Mekanisme (r) for underliggende gastrobeskyttende virkning af ethylacetat fraktion opnået fra den rå methanoliske blade ekstrakt af Muntingia calabura

Mechanism (r) for underliggende gastrobeskyttende effekt af ethylacetat fraktion opnået fra den rå methanoliske efterlader ekstrakt af Muntingia calabura
Abstrakt
Baggrund
Muntingia calabura
L. (familie Muntingiaceae), almindeligt kendt som jamaicanske kirsebær eller kerukup siam
i Malaysia, der bruges traditionelt til behandling af forskellige lidelser. Formålet med denne undersøgelse er at belyse de mulige underliggende gastrobeskyttende mekanismer ethylacetat fraktion (EAF) af Muntingia calabura
methanol blade ekstrakt (MEMC).
Metoder
MEMC og fraktioner blev udsat for HPLC-analyse identificere og kvantificere tilstedeværelsen af ​​sine phyto-bestanddele. Mekanismen for gastroptotection af EAF blev yderligere undersøgt ved anvendelse pylorus ligering-induceret gastrisk læsion rottemodellen (100, 250, og 500 mg /kg). Makroskopisk analyse af maven, blev evaluering af parametre gastriske indhold, såsom volumen, pH, frit og totalt syreindhold, protein estimation, og kvantificering af slim udført. Deltagelsen af ​​nitrogenoxid (NO) og sulfhydryl- (SH) forbindelser blev evalueret og superoxiddismutase (SOD), gluthathion (GSH), katalase (CAT), malondialdehyd (MDA), prostaglandin E 2 (PGE 2) og NO niveau i ethanol inducerede maven vævshomogenat blev bestemt.
Resultater Salg HPLC-analyse bekræftede tilstedeværelsen af ​​quercetin og gallussyre i EAF. I pylorus-ligation model, EAF signifikant (p
< 0,001) forhindre gastrisk læsion dannelse. Volumen af ​​maveindholdet og proteinindhold reducerede signifikant (p
< 0,01 og p
< 0,05, henholdsvis), mens frie og totale syreindhold reduceret i doser på 250 og 500 mg /kg (p
< 0,001 og p
< 0,05, henholdsvis). EAF augmented også slim indholdet signifikant (p
< 0,001). Forbehandling med N-nitro-L-arginin-methylester (L-NAME) eller N-ethylmaleimid (NEM) vendt gastrobeskyttende aktivitet af EAF. EAF behandling markant forbedres SOD, GSH og CAT-aktivitet og PGE 2 og NO niveau, mens formildende MDA niveau, i forhold til køretøjet gruppen.
Konklusioner
Afslutningsvis de underliggende gastrobeskyttende mekanismer EAF kan være forbundet med antisekrerende, deltagelse af slim, antiperoxidative, forbedring af antioxidant status, graduering af NO og SH-forbindelser, stimulering af PGE 2 samt tilstedeværelsen af ​​quercetin og gallussyre.
Nøgleord
Muntingia calabura
Fraktion mavesår antisekretorisk Antioxidant Nitrogenoxid sulfhydrylforbindelse Prostaglandin Quercetin Gallussyre Baggrund
mavesår er en af ​​de store gastrointestinale lidelser, der påvirker stort antal mennesker over hele verden, og stadig i forekomst og udbredelse globalt [1]. Nogle forfattere henvise til mavesår som den nye "pest" af det 21. [2] århundrede. Det er blevet fremskrevet, at 14,5 mio af den verdensomspændende befolkning er ramt af mavesår med en dødelighed på 4.080.000 [3]. Patofysiologi mavesår er forbundet med ubalance mellem aggressive og beskyttende faktorer i maven. Maveslimhinden skader opstår, når skadelige faktorer "overvælde" en intakt slimhinde forsvar, eller svækkelse af slimhinde forsvarsmekanismer [4]. De skadelige faktorer i denne sammenhæng indbefatter alkohol indtagelse, syre og pepsin sekretion, dårlig kost, stress, reaktive oxygenarter (ROS), anvendelsen af ​​ikke-steroide anti-inflammatoriske lægemidler (NSAID) og Helicobacter pylori
infektion [5, 6]. På den anden side, de vigtigste forsvarsmekanismer faktorer og mekanismer, der har råd mucosal forsvar indeholde tilstrækkelige mucus-sekretion og mucosal blodstrøm, bicarbonat sekretion, intakt slim barriere, prostaglandiner, overfladeaktive phospholipider, forøgede niveauer af antioxidanter, aktivitet af anti-inflammatoriske forbindelser og tilstrækkelig niveauer af nitrogenoxid (NO) [6-8].
øjeblikket forebyggelse og behandling af mavesår har fået masser af interesse og blev og vigtig udfordring overfor medicin i dag. Til dato er der et par metoder anvendes til at forhindre gastrisk ulceration, såsom potensering af den mucosale forsvar sammen med reduktion af syresekretionen og dens neutralisering, stimulering af gastrisk mucin syntese, forbedring af antioxidantniveauer i maven, og inhibering af Helicobacter pylori
vækst [9]. Sekretion af mavesyre menes at være den centrale del af mavesår trods af tilstedeværelsen af ​​mange forårsagende faktorer [7] og derfor inhibering af mavesyresekretion tendens til at være nøglen terapeutisk mål for mavesår [10]. På den anden side, en anden vigtig faktor i patogenesen af ​​mavesår er produktion af reaktive oxygenarter (ROS). Produktion af ROS og en ledsagende reduktion af antioxidant kapacitet medfører skade på væsentlige cellebestanddele, som er proteiner, lipider og nukleinsyrer, hvilket resulterer i dannelsen af ​​toksiske forbindelser og forårsager celledød på grund af deres ekstreme reaktivitet [8, 11]. Derfor styrer ROS dannelse og mavesyre sekretion er afgørende for behandlingen af ​​disse patologier [12].
Den nuværende medicinske behandling af mavesår omfatter syre blokkere, der reducerer syresekretion, protonpumpehæmmere, antibiotika for at udrydde Helicobacter pylori
og væv foring beskyttelsesmidler såsom sucralfat og bismuth cholinerge [13, 14]. Selvom disse lægemidler er faldet de sygelighed, men de er ofte forbundet med uønskede bivirkninger, såsom hypersensitivitet, impotens, arytmi, hæmatopoietiske lidelser, gynækomasti og antibiotikaresistens i det lange løb [15, 16]. Desuden er disse tilgængelige lægemidler har også høj tilbagefaldsrate, lav effektivitet i gastrisk ulcus behandling og er ofte kostbare [5, 9, 10]. Derfor er der et presserende behov for at opdage et mere effektive og sikre alternative behandlingsformer til behandling af mavesår. I den forbindelse er brugen af ​​lægeplanter vundet interesse og fanget opmærksomheden af ​​mange forskere. Planteekstrakter kan være værdifulde og tjene som en ny kilde til lægemidler i behandlingen af ​​mavesår, hvorved antisekretorisk, cytobeskyttende og antioxidant aktiviteter, isoleret eller i kombination, er de tre vigtigste funktioner i et gastrobeskyttende middel, som spiller den afgørende rolle i maveslimhinden beskyttelse [17].
anlægget Muntingia calabura
L. (familie Muntingiaceae), almindeligt kendt som jamaicanske kirsebær eller kerukup siam
i Malaysia, er vidt udbredt i hele den varme områder i Asien [18]. Flere medicinske anvendelser er blevet dokumenteret på forskellige dele af dette træ i Øst- og Sydøstasien samt tropisk Amerika. Muntingia calabura s
blade, blomster, bark og rødder er blevet brugt som et husråd til behandling af hovedpine, feber og begyndende forkølelse. Ifølge peruvianske folklore, bladene anvendes til at tilvejebringe lindring fra mavesår og for at reducere hævelse af prostatakirtlen [19]. Desuden er de også ansat som antiseptisk, antispasmodic, og antidyspeptic agent [20, 21].
På den anden side, Muntingia calabura
er rapporteret at have en bred vifte af farmakologiske aktiviteter, som er blevet bevist videnskabeligt. Dette omfatter antitumor [20, 22], antibakterielle [23], antinociception [19, 24, 25], anti-inflammatoriske, antipyretiske [25], antioxidant og antiproliferative [26] aktiviteter udvist af bladene af Muntingia calabura
, mens flere typer af forbindelser er blevet isoleret og identificeret fra bladene, rødder og stængel barks Muntingia calabura
[20-22, 27, 28]. Forskellige fytokemikalier er blevet påvist i bladene af Muntingia calabura
såsom flavonoider, saponiner, tanniner og triterpener [29].
I vores tidligere undersøgelse, har vi rapporteret gastrobeskyttende aktivitet af flere fraktioner udvundet af rå methanol ekstrakt af Muntingia calabura
(MEMC) blade mod ethanol-induceret gastrisk læsion i rotter [30]. Fra vores undersøgelse, har vi fundet, at ethylacetat fraktion markant forbedring gastrisk ulceration og udøver den mest effektive beskyttelse sammenlignet med de andre fraktioner. Derfor blev den foreliggende undersøgelse havde til formål at bestemme virkningsmekanismen ligger til grund for profylaktiske virkning af ethylacetat fraktion afledt af MEMC mod gastriske læsioner hos rotter.
Pylorus-ligering model, der anvendes i denne undersøgelse er en af ​​de mest udbredte modeller at undersøge virkningen af ​​lægemidler på mavesyre og slimsekretion. Sår udviklet ved ligering af pylorus ende af maven er forårsaget af stigning i gastrisk saltsyre (HCI) sekretion og /eller stase af syre, hvilket fører til auto fordøjelse af maveslimhinden og opdelingen af ​​de maveslimhinden barriere [31]. Derfor midler, som er i stand til at øge mucus-sekretion (cytobeskyttende) og /eller reducere sekretion af gastriske aggressive faktorer såsom pepsin og syre er effektive gastrobeskyttende midler [32]. På den anden side, den ethanol-inducerede ulcus model er anvendelig til undersøgelse af effektiviteten af ​​potentielle lægemidler eller afprøvning midler, der har cytobeskyttende og /eller antioxidant aktiviteter [33]. Salg Metoder
Kemikalier Salg The kemikalier anvendt i denne undersøgelse er af analytiske kvaliteter og var blevet forberedt umiddelbart før brug. De følgende lægemidler blev anvendt: Ranitidin (Sigma Aldrich, USA), absolut ethanol (Fischer Scientific, USA), N-ethylmaleimid (NEM) (Sigma-Aldrich, USA), N G-nitro-L-arginin methylestere (L-NAME) (Sigma-Aldrich, USA), carbenoxolon (CBX) (Sigma-Aldrich, USA) og diethylether (Fischer Scientific, USA).
Plantemateriale
Muntingia calabura
blade blev indsamlet fra deres naturlige habitat i Shah Alam, Selangor, Malaysia, mellem maj og august 2010. anlægget blev identificeret ved en botaniker fra Institut for Bioscience (IBS), Universiti Putra Malaysia (UPM), Serdang, Selangor. En voucher eksemplar, SK 2466/14, er blevet deponeret på UPM IBS Laboratory of Natural Products Herbarium.
Udvinding og fraktionering af Muntingia calabura
blade
Metode beskrevet af Zakaria et al. [26] og Sufian et al. [28] blev anvendt til at forberede den rå ekstrakt af Muntingia calabura
blade og fraktioner deraf, hhv. Fem hundrede gram modnet blade blev lufttørret ved stuetemperatur (27 ±
2 ° C) i 1-2 uger og malet til fint pulver. Methanol (MeOH) blev anvendt som opløsningsmiddel til ekstraktion. Pulveret blev gennemvædet i MeOH i et forhold på 1:20 (vægt /volumen) i 72 timer. Blandingen blev filtreret ved anvendelse filtertragt, bomuld og Whatman No. 1 filterpapir. Den iblødsætning og filtrering blev gentaget på resten for to gange. Den opsamlet fra hver ekstraktion filtrat blev samlet og inddampet i en rotationsinddamper ved 40 ° C under reduceret tryk til opnåelse af methanol ekstrakt af Muntingia calabura
(MEMC). Den tørrede rå ekstrakt blev suspenderet i MeOH og destilleret vand (dH 2O) vand i forholdet 1: 2, hvilket gav en vandig MeOH-opløsning. Blandingen blev successivt fordeltes med forskellige opløsningsmidler, som var petroleumsether og ethylacetat, hvilket gav petroleumsether fraktion (PEF), ethylacetat fraktion (EAF). Fraktionerne blev filtreret og inddampet til tørhed under vakuum ved anvendelse rotationsfordamper. MEMC, PEF og EAF blev udsat for HPLC for at kvantificere forbindelsen af ​​interesse, der kan være forbundet med ekstraktet er gastrobeskyttende effekt.
Identifikation og kvantificering af phytoconstituents stede i EAF ved HPLC
metode beskrevet af Zakaria et al. [34] med små ændringer blev tilpasset til at udføre HPLC-analyse af EAF. Kort fortalt blev 10 mg prøve suspenderet i 1 ml methanol. Opløsningerne blev filtreret gennem en filterpatron (porestørrelse på 0,45 um) før anvendelse. Prøven blev analyseret ved anvendelse af et HPLC-system (Waters Delta 600 med 600 Controller) med fotodiodearraydetektor (PDA) (Waters 996). A C 18 søjle (4,6 mm i.d. x 250 mm) pakket med 5 um partikler med en diameter blev anvendt. Den mobile fase var vand indeholdende 0,1% myresyre (A) og acetonitril (B). Oprindelige betingelser var 85% A og 15% B med en lineær gradient nå 25% B ved t
= 12 min. Denne betingelse blev opretholdt i 10 min. B blev reduceret tilbage til 15%, begyndelsestilstanden, og blev opretholdt indtil t
= 35 min. Ved t
= 25 min, programmet tilbage til den oprindelige sammensætning opløsningsmiddel. Strømningshastigheden var 1,0 ml /min, injektionsvolumen var 10 pi og bølgelængden var 280 nm for gallussyre og 330 nm for quercetin. Søjlen ovn blev indstillet til 27 ° C. Stamopløsninger af standarder referencer udarbejdet i methanol ved koncentration 1 mg /ml. De kromatografi toppe blev bekræftet ved at sammenligne sin retentionstid med de referencestandarder og af de respektive UV-spektre. Kalibreringskurve for gallussyre var Y = 29562x + 102.777 (R 2 = 0,9969) og quercetin var Y = 43236x - 81.458 (R 2 = 0,999). Alle chromatografiske operationer blev udført ved omgivelsestemperatur og i tre eksemplarer. HPLC-analyse blev udført i Laboratoriet for Phytomedicine, lægeplanter Division, Forest Research Institute of Malaysia (FRIM), Kepong, Malaysia.
UHPLC-ESI-analyse
UHPLC systemet blev udført på en Dionex 3000 UHPLC systemet erhvervet fra Thermo Fisher Scientific (USA), der bestod af en autosampler udstyret med en søjle ovn, en bakke rum køler, og en binær pumpe med indbygget opløsningsmiddel afgasser. Den kromatografiske separation blev udført på en BEH C18 UHPLC kolonne, 100 mm x 2,5 um, 1,7 um (Waters) ved en strømningshastighed på 0,3 ml /min. De mobile faser blev anvendt, var (A) 0,1% myresyre i vand og (B) 0,1% myresyre i acetonitril. Gradienten startede med 10% mobil fase B, og nåede 20% mobil fase B ved 5 min, 60% mobil fase B ved 17,0 minutter, på isokratisk eluering af 90% B i 3 min. Gradienten nåede blev holdt de oprindelige betingelser i 2 min som en re-ligevægt trin. Injektionsvolumenet var 10 pi og søjlen Temperaturen blev holdt ved 40 ° C. Den UHPLC systemet blev koblet til en lineær ion-trap-Orbitrap massespektrometer Q Exactive fra Thermo Fisher Scientific (U.S.A) udstyret med en elektrospray-ionisering (ESI) kilde. Massen detektion blev udført i et område fra 150-1500 m /z. ESI kilde blev drevet i negativ ion-mode under følgende særlige betingelser: source spænding, 3,2 kV; skede gas, 35 arbitrære enheder; ekstra gas, 15 arbitrær enhed; feje gas, 10 arbitrær enhed; og kapillær temperatur, 320 ° C. Nitrogen (> 99,98%) blev ansat som kappe gas, hjælpeansatte og feje gas. Instrument og dataindsamling blev udført med Chameleon 6.8 software og Xcalibur 2.2 software (Thermo Fisher Scientific)
Dyr
Eksperimenterne blev udført på Sprague Dawley-rotter. (180-200 g; 8-10 uger gamle). De blev opnået fra Animal Unit, medicinske fakultet og Sundhedsvidenskabelige Fakultet, UPM, Malaysia. Dyrene blev holdt i polypropylen bure med træ barbering, fodret med standard pellet og fri adgang til vand. De blev holdt i stuetemperatur (27 ± 2 0C, 70-80% luftfugtighed, 12 timers lys /mørke cyklus) i Animal Holding Unit (UPM). Forud for alle assays, blev rotterne fastet. Standard lægemidler og MEMC blev indgivet oralt (p.o.) med sonde med 8% Tween 80 (10 ml /kg) som køretøjet. Brugen af ​​dyr i denne undersøgelse blev godkendt af Animal Care og brugte Udvalg (ACUC) UPM (Godkendelse nr: UPM /FPSK /pads /BR-Uuh /00474)
Bestemmelse af den mekanisme ligger til grund for gastrobeskyttende aktivitet. EAF
pyloric ligation
Metode ved Shay et al. [35] med mindre ændringer blev ansat til at udføre pylorus ligation. Rotter blev tilfældigt opdelt i 5 grupper, med seks rotter i hver gruppe. Gruppe-I blev kontrolgruppen administreret med 8% Tween 80 (vehikel) oralt (po), Gruppe-II var den positive kontrol indgives med ranitidin 100 mg /kg (po), mens det for gruppe-III, -IV og- V blev rotter administreret med EAF (100, 250 og 500 mg /kg). Pylorus ligering blev udført på 48 timer fastende rotter 1 time efter administration af testforbindelserne. Under let anæstesi induceret under anvendelse ketamin-HCI (100 mg /kg, intramuskulært) og xylazin HCI (16 mg /kg, intramuskulært), blev en 2 cm lang midterlinie abdominal incision udføres, lige under brystbenet. Pyloric del af maven blev forsigtigt mobiliseres og omhyggeligt ligeret med en silkeligatur rundt pylorus sphincter i en stram knude. Pleje blev taget, mens binde knude at undgå interferens med gastrisk blodforsyning. Den abdominale indsnit blev syet, huden blev renset for eventuelle blod pletter eller blødning, og dyrene fik lov til at restituere efter anæstesi.
Vurdering af maveslimhindelæsion
Dyrene blev aflivet 6 timer efter ligering ved udsættelse for diethylether og cervikal dislokation. Maverne blev fjernet, og indholdet blev drænet ud, samles, og centrifugeret. Maven blev åbnet langs den største krumning for at bestemme læsionen skade som beskrevet af Balan et al. [36]. Den procentvise beskyttelse blev beregnet ved hjælp af følgende formel: $$ \\ mathrm {Beskyttelse} \\ \\ venstre (\\% \\ højre) = \\ frac {\\ venstre (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {kontrol} \\ \\ hbox {-} \\ \\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {p} \\ mathrm {r} \\ mathrm {e} \\ hbox {-} \\ mathrm {behandlet} \\ \\ mathrm {gruppe} \\ højre)} {\\ venstre (\\ mathrm {U} \\ mathrm {A} \\ \\ mathrm {kontrol} \\ højre)} \\ gange 100 \\% $$ Bestemmelse af volumen, pH, frit og samlet syreindhold af gastrisk indhold
den drænede gastrisk indhold blev centrifugeret i 10 min ved 2500 rpm til fjernelse af enhver form for fast affald. Volumenet og pH af mavesaft blev målt. Mavesyren blev også udsat for frit og totalt syreindhold estimering ifølge fremgangsmåde beskrevet af Srivastava et al. [37]. Titrering med 0,01 N NaOH med methylorange reagens blev udført indtil opløsningens farve blev gullig for at bestemme det frie syreindhold. Volumenet af alkali tilsættes blev noteret. Derefter blev to til tre dråber phenolphthalein tilsættes til opløsningen. Opløsningen blev titreret indtil bestemte røde skær vises. Det totale volumen af ​​NaOH tilsættes blev noteret. Denne mængde svarer til det totale syreindhold. Syreindhold blev beregnet ud fra følgende formel: $$ \\ mathrm {Syreindhold} = \\ frac {\\ mathrm {Volume} \\ \\ mathrm {af} \\ \\ mathrm {NaOH} \\ tider \\ mathrm {normalitet} \\ \\ mathrm {af} \\ \\ mathrm {NaOH} \\ gange 100} {0,1} \\ mathrm {m} \\ mathrm {e} \\ mathrm {q} /\\ mathrm {l} $$ Estimering af protein
totale proteinindhold i mavesaft blev anslået ved Lowrys metode, tilpasset fra Lowry et al. [38] anvendelse af alkalisk kobber reagens og Folin-reagens. Farven udvikles blev aflæst ved 660 nm. Proteinindholdet blev beregnet ud fra standardkurven fremstillet med bovint serumalbumin og proteinkoncentrationen blev udtrykt som mg /ml mavesaft.
Estimering af mavevæggen slim indhold
beskrevet af Corne et al. [39] med små ændringer blev anvendt til at bestemme den gastriske væg slim indhold. Maven blev åbnet langs den største krumning, vejet og neddyppet i 10 ml 0,1% Alcian Blue (0,16 M saccharose i 0,05 M natriumacetat, pH 5,8) i 2 timer. Maven blev derefter skyllet to gange i 0,25 M saccharoseopløsning (15 min hver) for at fjerne den overdrevne farvestof. Den resterende farvestof, der er kompleksbundet med den gastriske slim blev ekstraheret med 0,5 M MgCl 2. Den glandulære segment forblev i denne opløsning i 2 timer med intermitterende omrystning i 1 min i hver 30 min interval. Den resulterende blå ekstrakt blev derefter rystet kraftigt med et tilsvarende volumen diethylether, indtil dannelsen af ​​en emulsion. Den resulterende emulsion blev centrifugeret i 10 min ved 3600 rpm. Absorbansen af ​​det vandige lag blev aflæst ved 580 nm ved anvendelse af et spektrofotometer. Koncentrationen af ​​Alcian Blue blev beregnet ved hjælp af en standardkurve og resultaterne blev udtrykt i mg Alcian Blue /g vådt væv.
Ethanol-induceret maveslimhindelæsion i L-NAME eller NEM forbehandlet rotter
rolle af endogen NO og inddragelse af sulfhydryl- (SH) forbindelser i gastrobeskyttende virkning af EAF blev vurderet ved anvendelse af metoden beskrevet af Takayama et al. [40]. Hanrotter blev inddelt i 9 grupper og forbehandlet (ip) med saltvand, L-NAME (N-nitro-L-arginin-methylester, 70 mg /kg) en inhibitor af NO-syntese eller NEM (N-ethylmaleimid, 10 mg /kg) en SH sammensatte blocker. Tredive minutter efter forbehandlingen blev dyrene indgivet (p.o.) køretøj (8% Tween 80), carbenoxolon (100 mg /kg) eller EAF (500 mg /kg). Tres minutter senere, alle grupper fik absolut ethanol (5 ml /kg, p.o.) for at inducere mavesår. Alle rotterne blev aflivet 1 time efter administration af ethanol ved udsættelse for diethylether og cervikal dislokation. Maven blev fjernet og gastrisk beskadigelse blev bestemt som beskrevet ovenfor. Da EAF udviste en dosisafhængig effekt og udøvede betydelig beskyttende virkning mod gastriske mucosa i ethanol-inducerede mavesår model, blev den højeste effektive dosis (500 mg /kg) anvendt til denne undersøgelse.
Biokemisk analyse
Måling af superoxiddismutase (SOD), glutathion (GSH) niveau og katalase (CAT) aktivitet
Mave væv af rotterne forbehandlede med vehikel (8% Tween 80), ranitidin (100 mg /kg) eller EAF (100, 250 og 500 mg /kg) efterfulgt af ulcus-induktion under anvendelse af absolut ethanol i 1 time blev anvendt til bestemmelse af SOD, GSH-niveau og CAT-aktivitet. Gastrisk væv blev skåret i stykker og den eksakte vægt blev registreret. Vævene blev homogeniseret med en homogenisator under anvendelse af passende kold buffer og derefter blev centrifugeret ved 10000 g i 15 minutter ved 4 ° C. Supernatanterne blev anvendt til at bestemme aktiviteter CAT og niveauer af SOD, og ​​GSH. Koncentrationen af ​​protein i supernatanterne blev målt ved Bradford-metoden [41] under anvendelse af bovint serumalbumin (BSA) som en standard. Niveauer af SOD, GSH og CAT blev bestemt under anvendelse af de kommercielle assaykits ifølge producentens instruktioner, henholdsvis (superoxiddismutase Assay Kit, Glutathione Assay Kit og Catalase Assay Kit, Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA).
måling af malondialdehyd (MDA) niveau
MDA-niveauer blev målt i maven væv fra det ethanol-inducerede mavesår. Maven væv blev homogeniseret og centrifugeret som beskrevet tidligere, og supernatanten blev anvendt til bestemmelse af MDA ved anvendelse af et enzym-koblet immunosorbent assay kit (USCN Life Science Inc., Atlanta, GA, USA). De optiske densiteter blev målt ved 450 nm, og resultaterne blev udtrykt som ng /mg protein.
Bestemmelse af prostaglandin E2 (PGE2)
PGE 2 niveauer blev bestemt i maven væv fra det ethanol-induceret gastrisk mavesår. Supernatanten af ​​homogeniseret og centrifugeret mavevæv blev anvendt til bestemmelse af PGE 2 ved hjælp Prostaglandin E 2 Express EIA Kit (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA). De optiske densiteter blev målt ved 412 nm. PGE 2 koncentrationer blev normaliseret ved indhold protein, og resultaterne blev udtrykt som pg /mg protein.
Bestemmelse af NO niveau
NO niveau i maveslimhinden blev evalueret som totale nitrat /nitrit niveauer ved hjælp af Griess reagens [42]. Kort fortalt blev maven homogenater fremstillet i 50 mM kaliumphosphatpuffer (pH 7,8). Homogenaterne blev centrifugeret ved 4000 rpm i 10 min ved 4 ° C. Halvtreds mikroliter af Griess-reagens (0,1% N- (1-naphthyl) ethylenediamide dihydrochlorid, 1% sulfanilamid i 5% phosphorsyre) blev tilsat til 50 pi supernatant og absorbansen blev målt ved 540 nm efter 10 min. Natriumnitrit blev anvendt som standard i dette assay til at generere standardkurven.
Statistisk analyse
Resultaterne blev udtrykt som middel ± standardfejl middelværdi (SEM) og analyseret under anvendelse envejs variansanalyse (ANOVA), efterfulgt af Dunnetts post hoc
testen eller Newman-Keuls test. Resultaterne blev betragtet som signifikante, når p <
0.
05.
Resultater
Identifikation og kvantificering af gallussyre og quercetin
HPLC fingeraftryk af MEMC, PEF og EAF afslørede tilstedeværelsen af ​​den galliske syre ved λ max 216,6-272,0 nm og quercetin ved λ max 255,5-370,6 nm (fig. 1a og b). Spiking af disse forbindelser i MEMC, PEF eller EAF øgede topareal, der svarer til den samme λ max værdi af forbindelserne. Kvantificeringen Resultatet fremgår af tabel 1 viser, at EAF indeholder det højeste beløb af gallussyre (39,89 ± 0,96 mg /g ekstrakt) og quercetin (9,36 ± 0,29 mg /g ekstrakt) efterfulgt af MEMC og PEF. Fig. 1 a og b: HPLC-analyse af MEMC, PEF og EAF udført ved bølgelængden 330 nm afslørede tilstedeværelsen af ​​quercetin ved Amax 255,5-370,6 nm ved stuetemperatur 3,696 min. Spiking af quercetin med ekstrakterne steg toparealet, svarende til den samme Amax værdi af forbindelserne. c og d: HPLC fingeraftryk af MEMC, PEF og EAF på 280 nm bølgelængde afslørede tilstedeværelsen af ​​gallicacid ved Amax 216,6-272,0 nm ved RT 4,204 min. Spiking af gallussyre med ekstrakterne steg toparealet, svarende til den samme Amax værdi af forbindelserne
Tabel 1 Gallussyre og quercetin sammensætning i MEMC og dets aktive fraktioner (PEF og EAF) ved mg /1 g ekstrakt. Resultaterne er udtrykt som middelværdier ± standardafvigelser (SDS) af tre bestemmelser
Forbindelser
MEMC
PEF
EAF
galliske syre (mg /g)
11,97 ± 0,27
3,40 ± 0,01
39,89 ± 0,96
Quercetin (mg /g)
4,83 ± 0,16
8,81 ± 0,44
9.36 ± 0,29
Identifikation af phenolforbindelser i EAF
EAF blev analyseret på grundlag af de nøjagtige masse data for de molekylære ioner, hvor ioner opdaget blev forsøgsvis identificeret ved deres genereret molekylformel, via softwaren Dataanalyse (Xcalibur), som forudsat liste over mulige elementært formler, sammen med brug af standard, når de foreligger og efter grundig undersøgelse af litteraturen.
bredt accepteret nøjagtighed tærskel for bekræftelse af elementært kompositioner blev etableret ved 5 ppm. Den UHPLC-ESI-analyse af EAF afslørede tilstedeværelsen af ​​22 phenolforbindelser (tabel 2), der opregner det maksimale antal, opholdstid, observeret m /z
, den genererede molekylformel og den foreslåede forbindelsen opdaget. Figur 2 svarer til basistoppen kromatogrammet i negativ ion, med molekylet struktur ermanin, kaempferide, pinobaksin og pinostrobin i fig. 3.Table 2 Phenolforbindelser identificeret i EAF af UHPLC-MS
Peak Ingen
tR (min)
[MH] -
Fejl (ppm)

formel
Identifikation
1.
0,45
169,01376
3,433
C7H5O5
galliske syre
2.
2.34
163,03978
4,964
C9H7O3
Protocatechuic syre
3.
3.10
193,05020
3,443
C10H9O4
ferulinsyre
4.
4,53
599,10547
3,879
C28H23O15
quercitrin-2 "-O-gallate
5.
4,93
939,11377
4.220
C41H31O26
Pentagalloyl -hexoside II
6.
5.05
447,09421
4,523
C21H19O11
kaempferol-3-O
-galactoside
7.
5,31
317,0308
5.130
C15H9O8
myricetin
8.
6,20
193,08661
3,569
C10H9O4
isoferulic syre
9.
6,91
583,11053
3,941
C28H23O14
Afzelin-O-gallate
10.
7.35
301,03586
4,023
C15H9O7
Quercetin
11.
7,42
603,07928
3,894
C30H19O14
Quercetin dimer
12.
7.67
255,06636
4,605 ​​
C15H11O4
Pinocembrin
13.
8,14
593,13116
3,697
C30H25O13
kaempferol-3-O
glucosid
14.
8.18
315,05196
6,478
C16H11O7
Rhamnetin
15.
8,55
271,06094
3,099
C15H12O5
Pinobaksin
16.
8,94
285,04037
3,528
C15H9O6
kaempferol
17.
10.80
253,05063
4,326
C15H9O4
Chyrsin jeg
18.
11.67
253,05099
5,749
C15H9O4
Chyrsin II
19.
11.91
299,05597
3,195
C16H11O6
Kaempferide
20.
12.56
313,07245
5,703
C17H13O6
Ermanin jeg
21
12.78
313,07230
5,224
C17H13O6
Ermanin II
22.
13,32
269,08194
4,105
C16H13O4
Pinostrobin
fig. Fig. Fig. Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• Effekter af nikotin på gastrisk myoelectrical aktivitet i ICR mice
• Klinisk-patologisk betydning claudin-4 i gastrisk carcinoma