6 som en intern kontrol. ZBTB2 ekspression blev detekteret med primere F: 5'ACTCGGGCGAGATCCACGGC 3 ', R: 5'ACGCAGGCTGCTCATCGGAG 3', og GAPDH blev anvendt som en intern kontrol. PCR-produkter blev separeret på en ethidiumbromid-farvet 1,5% agarosegel og visualiseret med UV.

Cell transfektion

Det humane MIR-149 duplex efterligne og inhibitor (MIR-149) og en negativ kontrol oligonucleotidduplex efterligner (miR-NC) er designet og leveret af Ribobio (Guangzhou, Guangdong, Kina). Den lille interfererende RNA (siRNA) for ZBTB2 og den negative kontrol-RNA (siRNA-NC) blev syntetiseret og oprenset ved Genepharma (Shanghai, Kina). miRNA, siRNAs og ZBTB2 cDNA plasmid (FulenGen Co. Kina) blev transficeret ved LipofectamineTM 2000 reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens protokol. Den ZBTB2 siRNA sekvens: F: 5 'GCUGGCUUCUUUCCAAGUU DTDT 3', R: 5 'AACUUGGAAAGAAGCCAGC 3'; NC siRNA sekvens: F: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3 ', R: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT -3'

miRNA target forudsigelse

For at finde potentielle miRNA målgener, TargetScanHuman hjemmeside (. http://www.targetscan.org/) blev anvendt, bindingen fri energi blev beregnet, og biding sites blev analyseret ved hjælp http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid hjemmeside.

Vector konstruktioner og luciferase reporter assay

for at konstruere ZBTB2-3'UTR plasmid, en vildtype 3'-UTR fragment af human ZBTB2 mRNA (1238-1244 nt, tiltrædelse Genbank nr. NM_020861.1), som indeholder den formodede mIR-7 bindingssekvens blev amplificeret ved RT-PCR og klonet ind på webstedet mellem Xho i og Not i nedstrøms for luciferasereportergenet af psiCHECK ™ vektor (Promega, USA). En mutant af den fælles miR-7 bindingssted (5'GAGCCAG-3 'til 5'ACCGCGC-3') i 3'-UTR af ZBTB2 blev inkluderet ved mutagenese Kit (SBS Genentech, Beijing, Kina ). Vilde og mutante former for pmirGLO-ZBTB2-UTR vektorer blev valideret ved DNA-sekventering

Nukleotidsekvenserne for primerne for ZBTB2-3'UTR (MT) klon:. MutZBTB2F: 5'GGCCTCACAAGACAAAACAGACCGCGCAAGTAAGGACTGAAGGAGAA 3 'mutZBTB2R: 5' TTCTCCTTCAGTCCTTACTTGCGCGGTCTGTTTTGTCTTGTGAGGCC 3 '

nukleotidsekvenserne for primere til ZBTB2-3'UTR (WT) klon: ZBTB2XhoIF: 5'CCGCTCGAG ATGTCACTTATCTTTTTAAAAAACTCTCA 3' ZBTB2NotIR: 5'ATAAGAATGCGGCCGC TACTCATTTAATTAAACGTTTATTC 3 'ZBTB2XhoIF2: 5'CCGCTCGAGATGTCACTTATCTTTTTAAAAAACTCTCATTTTTACAAAGACTATC 3' ZBTB2F3: 5'CCGCTCGAG CTGTAGTTCTCCATGGCATGATAC 3 '.

Celler blev transficeret med miR-149 efterligner, NC og pmirGLO plasmid i 24-brønds plader ved hjælp LipofectamineTM 2000 (Invitrogen) i henhold til instruktionerne. 48 timer senere blev celler høstet og analyseret for luciferaseaktivitet under anvendelse af Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA) og detekteres af GloMaxTM 20/20 detektionssystem (E5331, Promega).

Western blotting

Total protein fra dyrkede celler blev lyseret ved Lysis Buffer indeholdende PMSF på is. Derefter protein elektroforese gennem 12% SDS polyacrylamidgeler og blev derefter overført til en PVDF-membran (Millipore). Membraner blev blokeret med 5% fedtfri mælkepulver ved stuetemperatur i 1 time og inkuberet natten over med primære antistoffer. Membraner blev inkuberet med sekundære antistoffer mærket med HRP i 1 time ved stuetemperatur efter tre 10 minutters vaske i TBS-T (triethanolaminebuffered saltopløsning med Tween). Endelig blev detekteret signalerne anvendelse af ECL kit (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA), og membranerne blev scannet og analyseret under anvendelse af et Bio-Rad ChemiDoc XRS + imaging system med billedbehandlingssoftware (version mængde 1). Proteinet ekspression blev normaliseret til en endogen reference (Actin) og i forhold til kontrollen. Spectra flerfarvet bredspektret protein stige (Fermentas) blev anvendt som molekylær markør. Alle antistoffer anvendt i western-blot-assay, er vist i tabel S1.

Immunhistokemi og Immunohistokemisk scorings

Paraffinsnit, 4-um i tykkelse, blev bagt i 2 timer ved 65 ° C og deparaffineret . Antigen genfinding blev udført under anvendelse citrat natrium (pH 7,2) ved 95 ° C i 15 minutter og derefter Objektglassene blev afkølet ved stuetemperatur i 30 minutter. Efter at være blevet behandlet med 3% hydrogenperoxid i 15 minutter for at blokere endogen peroxidase blev sektionerne behandlet med normalt gedeserum begrænse væske i 30 minutter for at reducere ikke-specifik binding og derefter kanin-polyklonalt anti-ZBTB2 (1:500, BIOSs Co . Kina) inkuberet sektionerne i 12 timer ved 4 ° C.After genopvarmning i 1 time og vask i 5 gange, blev snit inkuberet med sekundært antistof i 30 minutter ved stuetemperatur. Diaminobenzidin (DAB) blev anvendt til farvereaktioner. Efterfølgende immunhistokemisk farvning blev scoret som tidligere beskrevet [46].

MTT assay

Celler blev transficeret med 100 nM miR-149-hæmmer (Genepharma, Shanghai, Kina), efterligner (Ribobio, Guangzhou, Guangdong, Kina) eller 100 nM siRNA-ZBTB2 (Genepharma) .Twenty-fire senere, celler blev podet i 96-brønds plader (2 × 103 /brønd). Cellernes levedygtighed blev undersøgt ved MTT (3-2, 5-diphenyl tetrazoliumbromid) assay (Sigma, USA) dagligt i 6 dage.

Cell cyklus assay ved flowcytometri

mavekræft cellelinjer, AGS og SGC7901 blev dyrket i RPMI-1640-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) suppleret med 10% FBS i 6-brønds plader. Transfektion blev udført, når cellerne nåede 80 %% - 90% sammenflydning. Efterfølgende blev cellerne høstet, vasket to gange med PBS og fikseret i 70% ethanol ved 4 ° C natten over. Derefter blev cellerne inkuberet med propidiumiodid ved stuetemperatur i 1 time og blev analyseret ved flowcytometri under anvendelse af et FACScan flowcytometer (BD Biosciences, Mountain View, CA). Disse data blev analyseret ved hjælp af Flowjo (Flowjo).

Statistisk analyse

Data blev udtrykt som gennemsnit ± SEM af tre uafhængige forsøg. Til statistiske tests, SPSS statistisk software pakke, version17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) blev anvendt. Den t-test, envejs ANOVA og to-vejs ANOVA-test blev udført for MTT-assays, kvantitativ PCR og tumorvækst kurve. Sammenhængen mellem miR-149 og ZBTB2 blev analyseret med Spearman rank korrelation. P-værdier < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Støtte oplysninger
figur S1..
vildtype og mutant ZBTB2
-3'UTR indeholdende det formodede bindingssted MIR-149 blev klonet ind psiCHECK-2-vektoren. A. ZBTB2
-3'UTR blev amplificeret fra genomisk DNA af AGS. B. Lane 1,3, 5: Rekombinantplasmider af ZBTB2-1, ZBTB2-2, ZBTB2-3
henholdsvis; bane 2,4,6: Resultater af enzym fordøjelse af rekombinante plasmider af ZBTB2-1, ZBTB2-2, ZBTB2-3
hhv. Resultaterne viste, at ZBTB2
-1/2/3 succes er blevet indsat i vektorerne (M1:. DL2000 DNA Marker, M2: DL1 kb DNA Marker; ZTBT2-1 /2/3 bands: 1406 bp; vektorer bands: 6.1 Kb). C. M1: 1 kb DNA-stige Marker. Bane 1: forstærkning af mut ZBTB2
F1 /R1 (negativ kontrol uden Taq enzym); Bane 2: forstærkning af mut ZBTB2
F1 /R1. Et bånd af mut ZBTB2
(7,6 Kb) viste den vellykkede PCR af mutant forstærkning. D. sekventeringsresultaterne af WT ZBTB2
og MT - ZBTB2
doi:. 10,1371 /journal.pone.0041693.s001
(TIF)
figur S2 .
ZBTB2 udtryk i humane mavekræft prøver og matchede tilstødende normale væv. A. Repræsentative viste billeder er positive immunhistokemisk farvning af ZBTB2 i humane mavekræft prøver (b-c) og matchede tilstødende normale væv (a) (forstørrelse 200 ×). B. Immunhistokemisk farvning blev bedømt som tidligere beskrevet [46]; statistisk analyse af data på ZBTB2 udtryk forskellen mellem human mavekræft prøver og matchede tilstødende ikke-kræft væv (One-Way ANOVA-analyse, F = 117,280, *** s
< 0,001).

• PLoS ONE: CYP2E1 Rsal /Pst Polymorfi og Gastric Cancer følsomme: Meta-analyser Baseret på 24 case-control studier
• PLoS ONE: genetisk modtagelighed Faktorer på gener involveret i steroidhormonet Biosyntese Pathway og Progesteron Modtager til mavekræft Risk