Baggrund
Exosomer spiller en stor rolle i celle-til-celle kommunikation, målrettet celler til at overføre exosomal molekyler, herunder proteiner, mRNA, og microRNA'er (miRNA) ved en endocytosis- lignende pathway. miRNA er små ikke-kodende RNA-molekyler i gennemsnit 22 nucleotider i længde, der regulerer talrige biologiske processer, herunder cancer patogenese og medierer gen nedregulering ved at målrette mRNA'er at inducere RNA-nedbrydning og /eller interferere med translation. Nylige rapporter indebærer, at miRNA stabilt kan detekteres i cirkulerende plasma og serum, da miRNA emballeres ved exosomer, beskyttes mod RNA-nedbrydning. Således profilering exosomal miRNA er behov for at afklare intercellulære signalering og opdage en ny sygdom markør så godt.
Exosomer blev isoleret fra dyrkede kræftceller og deres kvalitet valideret ved analyser af transmissionselektronmikroskopi og western blotting. En af de testede cellelinier, en metastatisk gastrisk cancercellelinie, AZ-P7a, viste den højeste RNA udbytte i de frigivne exosomer og karakteristisk form i morfologi. Desuden blev RNA'er isoleret fra celler og dyrkningsmedier, og profiler af disse tre miRNA fraktioner blev opnået ved anvendelse af microarray analyse. Ved at sammenligne signalintensiteter af microarray data og efter validering anvendelse af RT-PCR-analyse fandt vi, at lade-7 miRNA familie var rigeligt i både intracellulære og ekstracellulære fraktioner fra AZ-P7a celler, mens lav metastatisk AZ-521, stamcellen linje af AZ-P7a, samt andre kræft cellelinjer viste ingen sådan tilbøjelighed.
konklusioner /betydning
berigelse af lad-7 miRNA familie i de ekstracellulære fraktioner, især i exosomer fra AZ-P7a celler kan afspejle deres onkogene karakteristika, herunder tumorgenese og metastase. Da lad-7 miRNA generelt spiller en tumor-undertrykkende rolle som målrette onkogener såsom RAS Henvisning:. Ohshima K, Inoue K, Fujiwara A, Hatakeyama K, Kanto K, Watanabe Y, et al. (2010) Lad-7 MicroRNA Family selektivt udskilt i det ekstracellulære miljø via Exosomer i en metastatisk gastrisk cancercellelinie. PLoS ONE 5 (10): e13247. doi: 10,1371 /journal.pone.0013247 Redaktør: Stefan Wölfl, Universität Heidelberg, Tyskland Modtaget: 14. april, 2010; Accepteret: 10. september 2010; Udgivet: 8 Okt 2010 Copyright: © 2010 Ohshima et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres Finansiering:. Arbejdet blev støttet af en bevilling i samarbejde med innovativ teknologi og avanceret forskning i evolutional Area (CITY AREA) fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser Introduktion celler udskiller forskellige typer af små membranvesikler. Exosomer er en af vesiklerne med 30-100 nm diameter og fysisk-kemisk forskelligt fra andre secernerede vesikler [1]. Inde exosomer, cellulære genprodukter, herunder proteiner, mRNA, og microRNA'er (miRNA) er pakket og disse molekyler kan overføres til modtagende celler til at levere deres molekylære signalering såsom onkogenese [2] - [4] og immunrespons [1], [ ,,,0],5]. Exosomer frigives af mange typer af celler [6], som omfatter tumorceller, epitelceller og hæmatopoietiske celler, såsom reticulocytter, cytotoksiske T-lymfocytter, Epstein-Barr-virus-transformerede B-celler, mastceller, dendritiske celler og blodplader. Udskilles exosomer er blevet isoleret og karakteriseret in vitro miRNA er en klasse af ikke-kodende små RNA'er, der er involveret i post-translationel regulering af genekspression ved inhibering både stabilitet og translation af mRNA'er [14]. De seneste oplysninger har vist, at miRNA mutationer eller misexpression korrelerer med forskellige menneskelige kræftformer og viser, at nogle miRNA kan fungere som onkogener eller tumor undertrykkere [15], [16]. For at analysere RNA, er det altid at overveje deres stabilitet fra nedbrydning af RNase. Nylige resultater viser, at endogene plasma miRNA i blodprøver er stabilt påvises i en form, som er resistent over for RNase-aktivitet [17], vist ved identifikation af miRNA i legemsvæsker, såsom blod [17] - [24], urin [25], og spyt [10], [26]. Dyrkede cancerceller er blevet anvendt for at søge efter tumormarkører. Især har der identificerer proteiner og peptider udskilles i dyrkningsmedierne udviklet af proteomics tilgang [27], [28]. Som for molekylær signatur i exosomer, har proteomics samt transcriptomics analyser udført for at afsløre tumorigenese og identificere tumor markør kandidater [2] - [4], [7], [29]. Her identificere miRNA relateret til tumorgenese og metastase, vi udførte omfattende miRNA analyse i tre cellulære fraktioner, herunder celler, exosomer og medium fra dyrkede celler. Ranking data i disse intracellulære og ekstracellulære miRNA opnået ved microarray analyse, fandt vi, at lade-7 miRNA familie er rig på alle fraktioner fra AZ-P7a celler, en metastatisk gastrisk cancercellelinie, som producerer homogen og kondenseret morfologi, og høj genvinding sats på exosomal miRNA. Disse resultater var forskellige fra andre cellelinjer, herunder lungekræft cellelinier (SBC-3, NCI-H69, og DMS53), kolorektale cancer cellelinjer (SW480 og SW620), og AZ-521, den parentale cellelinje af AZ-P7a. I betragtning af, lad-7 miRNA familie funktioner primært som tumorsuppressorgener [30] til at målrette onkogener såsom RAS Resultater Isolering af exosomer fra forskellige cancer cellelinjer exosomer fremstilles af indre celler til ekstracellulære miljø via en exocytose-lignende pathway [1]. Foruden kropsvæsker såsom serum og plasma fra perifert blod [7], [8], exosomer er fundet i mediet af dyrkede celler [7], hvilket letter identifikation af exosomal molekyler, herunder proteiner, mRNA'er, og miRNA til målet for deres kliniske anvendelse. Profiling sådanne exosomal molekyler produceret i dyrkede cancerceller har ført til at opdage en hidtil ukendt kandidat markør og antigen til kræftdiagnostik og immunterapi [7]. I denne undersøgelse med henblik på profilering exosomal miRNA, vi først isoleret exosomer fra dyrkningsmedier af 46 cancercellelinier med forskellige vævstyper, som omfatter 8 til maven, 16 for lunge-, 5 for colon, 9 for pancreas, 3 for prostata og 5 for brystkræft. Efter celler blev dyrket i 48 timer blev exosomer opsamlet med en kombination af successiv centrifugering og molekylvægt cut-off membraner som beskrevet i Materialer og Metoder. Deres renhed af exosomal fraktioner blev bedømt ved analyser af transmissionselektronmikroskopi og western blotting. Transmissionselektronmikroskopi viste rund form vesikulære membranstrukturer omtrent i størrelse på 100 nm i diameter. Blandt tre cellelinier, SBC-3, AZ-521, og AZ-P7a, er det af interesse, at morfologien fra AZ-P7a celler var mere homogen og kondenseret end andre celler (figur 1A). Immunoelektronmikroskopi viste, at de ekstracellulære partikler isoleret fra dyrkningsmediet fra AZ-P7a celler havde immunreaktivitet med et antistof mod CD63, et af de exosomal membranproteiner, på kapsulære membraner (figur 1B). Tilstedeværelsen af kendte exosomal proteiner, herunder CD29 /β1-integrin, Aip1 /Alix og tumor modtagelighed gen 101 (Tsg101) blev bekræftet ved Western blot-analyse, mens et protein lokaliseret til endoplasmatisk reticulum, Bip /Grp78, kunne ikke påvises (Figur 1C). Dette resultat viser, at forureningen af materiale fra andre cellulære rum i exosomal fraktioner var minimal. Udbyttet af exosomal proteiner fra AZ-P7a celler var 10 gange højere end fra AZ-521 celler; ~2.5 Mg proteiner blev opnået fra 1 x 10 8 AZ-P7a celler. Efter isolation, exosomal samlede RNA'er blev isoleret fra 46 dyrkede cellelinier. Interessant RNA udbytter fra AZ-P7a celler langt større end dem fra andre celler (figur 2A). Fordelingen i længden viste tilstedeværelsen af store mængder af små RNA'er i exosomer (midterpanelet, figur 2B). Det skal bemærkes, at der er en signifikant forskel i total exosomer og exosomal miRNA niveauer mellem patienter med lunge-adenocarcinom og kontroller [8]. AZ-P7a cellelinie blev etableret ved gentagen podning af de parentale AZ-521-celler i mus, resulterede i høj peritoneal-metastatisk potentiale [32], [33]. Således kan høje udbytter af både RNA og protein sammen med de morfologiske karakteristika i AZ-P7a celler tilskrives deres høje tumorigene og metastatiske tilbøjeligheder. Da der er påvist miRNA i cellefrie kropsvæsker [17] - [20], udførte vi også direkte isolering af totale RNA'er fra dyrkningsmedium uden procedure til isolering af exosomer. Mængderne af de samlede RNA fra dyrkningsmedier var generelt større end dem fra exosomer (figur 2A). RNA fordeling i længden viste, at miRNA fraktioner blev detekteret i intervallet fra 10 til 40 nukleotid længde i RNA'er fremstillet fra dyrkningsmedium (højre panel) samt exosomer (midterpanelet) fra AZ-P7a celler (figur 2B). Ifølge producentens protokol for Bioanalyzer, toppe med længere end 40 nukleotid længde indeholde andre små RNA'er, herunder tRNA'er på 70~90, 5S ribosomalt RNA ved 100, og 5,8S ribosomalt RNA ved 150, som observeret i det intracellulære fraktion (venstre panel) . Disse resultater antyder, at miRNA kan eksistere i dyrkningsmediet uden for exosomal fraktion selvom RNA'er menes at være beskyttet mod RNaser som værende pakket i exosomer. Især i forhold til klæbende celler, tilvæksten af RNA udbytter var bemærkelsesværdigt større i flydende celler (NCI-H69 og Lu-135) eller celler med mix populationer af flydende og adhærerende celler (Colo205), som kan afspejles af forurening af RNA skur fra lyserede celler, der har været uafbrudt tilbage i kulturmedier. miRNA profilering af microarray analyse miRNA profiler i de intracellulære og ekstracellulære fraktioner blev bestemt ved microarray analyse for syv kræft cellelinjer, herunder AZ- 521, AZ-P7a, SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480, og SW620. Prøver fra kulturmedier samt exosomer forudsat hybridiseringssignaler (figur 3), hvilket indikerer tilstedeværelsen af miRNA i disse prøver. Hidtil, analysere microarray data for miRNA blandt prøver, er der ikke klare metoder til normalisering af signal intensitet, da det er vanskeligt at finde en passende intern standard materiale [34]. Således har miRNA microarray data generelt været analyseret uden normalisering, under forudsætning af, at den samlede mængde af input RNA er konstante blandt prøver [34], [35]. I denne undersøgelse efter gennemsnit miRNA microarray data mellem to replikater, vi rangeret miRNA efter deres signalintensiteter. Vi fandt, at lade-7 miRNA familien såsom lad-7a, lad-7b, lad-7c, lad-7d, lad-7e, lad-7f, lad-7 g, og lad-7i blev påvist med relativt høje signaler i det meste de intracellulære fraktioner fra de syv cellelinier (tabel 1, figur 3). Men ingen eller små signalintensiteter for de lad-7 miRNA blev påvist i de ekstracellulære fraktioner, undtagen både ekstracellulære fraktioner fra AZ-P7a celler og dyrkningsmedium fraktion fra NCI-H69-celler (tabel 1, figur 3). Især i begge de ekstracellulære fraktioner fra AZ-P7a celler, alle otte lad-7 miRNA blev detekteret selv rang af lad-7g var lavere end andre syv lad-7 miRNA. Baseret på de forskellige mønstre af lad-7 miRNA niveauer blandt de tre cellulære fraktioner, vi opdelt syv cellelinjer i tre grupper (figur 3) som følger; (1) AZ-P7a, celler, der lader-7 miRNA blev fundet i alle de tre fraktioner, (2) AZ-521 sammen med SBC-3, DMS53, SW480, og SW620, celler, der lader-7 miRNA blev generelt fundet i kun intracellulære fraktioner, (3) NCI-H69, celler, der lader-7 miRNA blev fundet i de intracellulære fraktioner samt i dyrkningsmediet til en vis grad. RT-PCR-analyser af intracellulær og ekstracellulær bogstav 7 miRNA familie Vi derefter udført kvantitativ RT-PCR for otte lad-7 miRNA familie til at validere microarray data. Lad-7 miRNA blev let påvises i de intracellulære og ekstracellulære fraktioner fra AZ-P7a celler (figur 4A) og AZ-521-celler (figur 4B). Niveauerne af lad-7 miRNA pr input RNA var generelt højere i de ekstracellulære fraktioner fra AZ-P7a celler end fra AZ-521 celler. Til normalisering af niveauerne af target miRNA opnået ved RT-PCR, er U6 snRNA været almindeligt anvendt som en intern kontrol. Vi observerede forekomst af U6 snRNA i alle tre fraktioner fra AZ-P7a celler og AZ-521 celler (figur 4C) og derefter sammenlignet niveauerne af lad-7 miRNA mellem de tilsvarende fraktioner fra disse to cellelinier. Efter normalisering, niveauerne af lad-7 miRNA herunder lad-7a, lad-7b, lad-7c, lad-7d, lad-7e, og lad-7i i både fraktionerne af exosomer og dyrkningsmedier fra AZ-521-celler var sænket i forhold til dem fra AZ-P7a celler. Tværtimod var der ingen stor forskel i niveauerne af intracellulære lad-7 miRNA. Vi næste sammenlignet niveauet af exosomal Lad-7a fra AZ-P7a celler med dem fra andre kræftceller, herunder SBC-3, NCI-H69, DMS53, SW480 og SW620, og fandt, at Lad-7a niveau kun fra SW620 celler var forholdsvis tæt (0,7 gange) til niveauet fra AZ-P7a celler (Figur 4E). Det skal bemærkes, at det intracellulære niveau af lad-7a fra SW620-celler var ca. 3,5 gange mere rigelige end fra AZ-P7a celler. Baseret på disse resultater antog vi lokalisering af lad-7a i fraktionerne af celler og exosomer (figur 5), og en yderligere analyse. Normaliseret ved U6 niveauer, vi beregnede relative niveauer af lad-7a pakket i exosomer pr niveauerne af cellulære lad-7a (Figur 4F). Som et resultat, mængden af exosomal Lad-7a var meget større i AZ-P7a celler end andre seks celler, hvilket antyder, at AZ-P7a celler selektivt og aktivt udskiltes lad-7 miRNA familie i det ekstracellulære miljø gennem exosomer. diskussion i den foreliggende undersøgelse viste vi, at lade-7 miRNA familien blev udskilt i det ekstracellulære miljø gennem exosomal transport, som var specifikke for en metastatisk gastrisk cancercellelinie, AZ-P7a. Lad-7 miRNA familie i human består af 10 sekvenser fra 13 forstadier [30]. Generelt Lad-7 miRNA fungere som en tumor suppressor ved målretning onkogener som RAS Hos patienter med lungekræft, øge det samlede niveau af exosomer og deres miRNA sammenlignet med kontroller [8 ]. Det er blevet påvist, at tumorceller exosomer forsøgt immun flugtmekanismen i cancere ved spontan T-celle apoptose [38] - [40]. I denne undersøgelse har vi vist homogen morfologi og berigelse af RNA i exosomer fra metastatisk AZ-P7a celler. Dette kan komme til udtryk ved deres tumorigenicitet. miRNA er meget stabile i blodplasma og serum siden beskyttet mod RNaser [17]. Således, det gør miRNA niveauer testet for klinisk diagnose som tumormarkører og biomarkører. Hvordan sker det? Chin et al. har foreslået to hypoteser for kilden til miRNA på cirkulerende blodprøver; det kan skyldes et resultat af tumorcelledød og lyserer eller frigivelse af tumorceller i den ekstracellulære mikromiljø af blodkar [19]. Tværtimod til adhærente celler, observerede vi, at mængden af totale RNA'er i dyrkningsmedier var relativt højere end i exosomer for celler med flydende ejendom, såsom NCI-H69, Lu-135, og Colo205. Denne stigning resulterede sandsynligvis i forurening af RNA fra døde celler i kulturmedier. For opdagelsen af nye blod tumormarkører og biomarkører, omik tilgange herunder proteomics og transcriptomics gennemføres enten ved direkte analyse af blodprøver eller ansøgning af profilering i vævsprøver. Der er modstridende rapporter hvis hvorvidt profiler miRNA og mRNA i blodbanen er parallelle med tumoren profil. Underskrivelsen af exosomal miRNA afspejler, at de med oprindelse tumorceller hos patienter med lunge adenocarcinom [8] og brystkræft [41]. På den anden side, Skog et al. har vist, at microarray analyse for mRNA afledt af glioblastom-celler og de tilsvarende exosomer afsløret mRNA'er udelukkende påvist i mikrovesikler, spekulerer, at mRNA'er er lokaliseret til en specifik region af cytoplasma [3]. Desuden Tanaka et al. har demonstreret, at niveauet af MIR-92a faldt i blodplasmaet af akutte leukæmi patienter mens dens stærke ekspression blev fundet i vævsprøverne [24]. Vores resultater på selektiv berigelse af lad-7 miRNA familie i AZ-P7a celler afledt exosomer fit med sidstnævnte tilfælde. Medmindre målmolekyler er miRNA afledt af cirkulerende tumorceller, antyder omhyggelig undersøgelse er nødvendig for, at miRNA profiler i vævsprøver til påvisning i serum- eller plasmaprøver. Da exosomer fremstilles i hæmatopoietiske celler samt epitelceller cirkulerende blod indeholder exosomer afledt fra begge typer celler. Generelt at undersøge exosomal profiler af proteiner, mRNA'er og miRNA i serum og plasma, er exosomer afledt af tumorer med epiteliale karakteristika adskilt fra dem fra hæmatopoietiske celler [8], [13]. Dette udføres ved anvendelse af affinitetsoprensning med antistoffer mod molekyler, såsom EpCAM som udtrykker på overfladen af epitelceller. Vores resultater, at der var tilsvarende niveauer af lad-7 miRNA familie mellem exosomer og dyrkningsmedier fra AZ-P7a celler tyder på, at disse miRNA niveauer kan måles uden at isolere exosomer fra kliniske prøver såsom serum og plasma. I konklusion, denne undersøgelse viste, at lade-7 miRNA familie er rig på exosomer fra en metastatisk gastrisk cancercellelinie, AZ-P7a celler. Da lad-7 miRNA er involveret i proliferation proces [31], deres exosomal sekretion, kan spille en vigtig rolle i tumorgenese og metastase. Cell kultur humane mavekræft cellelinjer (AZ-521, MKN45, KATOIII, og NUGC-3), human lunge cancer cellelinier (SBC-3, Lu-65, Lu-135, og KNS-62), og menneskelige bugspytkirtelkræftceller ( Suit-2) blev købt fra japansk Indsamling af Research Bioressourcer. Menneskelige mave kræftceller (SNU-1), human lunge cancer cellelinjer (DMS-53, DMS114, NCI-H69, A549, NCI-H1299, NCI-H1155, NCI-H520, NCI-H1560, SK-MES-1, og HCC827), humane lungehindekræft celler (MSTO-H211), humane kolorektale cancer cellelinjer (SW480, SW620, Colo205, LoVo, og HCT116, menneskelige bugspytkirtelkræft cellelinier (BxPC-3, aSPC-1, Panc-1, MIAPaca- 2, HPAF-II, PL45, og Capan-2), human prostatacancer-cellelinier (PC-3, SU145, og LNCaP) og human brystcancer-cellelinier (T-47D, MCF7, SK-BR-3, BT -474, og MDA-MB-231) blev købt fra American Type Culture Collection. MKN28 (human mave kræftceller) og PSN-1 (human bugspytkirtelkræftceller) blev købt fra Immuno-Biological Laboratories og europæisk Indsamling af Cell Culture henholdsvis . Humane mavekræft cellelinjer, AZ-P7a [32], [33] og MKN45P [42] var gave fra Drs. Yutaka Yonemura og Yoshio Endo. I AZ-521 og AZ-P7a celler, blev der ikke RT-PCR-produkter observeret i 14 retrovira herunder HPV16, EBV, CMV, SV40, HBV, HCV, BKV, JCV, HHV7, HTLV1, HTLV2, HIV1, HIV2, og ADV type 1 (data ikke vist), undtagen infektion med disse retrovira i både cellelinier . Celler blev opretholdt i RPMI-1640 medium (Sigma-Aldrich) tilsat 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (Invitrogen), 100 U /ml penicillin og 0,1 mg /ml streptomycin. klæbende celler blev podet til 150 mm-retter på passende antal celler fra 3 × 10 6 til 1 x 10 7 celler pr fad, mens flydende celler blev podet i 75 cm 2-kolbe på 2~2.5 × 10 7 celler pr kolbe. Celler blev dyrket i komplet RPMI-1640 medium på 25 ml og 50 ml til retter og kolber, henholdsvis i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO 2, vasket to gange med phosphatbufret saltvand (PBS), og inkuberet 48 timer i phenolrødt-frit RPMI-1640 medium (Sigma-Aldrich) indeholdende 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum, som tidligere var depleteret kontaminerende mikrovesikler ved overnight centrifugering ved 100.000 x g. Exosomer blev isoleret fra de totale celler, der spænder fra 6 × 10 7 Hvis til 3 × 10 8 celler som tidligere beskrevet [29]. Kort fortalt blev dyrkningsmediet opsamlet og centrifugeret ved 800 x g i 5 min og yderligere 2.000 x g i 10 minutter til fjernelse løftet celler. Supernatanten blev underkastet filtrering på en 0,1 um porestørrelse polyethersulfon membranfilter (Corning) for at fjerne cellerester og store vesikler, efterfulgt af koncentration af en 100.000 MW afskæringsmembran membran (Centriplus-70, Millipore). Volumenet af supernatanten blev reduceret fra ca. 250-500 ml til ca. 30 ml. Supernatanten blev derpå ultracentrifugeret ved 100.000 x g i 1 time ved 4 ° C under anvendelse 70Ti rotor (Beckman Coulter). De resulterende pellets blev resuspenderet i 6 ml PBS og ultracentrifugeret ved 100.000 x g i 1 time ved 4 ° C under anvendelse 100Ti rotor (Beckman Coulter). De pelleterede exosomer blev blandet med lige mængder af frisk fremstillet 2% glutaraldehyd i PBS, inkuberet natten over ved 4 ° C, efterfikseret med 1% osmiumtetroxid i PBS ved 4 ° C i 2 timer, og dehydreres i en gradueret serie af ethanol. Efter dehydrering blev prøverne overført til propylenoxid og indlejret i epoxyharpiks Quetol 812 (Nisshin EM). Ultratynde snit blev skåret med Ultracut UCT (LEICA), farvet med uranylacetat og bly citrat og observeret med JEM-1230 (JEOL). Immunoelektron mikroskopisk analyse blev udført ifølge fremgangsmåden beskrevet af Xiao et al. [43] med mindre modifikationer. Kort fortalt blev exosomer blandet og inkuberet med muse-anti-humant CD63-monoklonalt antistof (katalog nr. Sc-51.662, Santa Cruz) i 1 time ved stuetemperatur. Prøven blev dryppet på membranoverfladen af en kobbernet (collodium /carbon overtrukket 400 mesh, Nisshin EM) og inkuberet i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask med PBS, immunoguld konjugeret ged anti-mus IgG (katalog nr. EM.GMHL15, BBInternational) fortyndet til 1:20 blev dryppet på membranen. Den kobbernet flød i dråberne med dens membranoverflade konfronteret ned ved stuetemperatur i 30 min. Efter vask med PBS blev uranylacetat dråber kastes på kobbernet overflade og farvet ved stuetemperatur i 30 s. Exosomer med sorte kolloide guldpartikler på kapsel-membraner blev markeret som positiv under transmission elektronmikroskop. Celler og exosomal fraktioner blev vasket, resuspenderet i en lysepuffer [7,5 M urinstof (Sigma-Aldrich), 2,5 M thiourinstof (Sigma-Aldrich), 12,5% glycerol (Wako), 50 mM Tris, 2,5% n-octyl-beta-D-glucosid (Sigma-Aldrich), 6,25 mM Tris (2- carboxyethyl) phosphin, hydrochlorid (Sigma-Aldrich), 1,25 mM proteasehæmmer (katalog nr. P2714, Sigma-Aldrich)], og inkuberet i 1 time ved 4 ° C under anvendelse af Rotator RT-50 (TAITEC). Efter centrifugering ved 14.000 x g i 60 minutter ved 4 ° C blev supernatanten opsamlet og proteinkoncentration blev bestemt ved Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad). En portion af proteiner (10 ug) blev denatureret ved kogning i Laemmli-prøvebuffer, kørt på 10% SDS-polyacrylamidgeler og overført til Immobilon-P-PVDF-membraner (0,45 um porestørrelse, Millipore). Blottene blev blokeret i 1 time med 5% fedtfri tørmælk i Tris-bufret saltvand indeholdende Tween 20 (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl og 0,01% Tween 20). Efter blokering blev membranerne inkuberet med hvert primært antistof eller antiserum herunder kanin-anti-Tsg101 serum (katalog nr. T5951, Sigma-Aldrich), gede-anti-Aip1 /Alix serum (katalog nr. Sc-49.268, Santa Cruz), muse-monoklonalt anti-CD29 /β1-integrin (katalog nr. sc-610.468, BD Biosciences) og monoklonalt muse-anti-Bip /Grp78 (katalog nr. 610.979, BD Biosciences) ved en fortynding på 1:200 i 1 time ved stuetemperatur. Blottene blev derefter inkuberet med det tilsvarende anti-IgG sekundært antistof konjugeret med peberrodsperoxidase (Jackson Laboratories) ved en fortynding på 1:2,000 i 1 time ved stuetemperatur. Specifikke proteiner blev visualiseret ved hjælp af ECL-systemet (GE Healthcare) og FUJIFILM Selvlysende Image Analyzer LAS3000 (Fuji Film). Molekylvægten protein blev udledt under anvendelse af Precision Plus Protein Standards (Bio-Rad Laboratories). I RNA-isolering fra dyrkningsmediet blev celler podet som beskrevet ovenfor. 48 timer efter dyrkes, dyrkningsmedium blev opsamlet og centrifugeret ved 800 x g i 5 min og yderligere 2.000 x g i 10 min. Supernatanten blev underkastet filtrering på en 0,22 um pore polyethersulfon membranfilter (Corning), efterfulgt af koncentrering med en 5.000 MW afskæringsmembran (Centricon Plus-70, Millipore). Det endelige volumen af supernatant var ca. 10-20 ml fra det oprindelige volumen af 250-500 ml. Supernatanten blev blandet med tilsvarende volumen af QIAzol Lysis Reagent (Qiagen) og fulgte proceduren for RNA-isolering er beskrevet nedenfor. Totalt RNA blev isoleret fra celler, exosomer eller dyrkningsmedier ved hjælp af miRNeasy Mini Kit (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. At fjerne genomisk DNA, 40 ug af cellulært total RNA blev inkuberet med 40 enheder RQ1 RNase-fri DNase (Promega) ved 37 ° C i 30 min i nærvær af 40 enheder RNasin Plus RNase Inhibitor (Promega). For total RNA fra exosomer og dyrkningsmedier blev alle mængder af råprodukter behandles på samme procedure bortset fra brugen af 5 U DNase. RNA blev oprenset under anvendelse af RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. De RNA-prøver blev kvantificeret med en NanoDrop spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific) og vurderet ved hjælp af Agilent Small RNA Kit og Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). For miRNA profilering, 100 ng og 20 ng af cellulære og ekstracellulære totale RNA'er henholdsvis var fluorescens-mærket ved anvendelse af miRNA Complete mærkningsreagens og Hyb Kit (Agilent Technologies) ifølge producentens protokol (Agilent miRNA microarrays version 2.2). Den omfattende miRNA analyse blev udført ved hjælp af menneskelige miRNA Microarray Kit (8 × 15 K) Ver.3.0 (Agilent). Hybridiseringssignaler blev påvist med DNA Microarray Scanner (Agilent Technologies). De scannede billeder blev analyseret under anvendelse af Agilent Feature Extraction software og dataanalyse blev udført under anvendelse af GeneSpring GX software (Agilent Technologies). De data, der omtales i dette manuskript er deponeret i NCBI s Gene Expression Omnibus (GEO) og er tilgængelige via GEO Series tiltrædelse nummer GSE21350: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc = GSE21350). revers transkription (RT) og kvantitativ RT-PCR for miRNA-analyse kvantitativ miRNA niveauer blev bestemt ved hjælp af real-time RT-PCR med Applied Biosystems 7900 HT Sequence Detection System (Applied Biosystems), TaqMan® Gene Expression assay (Applied Biosystems) til human lad-7a (assay ID 000.377), lad-7b (assay ID 002.619), lad-7c (assay ID 000.379), lad-7d (assay ID 002.283 ), lad-7e (assay ID 002.406), lad-7f (assay ID 000.382), lad-7 g (assay ID 002.282), lad-7i (assay ID 002.221), og U6 snRNA (assay ID 001.973) som en endogen kontrol . Ti ng af total RNA blev udsat for revers transkription med TaqMan® Universal PCR Master Mix Ingen AmpErase (Applied Biosystems), og de respektive TaqMan® reagenser til target gener. RT-PCR blev udført i et samlet volumen på 20 pi reaktionsblanding ifølge producentens protokol. Amplifikation blev udført som følger: 95 ° C i 10 minutter, 40 cykler ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 60 s. Prøver blev analyseret i tre eksemplarer som biologisk replikat eller firdobbelt som teknisk replikat. De miRNA niveauer blev defineret ud fra tærsklen cyklus (Ct), den sammenlignende Ct-metoden, og normalisering af niveauet af U6 snRNA i hver prøve. Fold stigninger eller fald i hvert miRNA niveau af celle testede blev fastsat under hensyn til niveauet af AZ-P7a cellelinje linjer. Vi takker medlemmerne af Shizuoka Cancer Center Research Institute for deres mange nyttige forslag. Vi takker også Drs. Yutaka Yonemura og Yoshio Endo for gave af AZ-P7a og MKN45P cellelinjer.
HMGA2
, vores resultater tyder på, at AZ-P7a celler frigiver lad-7 miRNA via exosomer i ekstracellulære miljø for at bevare deres onkogenese
fra dyrkede cellelinier [7] sammen med in vivo
i kropsvæsker [7] herunder blod [8], urin [9], spyt [10], fostervand [11], og maligne pleuraekssudat [12]. Da observeret i mange prolifererende celletyper, er det tænkeligt at forværre tumorceller, hvilket fremgår af deres øgede tilstedeværelse i plasma og pleurale effusioner af patienter med cancer [8], [12]. Denne øgede tilstedeværelse i ikke-invasive kropsvæsker af kræftpatienter har accelereret at profilere molekylære komponenter i exosomer for at opdage klinisk anvendelige tumormarkører og biomarkører [3], [7], [13].
og høj mobilitet gruppe A2 ( HMGA2
) [31], foreslår vi, at AZ -P7a celler selektivt udskiller lad-7 miRNA i det ekstracellulære miljø via exosomer til at opretholde deres tumorigene og metastatiske tilbøjeligheder.
Berigelse af exosomal RNA'er afledt fra AZ-P7a celler
HMGA2
og lad-7 miRNA er nedreguleres i mange kræftformer fra faste organer [31]. AZ-P7a celler besidder en metastatisk evne med peritoneal udbredelse i nøgne mus [32], [33]. Således foreslår vi, at exosomal frigivelse af lad-7 miRNA i det ekstracellulære miljø resulterer i fald i anti-tumorigen virkning i cellerne, som fører til at opretholde deres onkogenese og invasivitet. På den anden side, lad-7 miRNA mindre hyppigt spille et onkogent funktion, på grund af stigning af ekspression ved hypomethylering på lad-7 locus [36] eller målretning caspase-3 mRNA [37]. I dette tilfælde kan exosomal frigivelse af lad-7 miRNA forårsage transformation i målceller ved at overføre deres onkogene egenskaber.
Materialer og metoder
Produktion og isolering af exosomer
Transmissionselektronmikroskopi
Western blot-analyse
RNA Isolation
microarray analyse
Tak
Thiopuriner kan hjælpe med at stoppe viral replikation i menneskelige coronavirus
Menneskelige coronavirus har brug for organiske materialer for effektivt at overføre mellem overflader
Antibiotikum X-206 effektivt mod SARS-CoV-2 in vitro
Fækal transplantation fra visse donorer bedre end andre
Husholdningsdesinfektionsmidler kan bidrage til fedmerisiko hos børn
Genetisk risiko for autoimmunitet kan være forbundet med forskelle i tarmmikrobiom
Vestlig kost kan øge risikoen for 'dødelig sepsis',
advare eksperter Ny forskning udført ved Portland State University tyder på, at den vestlige kost kan øge risikoen for alvorlig sepsis og dødelighed fra infektionen. orkanhank | Shuttersto
Nyt værktøj til at tyde tarmmikrobiomet
De millioner af bakterier, der bor i tarmen, spiller en meget vigtig rolle for sundhed og sygdom. Imidlertid, et konstant problem har været den manglende forståelse af den faktiske sammensætning af de
Probiotika kan tilbyde terapeutiske fordele for biopolære patienter
En undersøgelse fra Baltimores Sheppard Pratt Health system har vist, at probiotika kan tjene som en potentiel terapeutisk tilgang til bipolar lidelse og andre psykiatriske tilstande. Kat