PLoS ONE: Small Molecule R1498 som en veltolereret og oralt aktivt kinaseinhibitor for hepatocellulært carcinom og Gastric Kræftbehandling via Målretning angiogenese og mitose Pathways

Abstrakte

Proteinkinaser spiller en vigtig rolle i tumor udvikling og progression. Masser af kinase hæmmere har indgået marked og viser lovende kliniske fordele. Her rapporterer vi opdagelsen af ​​en ny lille molekyle, veltolereret, oralt aktiv kinase inhibitor, R1498, majorly målrette både angiogene og mitotiske veje til behandling af hepatocellulært carcinom (HCC) og gastrisk cancer (GC). En række biokemiske og cellebaserede analyser indikerede, at målkinasen klynge af R1498 inkluderet Aurora kinaser og VEGFR2 et al. R1498 viste moderat in vitro
væksthæmning på et panel af tumorceller med IC50 af mikromol rækkevidde. in vivo
anti-tumor effekt af R1498 blev evalueret på et panel af GC og HCC xenografter i en parallel sammenligning med en anden multikinasehæmmer, sorafenib. R1498 viste overlegen effekt og toksicitet profil løbet sorafenib i alle testmodeller med > 80% tumor væksthæmning og tumorregression i nogle xenogratfts. Den terapeutiske potentiale R1498 blev også fremhævet af dens effektivitet på tre humane GC primær tumor afledt xenograftmodeller med 10-30% tumorregression sats. R1498 blev vist til aktivt hæmme Aurora A-aktivitet in vivo
, og mindske vaskularisering i tumorer. Desuden R1498 præsenterede god in vivo
eksponering og terapeutisk vindue i de farmakokinetiske og dosis range finding studier. Specialer beviser tyder på, at R1498 er en potent, veltolereret, oralt aktiv multitarget kinase inhibitor med en unik antiangiogene og antiproliferativ profil, og yde stor tillid til videreudvikling for HCC og GC terapi

Henvisning:. Zhang C, Wu X, Zhang M, Zhu L, Zhao R, Xu D, et al. (2013) Small Molecule R1498 som en veltolereret og oralt aktivt kinaseinhibitor for hepatocellulært carcinom og Gastric Kræftbehandling via Målretning angiogenese og mitose Pathways. PLoS ONE 8 (6): e65264. doi: 10,1371 /journal.pone.0065264

Redaktør: Claude Prigent, Institut de Génétique et Développement de Rennes, Frankrig

Modtaget: Februar 22, 2013; Accepteret: April 23, 2013; Udgivet: 5 juni 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser: Alle forfattere er medarbejdere eller tidligere medarbejdere i Roche R & D center (Kina) undtagen Taiping Chen. , der er ansat i et CRO selskab ved navn Crown Bioscience Inc. Beijing, Kina. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Proteinkinaser tjene som mål for terapeutisk intervention i kræftsygdomme, som er valideret og bevist af vellykket og bred anvendelse af protein kinase inhibitorer i flere kræftformer, enten som enkeltstof eller i kombination regimer. Men som en heterogen sygdom forårsaget af akkumulerende multi-genmutationer i stedet drives af enkelt kinase mutant, cancere, der holder god respons på enkelt middel terapi er meget begrænsede. Hertil kommer, at erhvervet resistens af tumorer hjælpe sig selv hurtigt unddrage fra kemoterapi, derefter tilbagefald. Den komplekse afvigende signalering i kræft tiltrækker udviklingen af ​​strategier, der er rettet mod flere biologiske veje er relevante for tumor biologi såsom spredning, metastaser og anti-apoptose. En strategi indebærer rationelle lægemiddelkombinationer. For eksempel kombinationen af ​​VEGF målrettede monoklonale antistof med konventionel kemoterapi har vist signifikant overlevelsesfordel i bryst, colon og lungecancere [1]. En anden strategi er at udvikle de forbindelser, der dækker flere mekanismer i en enkelt agent. Denne fremgangsmåde har flere potentielle fordele i forhold til kombination strategier, herunder enkelhed udviklingsvej, hastighed til markedet, og mindre overlap af bivirkninger. I øjeblikket er multikinasehæmmer, sorafenib bruges som første linie behandling for avanceret og metastatisk HCC med forbedring af median overlevelse fra 7,9 måneder (placebogruppen) til 10,7 måneder [2]. Men behandling med sorafenib resultater i statistisk signifikante, men klinisk mild, forbedringer i samlet overlevelse, tid til progression og sygdomskontrolrate [3]. I mellemtiden er traditionel cisplatin-baseret behandling stadig meget udbredt i kliniske indstillinger for avanceret og metastatisk GC. For HER2 /neu overekspression gastriske adenokarcinomer, trastuzumab i kombination med kemoterapi forlænger den mediane samlede overlevelse fra 11,1 måneder (kemoterapi alene) til 13,8 måneder [4]. Selvom companioned diagnostisk metode blev etableret for at skærmen target patienter, trastuzumab har ingen aktivitet i et stort undergruppe af patienter, der huser højt HER2 /neu med årsagen til at identificere [5]. I betragtning af den høje dødelighed af HCC og GC og aktuelle behandlingsregimer med begrænset resultat, er der stadig stor udækket medicinsk behov for begge typer kræft.

Angiogenese baseret kræftbehandling, herunder anti-VEGFR-2-antistof, små molekyler mod VEGFR -2 signalering [6], [7], og VEGFR kimære protein [8], har vist sig at være en effektiv strategi til behandling af flere typer kræft. Desuden ville effektiviteten af ​​multikinasehæmmer inhibitorer sunitinib og sorafenib delvis tilskrives VEGF-signalering blokering [9]. Men en række patienter er uløseligt resistent eller udvikle resistens over for anti-antiangiogenisk terapi efter flere behandlingscykler [10], [11]. Således er kliniske forsøg kombinerer angiogene inhibitorer og medikamenter med alternativ virkningsmekanisme forventes at forbedre effektivitet eller overvinde modstanden mod antiangiogenisk behandling [12]. Det har været almindeligt anerkendt, at overekspression af aurora kinaser i forskellige kræftformer er involveret i processen med tumorigenese [13], [14]. Aurora-kinase inhibitor VX-680 var i stand til effektivt at hæmme væksten kræftceller in vitro
in vivo
, og efterfølgende indgik i kliniske forsøg, hvilket tyder på, at Aurora kinaser er druggable mål [15] .

i lyset af de akkumulerende beviser på angiogenese og Aurora-kinaser i kræft og deres terapeutiske værdier bevist af de biologiske og små molekyler hæmmere, opdagede vi en kinase inhibitor, R1498, som væsentligt påvirket de vigtigste veje for angiogenese og mitose. R1498 har unikke kinase hæmning profil, høj potens, og god farmakokinetiske og toksikokinetiske profiler, alle disse støtter videre klinisk udvikling.

Materialer og metoder

Etik Statement

brug og pleje af forsøgsdyr blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC), Roche R &D center (Kina). Crown Bioscience, en CRO service virksomhed forpligtet til at beskytte patienternes privatliv og til at følge alle de etiske principper for patient afledte materialer, der indsamles frisk kasserede humane tumorprøver, med IRB (lokale hospital tilsvarende udvalg) godkendelse og patientorganisationer krav til samtykke. Alle cellelinier blev købt fra ATCC, USA, eller Shanghai Institutes of Biokemi og Cellebiologi, Chinese Academy of Science

Forbindelser

R1498 (renhed > 98%). Blev syntetiseret af Roche R & D center (Kina). For enzymatiske assays og in vitro Salg cellebaserede assays, R1498 blev opløst i DMSO som 0,01 mol /l stamopløsning. For dyreforsøg, blev R1498 opløst i 1% Klucel EF /0,1% polysorbat 80 /0,09% methylparaben /0,01% propylparaben vand, blev fremstillet på en ugentlig basis. Sorafenib blev syntetiseret af Roche R &D Center (Kina) og opløst i cremophor EL /ethanol (50:50, Sigma) at udarbejde en 5 mg /ml stamopløsning, folie indpakket, og opbevares ved stuetemperatur. Denne stamopløsning var frisk tilberedt hver 3 dage. Afsluttende dosering blev fremstillet på dagen for brug ved at fortynde stamopløsningen med steriliseret vand.

cellelinier

Alle cellelinier fra American Typisk Collection Center (ATCC) og Cell bank, Shanghai Institutes for Biokemi og Cellebiologi, blev kinesiske videnskabsakademi opretholdt ved 37 ° C med 5% CO _{2 befugtet atmosfære i vækstmedium anbefale af forhandlerne og udsat for in vitro
analyser mellem passager 8~15 , de cellelinjer til dyreforsøg var mellem passagerne 5~10. Human navlevene endotelcelle (HUVEC) opnået fra Allcells (Emeryville, CA) blev holdt i EGM-2 (Lonza Allendale, NJ) med endotelcellevækst kosttilskud og 10% føtalt bovint serum (Invitrogen, Carlsbad, CA).}

celleproliferationsassay

Hver cellelinje blev podet i en 96-brønds vævskulturplade (Corning, NY) ved en forudbestemt densitet i 180 pi komplet medium, fastgjort natten over og behandles med forbindelsen for en anden 72 h. Derefter blev mediet bortkastet og erstattet med 10% CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) i komplet medium, derefter inkuberet pladerne i yderligere 2 timer. OD _{450 blev målt med SpectraMAX 190 spektrofotometer (MDS, Sunnyvale, CA). En baggrund absorbans på OD blank blev trukket fra alle brønde. Så hæmning rate (IR) blev bestemt med følgende formel:. IR (%) = (OD DMSO-OD forbindelse) /OD DMSO × 100%}

I VEGF-induceret HUVEC proliferation assay HUVEC'er suspenderet i 170 pi EGM-2 med 0,5% FBS blev udsået og inkuberet natten over. Efter at cellerne er knyttet, 10 pi 1 ug /ml rekombinant human VEGF 165 (R &D Systems, Minneapolis, MN) tilsat til hver brønd sammen med 20 pi sammensatte opløsninger fremstillet i EGM-2 med 0,5% FBS. CCK-8 assay som ovenfor blev anvendt til bestemmelse af cellelevedygtighed.

kinaseassays

Affiniteten af ​​R1498 mod 402 kinaser blev bestemt ved KINOMEScan® (Ambit Biosciences, San Diego, CA) og data blev præsenteret som dissociationskonstant (Kd) værdier [16]. Inhiberingen på kinaseaktiviteten af ​​Aurora kinaser og VEGFR2 blev yderligere karakteriseret ved Z'-Lyte kinase aktivitetsassays under tilsvarende ATP-koncentrationer.

HUVEC Tube Formation Assay

HUVEC kanaldannelse assay blev udført som tidligere rapporteret [17]. Kort fortalt blev Matrigel ™ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) optøet ved 4 ° C i 3~4 timer. 100 pi flydende Matrigel ™ blev tilsat til forafkølet 96-brønds vævskulturplade, og pladen blev inkuberet ved 37 ° C, 5% CO _{2 fugtig atmosfære i 1 time til at størkne Matrigel ™. Den HUVEC'er blev dyrket i EGM-2 med 0,5% FBS natten over, og podet i 90 pi EGM-2 med 0,5% FBS ved en tæthed på 2,2 x 10 ^{5 celler /ml på Matrigel ™ overtrukne plade. Cellerne blev behandlet ved forbindelse eller ækvivalent mængde af DMSO. Pladen blev inkuberet ved 37 ° C, 5% CO 2 befugtet atmosfære i 7 timer, hvorefter celle morfologi blev fanget med fasekontrastmikroskop (IX71, Olympus, Hamburg, Tyskland).}}

Western Blot

cellelysat blev fremstillet i RIPA-buffer og kvantificeret ved bicinchoninsyre (BCA) -metoden (Pierce, Rockford, IL). Tredive mikrogram protein pr prøve blev sat på en 4~12% NuPAGE® Novex SDS-gel (Invitrogen). Proteinet blev overført af en iBlot® tør blotting indretning (Invitrogen) på nitrocellulosemembraner. Efter blokering uspecifik binding med TBS /Tween 20 (0,1%) (TBS /T) indeholdende 5% fedtfri mælk i 1 time ved stuetemperatur blev membranen inkuberet i phospho-Aurora A (Thr288) (C39D8) kanin-monoklonalt antistof ( Cell Signaling Technology, CSTij9, Beverly, MA) eller phospho-Histone H3 (Ser10) kanin-polyklonalt antistof (CSTϊ1) (1:1000 i TBS /T indeholdende 3% bovint serumalbumin (BSA), og forsigtigt rystet ved 4 ° C natten over. membranen blev vasket med TBS /T tre gange for at fjerne ubundet antistof, derefter inkuberet med det sekundære antistof (HRP-konjugeret ged anti-mus IgG eller gede-anti-kanin IgG, 1:10000, KangChen Biotech, Shanghai, Kina) i 1 time ved stuetemperatur, henholdsvis. Proteinbånd blev visualiseret med et forøget kemiluminescens (ECL) kit (Pierce, Rockford, IL). Salg

Immunofluorescens Salg

Celler podet på kammeret objektglas blev fikseret i 4% paraformaldehyd ved stuetemperatur, derefter permeabiliseret med 0,15% Triton-X100 i TBS og blokeret i 3% BSA i TBS /T. De primære antistoffer (phospho-Aurora A (Thr288) (CSTĵ7), phospho -Histone H3 (Ser10) (CSTϊ1) og MPM2 (anti-phospho-Ser /Thr-Pro) Millipore-368) blev inkuberet med lysbilleder i en våd kammer ved 4 ° C natten over. De sekundære antistoffer Alexa Fluor® 488 gede-anti-kanin IgG (H + L) eller Alexa Fluor® 594 gede-anti-muse-IgG (H + L) (Invitrogen) blev anvendt til henholdsvis en time efter objektglassene blev vasket med TBS grundigt. Efter de ubundne antistoffer blev fjernet, blev objektglassene tørret og monteret med DAKO antifide monteringsmedium. Billederne blev taget med IX71 under passende excitation og emission filtre.

flowcytometri

DNA-indholdet blev målt med en FACS-Calibur cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA) og cellecyklusfordeling blev beregnet som tidligere beskrevet [18].

tubulin in vitro
polymerisation assay

In vitro
tubulinpolymerisation assay blev udført som tidligere beskrevet [18 ]

enkeltdosis farmakokinetisk (SDPK) Undersøgelse

anvendelse og pleje af forsøgsdyr blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg, Roche R &. D center (Kina). Mandlige nøgne mus (kropsvægt: 19 til 24 g) blev anvendt i SDPK undersøgelse. Før farmakokinetisk undersøgelse blev dyrene randomiseret til stikprøvespørgsmålene grupper (3 dyr pr tidspunkt). Ti yderligere mus blev anvendt til opsamlet plasma blank for kalibreringskurver. Musene blev fastet natten før oral indgivelse.

Blodprøver blev opsamlet ved retro-orbital punktur ved prædosis og 0,033, 0,083, 0.25,0.5, 1, 2, 4, 6, 8, og 24 timer efter dosering. Plasmaprøverne og dosis formulering blev opbevaret ved -20 ° C indtil bioanalyse. erhvervelse og kontrol af data system blev skabt ved hjælp af Analyst 1.4 software fra ABI Inc. Koncentrationerne i plasma under grænsen for kvantificering (LOQ = 1 ng /ml) blev udpeget som nul. Den farmakokinetiske dataanalyse blev udført ved anvendelse noncompartmental analyse moduler i WinNonlin Professional V5.2 (Pharsight, USA) .Den biotilgængelighed blev beregnet som F (%) = (Dose _{iv × AUC po (0-∞)) /(Dosis po × AUC iv (0-∞)) * 100%. For rotte, hund og abe SDPK blev blodprøver indsamlet fra halsvene punktering.}

xenotransplantat effektstudie med cellelinjer og Patient Afledt Tumorer

Anvendelse og pleje af forsøgsdyr blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg, Roche R &D center (Kina). Tumor celler blev podet ind i den højre flanke af BALB /C nu /nu
kvindelige nøgne mus (5~6 uger, 16~18 g, opnået fra kinesisk-britiske SIPPR /BK Lab. Animal Ltd, Shanghai, Kina) ved optimal tæthed baseret på vores interne validering undersøgelse. Efter tumoren blev etableret og nåede 100~150 mm ^{3, musene blev randomiseret i ti mus per gruppe og modtog behandling i henhold til tidsplanen. Den tumorvækst blev registreret tre gange om ugen med måling af længde (L) og bredde (W) af skydelære, og beregnet som tumorvolumen (TV, mm 3) = 0,5 * L * W * W (mm) . Tumorvækstinhiberingen blev beregnet som TGI% = (1- (gennemsnitlig tumorvolumen i behandlingsgruppen på den første dag-gennemsnit tumorvolumen af ​​behandlingsgruppen på enden dag) /(gennemsnitlig tumorvolumen i kontrolgruppen på den første dag-gennemsnit tumorvolumen for kontrolgruppen på enden dag)) × 100%. Tumoren regression af individuelle mus blev defineret -. Tumorvolumenet i slutningen var mindre end det tumor volumen, når behandlingen blev indledt}

I humane primære tumor-modeller blev friske humane gastrisk tumorvæv direkte implanteret i nonobese diabetiker og svær kombineret immun-deficiente (NOD-SCID) mus inden for 5 timer efter kirurgi med 5 mm ^{3 fragmenter at etablere primære tumor xenograftmodeller. Hver tumor model blev verificeret ved mindst tre serielle in vivo
passager at demonstrere engraftment stabilitet. Tumorer fra passager 4-7 blev subkutant inokuleret med trokarer til højre flanker på BALB /c nu /nu nøgne hunmus (5~6 uger, 16~18 g). Behandlingen begyndte, da tumor volumen nåede 100~150 mm 3. tumor måling og drift-protokol var den samme som cellelinie afledt tumor model.}

Immunhistokemi

De 8 um paraffin indlejret tumor væv slides fremstillet af tumor af in vivo
effekt undersøgelser blev opvarmet i en tør ovn ved 60 ° C i 1 time, derefter afparaffiniseret og hydrolyseret ved Leica automatiske farvningsanordning XL ST5010 ved stuetemperatur. Antigen genfinding blev udført ved 95~99 ° C i citratpuffer (0,01 M, pH 6,0) opvarmes af en medicinsk mikrobølge ved 92-98 ° C i 5 minutter, derefter afkølet til stuetemperatur. Derefter peroxidase-blokerende reagens (DAKO, DK-2600, Glostrup Danmark) blev påført for at standse endogen peroxidaseaktivitet. Objektglassene blev inkuberet i blokerende serum i 20 min, derefter dækket med 100 pi phospho-Aurora A (Thr288) (C39D8) kanin mAb (CSTij9, 1:200 i TBS /T) eller kanin-anti-humant CD31-polyklonalt antistof ( Santa Cruz Biotech, sc-8306, Santa Cruz, CA, USA; 1:200 i TBS /T) ved 4 ° C natten over, derefter inkuberet i 100 pi DAKO Envision + /HRP, kanin /mus efter at være blevet vasket grundigt med TBS. Et hundrede mikroliter substrat-chromogen opløsning (DAB) blev påført objektglassene og inkuberes ved stuetemperatur i 10 min. Objektglassene blev skyllet forsigtigt med postevand i 15 minutter. Counterstain og dehydrering blev udført ved XL ST5010 ved stuetemperatur. Endelig blev objektglassene monteres med Permount montering medium (Fisher Scientific, Miami, FL).

Dose Range Finding og Toksikokinetisk Study

Dose range finding og toksikokinetiske undersøgelse blev udført i rotter og Beagle hunde baseret på in vitro
metabolitter identifikation. Wistar-rotter (hanner: 3, kvindelige 3 i hver gruppe, fra Vital River, Beijing, Kina) blev fastet natten over, og derefter modtog test- artikler som 0, 6,25, 50 og 100 mg /kg to gange dagligt pr oral sonde for en 14 -dag kontinuerlig regime. Motilitet observation blev påført på en daglig baser for at finde den maksimale tolerante dosis for dyrene. Dyrene blev aflivet på D14, og følgende toksikologi observation blev udført herunder ændringer i kropsvægt, klinisk observation, makroskopisk, hæmatologi kemi og histopatologi. På dag 1 og dag 14 blev blodprøver opnået via halsvene punktur fra alle dyr (hvis levende, under anvendelse EDTA-K2-rør). Prøver blev blandet forsigtigt og placeres på knust våd-is indtil centrifugering, som blev udført straks. Prøverne blev centrifugeret i ca. 15 minutter ved 4 ° C 2.700 rpm. Den resulterende plasma blev separeret, overført til entydigt mærkede klare polypropylenrør og straks nedfrosset i fast carbondioxid (tøris), indtil overført til ca. -80 ° C. Hvert dyr blev åreladet ved følgende tidspunkter: ca. 5 min, 15 min, 30 min, 1, 2, 4, 8 og 24 timer efter den første dosis på selve dagen. De medikamentkoncentrationer i plasmaet blev bestemt ved LC-MS /MS. Den farmakokinetiske analyse blev udført ved anvendelse af WinNonlin software (Version 5.2, Pharsight Corporation, CA, USA), og de farmakokinetiske parametre blev beregnet ved anvendelse af en ikke-kompartment model metode. Salg

beaglehunde (ca. 8-10 måneder, fra Beijing Marshall Biotechnology Co. Ltd., Beijing, Kina) blev udsat for forsøgsprotokollen, som beskrevet ovenfor. Hver gruppe har en han og en hun hund, doserne af testartiklen var: 0, 1, 7,5 og 15 mg /kg. Brugen og pleje af forsøgsdyr blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg, Roche R &. D Center (Kina)

Dataanalyse og statistik

Uafhængig t-test blev anvendt til kontinuerlig data analyse, og χ2 test blev anvendt til kategoriske data. Data blev betragtet som signifikante, når p-værdier var. ≪ 0,05

Resultater

1. Karakterisering af R1498 som en multikinasehæmmer,

Pyrazolobenzodiazepine analog R1498, med et stillads baseret på fusionen af ​​et benzodiazepin og pyrazolring (figur 1A), er tidligere blevet identificeret til at være en svag cyclin-afhængig kinase 2 (CDK2) inhibitor [19]. Dette molekyle viste karakter af en multikinasehæmmer, når vi analyserede kinaseinhibitor bibliotek. Den kinaseinhibering profil R1498 (1 uM) blev karakteriseret via KINOMEScan® i ATP-koncentration omkring Km af hver kinase. Inhiberingen på R1498 er over 80% mod 39 kinaser ud af 402 kinaser, herunder 359 vildtypekinaser og 43 kinase mutanter (Figur S1). Dissociationskonstanterne (Kd) af 39 hit kinaser blev derefter bestemt, og kinaserne med Kd < 0,2 uM blev vist i figur 1B. De fleste af de potentielle hits tilhører tyrosinkinasen (TK) familie og AGC familie. Desuden blev Z-Lyte assay udføres for yderligere bestemmelse af kinasen hæmning aktivitet af R1498. Resultaterne viste, at IC50'er af R1498 var 25 ± 6, 67 ± 4, 167 ± 13 nM mod VEGFR2, Aurora kinase A og B henholdsvis (figur 1C). Derefter vores undersøgelse blev fokuseret på de antiangiogene og anti-mitotiske pathways majorly ramt af R1498.

Et panel af 16 cancercellelinjer, herunder leverkarcinom, mavekræft og nasopharyngeale carcinomer cellelinier, blev anvendt til at bestemme in vitro
anti-spredning evne R1498. De fleste af de cellelinier etableret fra asiatiske cancere, som de asiatiske udbredte kræftformer er vores fokus. Den leverkarcinom og gastrisk cancercellelinie panel var mere følsomme over for R1498 behandling end nasopharyngeale cancercellelinier. Gennemsnitskoncentrationer IC50'er var 7,81, 7,55 og 30,07 uM, svarende til epatocellular carcinoma, gastrisk cancer, og nasopharyngeale carcinomer cellelinier hhv. Følsomheden af ​​cellelinjer afledt af asiatiske befolkning (BEL-7402, QGY-7701 og QGY-7703) var sammenlignelig med følsomheden af ​​Hep3B der var fra kaukasisk (Figur 1D).

2. R1498 Hæmmer Aurora kinaser og inducerer cellecyklusstop

Aurora kinase hæmning af R1498 blev visualiseret ved immunfluorescens i mavekræft cellelinje SGC-7901. Direkte phosphoryleringssteder phospho-Aurora kinase A (T288) og phospho-histon H3 (S10) blev anvendt til at indikere kinaseaktiviteten af ​​Aurora A og B henholdsvis [20], [21]. Phospho-Ser /Thr-Pro Mitotisk protein monoklonalt(MPM2) blev anvendt som en mitotisk markør (rød) til mærkning mitotiske celler. Aurora kinase A (T288) phosphorylering forekommer i centrosom af mitotiske celler (grøn). Efter cellerne blev behandlet med 5 uM MR1498 i 24 timer, Aurora A T288 grøn foci i mitotiske celler blev svagere eller forsvundet (figur 2A, øverste panel), der viser, at aktiviteten af ​​Aurora kinase A faldt på R1498 behandling. Phosphoryleringen af ​​histon H3 (S10) er hovedsageligt lokaliseret i centromerer i mitotiske celler. Efter at cellerne var behandlet med R1498, phospho-histon H3 (S10) faldt kraftigt (grøn). Denne observation tydede på, at aktiviteten af ​​Aurora kinase B også faldet ned på R1498 behandling. Disse resultater fra immunofluorescens blev bekræftet ved Western blot. Som vist i figur 2B, phosphorylering af phospho-Aurora kinase A (T288) og phospho-histon H3 (S10) faldt i en koncentrationsafhængig måde ved akut behandling af R1498.

Inhibering af Aurora-kinaser A og B producerer forskellige fænotypiske ændringer i cellecyklus. Undertrykkelse af Aurora A inducerede cellecyklus G2 fasen [22], mens inhibering på Aurora kinase B er rapporteret at forårsage polyploidi i celler som følge af endoduplication uden cytokinese [15]. Efter at cellerne var behandlet med 10 pM R1498, både SGC-7901 (mavekræft celle) og BEL-7402 (hepatocellulært carcinom celle) viste G2 /M-fase standsning og akkumulation af polyploide celler. For BEL-7402, cellerne distribuerer i G2 /M faser steget fra 25,6% til 57,0%, i mellemtiden, cellerne med > 4 N DNA-indholdet steg fra 6,7% til 17,6%. SGC-7901 var mere følsom, med G2 /M population steg fra 25,2% til 75,5%, og polyploide celler steg fra 3,1% til 21,6% (Figur 2C). Mikrotubulus stabilisator (f.eks taxol) og destabilisator (f.eks colchicin) vil forårsage G2 /M-fase standsning samt. At forstå, om R1498 er en mikrotubulus målrettet reagens, in vitro
tubulinpolymerisation assay blev udført. Dataene viste, at R1498 hverken stabiliseret eller destabiliseret mikrotubulus polymerisation selv under høj R1498 koncentration (40 uM) in vitro
(figur 2D), hvilket antyder, at cellecyklussen G2 /M arrest ikke var forårsaget af mikrotubuluscytoskelettet forstyrrelse. Taget sammen foreslår disse data, at R1498 inhiberede Aurora-kinaser A og B i celler og produceret de fænotypiske forandringer i cellerne.

3. R1498 antagoniserer Angiogenese Udvikling af humane endotelceller

Angiogenese blev initialiseret ved sekretion af angiogen vækstfaktor fra tumorceller, og derefter endothelcellerne prolifererer, migrerer og formen fartøj rør i reaktioner på VEGF stimulation. For at løse specificiteten af ​​R1498 antagonisere endotelcellevækst stimuleret af VEGF blev humane navlevene-endotelceller (HUVEC'er) udsat for to forskellige stimuli, VEGF og FBS, under behandlingen af ​​R1498 i 72 timer. Under de dyrkningsbetingelser, der indeholder VEGF eller FBS, viste HUVEC'er anderledes reaktion på R1498. De IC50-værdier var 89 og 2064 nM for VEGF og FBS, henholdsvis; disse foreslog, at R1498 antagoniserede HUVEC vækst drevet af VEGF mere potent end med FBS (figur 3A). I HUVEC rørdannelse assay efter 8 timers udsættelse for R1498, HUVEC'er dannet færre intakte rør masker end DMSO behandlede grupper (figur 3B). R1498 påvirkede ikke HUVEC proliferation under denne behandling tilstand (data ikke vist).

4. R1498 Undertrykker væksten af ​​humane Cancer Xenografter

De farmakokinetiske egenskaber med enkelt dosis af R1498 i flere arter, blev bestemt. Halveringstiden tid (T1 /2) og oral biotilgængelighed (Oral BA%) begunstiger yderligere effektstudie i nøgne mus (tabel S1) med en to gange dagligt oral sondeernæring tidsplan. Et panel af xenografter herunder asiatisk mavekræft, leverkarcinom og nasopharyngeal kræft var ansat til sammenligning mellem R1498 og anden multikinasehæmmer, sorafenib (figur 4, tabel S2). Sorafenib er godkendt som første linie behandling for leverkarcinom [2], og er i kliniske forsøg for kombinatorisk behandling for avanceret mavekræft [23]. Den parallelle sammenligning bestod af tumorvækst inhibering, regression og ændringer i kropsvægt af dyr med dosering på 25 mg /kg, to gange dagligt peroralt. I alle testede xenotransplantater viste R1498 bedre tumorvækst hæmning rate (TGI%) i løbet af sorafenib. For leverkarcinom, at TGI% af R1498 er 10-19% mere end TGI% af sorafenib for mavekræft, 2-12% i løbet af TGI% af sorafenib. Regressionen på tumor blev også inkorporeret som et andet terapeutisk slutpunkt. I leverkarcinom panel blev tumorregression observeret i BEL-7402 model, 8/10 (80%) dyr havde tilbageskridt i R1498 gruppe, mens 1/10 (10%) dyr havde tilbageskridt i sorafenib gruppe (figur 4, BEL-7402) . For mavekræft panel, MGC-803 og SGC-7901-xenografter havde samme regression sats som svar på de test artikler: 5/10 (50%) for R1498, og 2/10 (20%) for sorafenib (figur 4, SGC -7901, og tabel S2). Baseret på effektmål fra alle 7 testede modeller, R1498 har bedre effekt end sorafenib under samme behandlingsplan. Desuden viste R1498 god effekt på en nasopharyngeal carcinoma xenograft, TGI% af R1498 (90%, 25 mg /kg, to gange dagligt, pr oral sonde) var overlegne i forhold til standard af pleje-cyclophosphamid (60%, hver 10 dage, intraperitoneal injektion) (figur 4, CNE-2). De ændringer i legemsvægt, som blev optaget i alle modeller for toksicitet sammenligning viste, at den nøgne mus viste mere tåleligt for R1498 under hele behandlingen i BEL-7402, SGC-7901 og CNE-2 modeller, selv om vægtøgning faldt en smule 10 dage efter behandling (figur 4, tabel S2). Imidlertid sorafenib forårsagede kontinuerlig dråbe af dyrets legemsvægt. For sorafenib behandlet mus i BEL-7402 og SGC-7901-modeller, den procentdel af kropsvægten tab oversteg 15% på opsigelse dag. Som vist i tabel S2 viste R1498 mindre indvirkning på mus kropsvægt end sorafenib gjorde, som foreslog, at R1498 holdt bedre sikkerhedsprofil.

5. R1498 nedregulerer Phosphorylering af Aurora A og vaskulær Density i Tumor

Phosphoryleret Aurora A (T288) og CD31 i tumorer fra effekten studiet blev anvendt til bestemmelse af on target-effekt af R1498. Tumormassen høstet fra BEL-7402 xenograft undersøgelse blev fremstillet i paraffinindlejrede objektglas og underkastet immunohistochemisty til visualisering angiogenese maker human CD31 og Aurora kinase A-aktivitet markør phospho-Aurora A (T288). I BEL-7402 tumorer, den CD31-farvning af R1498 behandlingsgrupper faldt på en dosis-afhængig måde, som foreslog vaskularisering i tumorer blev hæmmet (figur 5A). Aktiviteten af ​​Aurora kinase A blev også reduceret ved R1498 behandling, som blev afspejlet af den svage farvning af phospho-Aurora A (T288) i R1498 behandlede tumorer (figur 5B).

humane primære gastrisk tumor afledt xenograftmodel blev anvendt til at forudsige effekten til klinisk oversættelse. De ondartede væv tre individuelle mavecancerpatienter blev indpodet i mus, og xenografter afgrænset forskellige vækstkurver in vivo
. De xenotransplantater viste forskellig indvirkning på ændringerne i kropsvægt af værterne. Musene blev behandlet med R1498 (25 mg /kg) i den angivne periode, den endelige TGI% nåede 73,6 ~ 91,6%, med regression satser 10~30%. De begrænsede ændringer i kropsvægt foreslog, at tumorbærende mus var godt tolerante over for R1498 (figur 6).

6. R1498 har God farmakokinetiske profil (PK) og terapeutisk vindue

SDPK viste, at de acceptable biotilgængelighed og halveringstid egenskaber R1498 blandt nøgne mus, rotter og hunde (tabel S1). Poolede levermikrosomer blev anvendt til at forudsige de vigtigste metabolitter i forskellige arter. Rat og beagle hund med lignende mikrosom metabolitter af menneskelig blev brugt i maksimal tolerant dosis (MTD) undersøgelse for at bestemme den terapeutiske vindue mellem effektive og giftige eksponering (Tabel S4). Kvindelige og mandlige rotter viste forskellige svar på de eskalerede doser af R1498.

• PLoS ONE: pyruvatkinase M2 Afspiller en dobbeltrolle på forordning af EGF /EGFR signalering via E-Cadherin-afhængig måde i Gastric Cancer Cells
• PLoS ONE: en prospektiv undersøgelse af forekomsten af ​​postoperativ venøs tromboemboli hos koreanske mavekræft Patienter: en undersøgelse af anvendelsen af ​​de vestlige retningslinjer til asiat…