Epidermal vækstfaktor receptor strukturelle ændringer i gastriske cancer

epidermal vækstfaktor receptor strukturelle ændringer i gastrisk cancer
Abstract
Baggrund
EGFR overekspression er blevet beskrevet i mange humane tumorer, herunder mavecancer. I NSCLC-patienter somatiske EGFR mutationer, inden kinasedomænet af proteinet, samt genamplifikation var forbundet med en god klinisk respons på EGFR-hæmmere. I gastriske tumorer data om strukturelle ændringer af EGFR stadig kontroversielt. I betragtning af dets mulige terapeutiske relevans, vi havde til formål at bestemme hyppigheden og arten af ​​strukturelle ændringer af EGFR
gen i en række af primære gastriske carcinomer. Salg Metoder
Direkte sekventering af kinasedomænet af EGFR
genet blev udført i en serie af 77 primære gastriske carcinomer. FISH-analyse blev udført i 30 tilfælde. Association undersøgelser mellem EGFR
ombygninger og de kliniske patologiske træk af tumorerne blev udført.
Resultater
Inden for de 77 primære gastriske carcinomer vi fundet to EGFR
somatiske mutationer og flere EGFR
polymorfier i exon 20. Seks forskellige intronsekvens varianter af EGFR
blev også fundet. Fire gastriske carcinomer viste balanceret polysomy eller EGFR
genamplifikation. Vi bekræftet, at gastrisk karcinom med ændringer af EGFR
(somatiske mutationer eller kopi nummer variation) viste en signifikant stigning i tumorstørrelse (p
= 0,0094) sammenlignet med vildtype-EGFR
karcinomer.
konklusion
Vi viser, at EGFR
strukturelle ændringer er sjældne i gastrisk karcinom, men når foreliggende, det fører til tumorvækst. Vi mente, at sandsynligvis vil være klinisk vigtig for at identificere patienter, der er modtagelige for at reagere på tyrosinkinasehæmmere søger efter EGFR
ændringer i mavekræft.
Baggrund
mavekræft stadig den næststørste årsag til kræft død på verdensplan [1] et scenarie, der understreger behovet for mere specifikke og effektive behandlinger. De nøjagtige mekanismer bag gastrisk carcinogenese er endnu ikke fuldt forstået, men peger i en forening med involverede veje i udviklingsprocesser [2]. Nøglemolekyler af disse veje er receptortyrosinkinaserne (RTK'er), som viser sig at være afvigende aktiveres eller overudtrykt i en række tumorer, og derfor repræsenterer lovende mål for terapeutisk indgriben.
Medlemmerne af RTK superfamilien af ​​erbB receptorer er glycoproteiner, der består af et ekstracellulært domæne, hvor binding af ligander finder sted, en kort lipofilt transmembrandomæne og et intracellulært domæne bærer tyrosinkinaseaktiviteten [3, 4]. De udtrykkes i flere væv af epitel, mesenkymale og neuronal oprindelse, hvor de spiller afgørende roller i udvikling, proliferation og differentiering. Dereguleret ekspression af erbB-molekyler, nemlig erbB2, er blevet impliceret i udviklingen af ​​mange typer af tumorer, herunder gastriske tumorer. I gastrisk karcinom er det blevet vist, at ERBB2 overekspression er drevet af genamplifikation og er forbundet til karcinomer med høj invasiv potentiale [5]. ErbB1, bedre kendt som epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), har overekspression blevet beskrevet i mange humane tumorer, herunder lunge-, tyktarms-, bryst-, prostata-, hjerne-, hoved- og halscancer, skjoldbruskkirtel, ovarie-, blære-, nyre- og også mavekræft [6 -11], og er blevet korreleret til avanceret tumor stadium og dårlig klinisk resultat. For ganske nylig, vi påvist, at EGFR-aktivering er forbundet til tab af funktion af E-cadherin, in vitro
[12].
Mekanismerne til onkogen omdannelse af EGFR i cancer indbefatter amplificeret kopital, strukturelle omlejringer af receptoren og aktiverende mutationer [13]. EGFR mutationer klynge i kinasedomænet af EGFR (exons 18-21), og forårsage ligand-uafhængig aktivering af receptoren, som repræsenterer mulige mål for terapeutisk indgriben. I denne henseende somatiske EGFR mutationer samt genamplifikation hos patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) stærkt korrelerer med det kliniske respons på tyrosinkinaseinhibitorer [14, 15].
I gastriske tumorer, data vedrørende strukturelle ændringer af EGFR stadig kontroversielt. I betragtning af dets mulige terapeutiske relevans, i den foreliggende undersøgelse, vi havde til formål at tydeliggøre relevansen af ​​EGFR strukturelle ændringer i gastrisk carcinogenese ved at analysere en række af primære gastriske carcinomer for kopiantal og mutationer i tyrosinkinasedomæne (exon 18-21) af EGFR
gen.
Metoder
Case udvælgelse og histopatologisk klassifikation af tumorerne
Repræsentative blokke af 77 formalinfikserede, paraffin indlejret humane gastriske primære tumorer blev hentet fra Patologisk Institut for Hospital S. João efter informeret samtykke fra patienterne. Patienterne blev informeret om, at tumor materiale ville blive brugt kun til forskning. Ingen af ​​patienterne, der indgår i den nuværende serie havde en familie historie af mavekræft. H &E-farvede snit blev anvendt til at kategorisere tumorer ifølge klassificeringen af ​​Lauren og Ming. Penetration af gastriske væg og tilstedeværelsen og lokalisering af lymfeknudemetastaser blev registreret for alle patienter under anvendelse af standard kriterier for patologisk stadieinddeling. Orcein-farvede snit blev anvendt til påvisning af vaskulær invasion.
EGFR Mutation Screening
Genomisk DNA blev ekstraheret fra 10 um sektion efter mikrodissektion af tumor områder for at sikre en renhed på mindst 70% af neoplastiske celler. DNA-ekstraktion blev udført under anvendelse af Genomisk DNA Purification Kit (Gentra System) ifølge fabrikantens protokol. Exon-specifikke primere blev udformet og DNA blev underkastet PCR-amplifikation af exon 18, 19, 20 og 21. De fire EGFR Salg exoner kode for tyrosinkinasedomænet af EGFR. Primersekvenser er vist i tabel 1.Table 1 Primere anvendt til PCR-amplifikation af EGFR-kinase domæne
Exon

primersekvens
PCR produkt størrelse (bp)
Exon 18
Forward
TGGGCCATGTCTGGCACTGC
283
Reverse
ACAGCTTGCAAGGACTCTGG
Exon 19
Fremad
TCACTGGGCAGCATGTGGCA
241
Reverse
CAGCTGCCAGACATGAGAAA
Exon 20
Forward
CCTTCTGGCCACCATGCGAA
295
Reverse
CGCATGTGAGGATCCTGGCT
Exon 21
Fremad
ATTCGGATGCAGAGCTTCTT
265
Reverse Salg CCTGGTGTCAGGAAAATGCT Salg PCR-produkter blev kørt på en 2% agarosegel og PCR amplificerede bånd blev ekstraheret fra gelen med gel Band Purification Kit (GE Healthcare). Prøverne blev derefter oprenset og sekventeret under anvendelse af ABI Prism dGTP BigDye Terminator Ready Reaction Kit (Perkin Elmer, Foster City, CA) efter producentens instruktion og en ABI Prism 3100 Genetic Analyser (Perkin Elmer, Foster City, CA). Resultaterne blev analyseret ved anvendelse 3100 dataindsamling software. Sekventering blev udført i begge strenge. I tilfælde med formodede mutationer PCR-amplifikation blev gentaget, og prøven blev igen sekventeret til udelukke PCR artefakter.
EGFR Copy Number Variation Screening Salg The paraffinblokke blev snittet på 5 um og vævssnit blev tørret ved 60 ° C i 30 minutter. Objektglassene blev deparaffinised og vasket efterfulgt af en forbehandling og en fordøjelse trin under anvendelse pepsin og endelig dehydreret. Den LSI EGFR Dual Color Probe-Hyb Set (Vysis ®), der er optimeret til at detektere bandet region 7p12 i spektret orange og centromeren af ​​kromosom 7 (7p11.1-q11.1, D7Z1 locus) i spektrum grøn, både i interfase kerner og på metafase kromosomer, blev anvendt. Fem pi af sonden blev anvendt til hvert dias. Denatureringen blev udført ved 80 ° C i 8 minutter, efterfulgt af hybridisering på et fugtigt kammer ved 37 ° C i 16 timer. Efter hybridisering blev objektglassene vasket og inkuberet med 4'-6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) for nuklear farvning. For evalueringen blev tres til 100 intakte interfase kerner analyseret af to uafhængige observatører for at score signalerne til kromosom 7 centromer og EGFR-genet. Omkringliggende lymfocytter og normal slimhinde blev brugt som intern kvalitetskontrol for analyserne. Mindst to eller tre repræsentative områder af de neoplastiske celler blev selekteret under en 100 × /200 × amplifikation felt, for at tælle kernerne signaler. Efter et overblik under en 400 × forstærkning, blev signalerne derefter talt under anvendelse nedsænkning olie (1000 ×).
Statistisk analyse
Associationsstudier mellem EGFR ombygninger og de klinisk-patologiske træk ved de sager blev udført kun i 30 tilfælde (tumorer analyseret for EGFR mutationer og EGFR kopiantal variation). Statistiske analyser blev vurderet af x2 test eller Students t
test. En p
værdi. ≪ 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant
Resultater
EGFR Mutation Screening
Fra de 77 gastriske carcinomer analyserede, blev påvist EGFR
mutationer i exon 18-21 i 2,6% (2/77) af tilfældene (fig. 1A). Én mutation tilhørte exon 20 og var en missense-mutation (2300 C > T), der fører til substitution af alanin 767 til valin. Den anden mutation påvirket exon 21 og var en missense-mutation (2524 A > G) fører til BYTTE af asparagin 842 for en asparaginsyre. Ingen af ​​mutationerne blev beskrevet tidligere. Ingen sekvensændringer blev fundet i exon 18 og 19. Figur 1 Strukturelle ændringer i EGFR. (A) Direkte sekventering viser en af ​​mutationerne fundet i kinasedomænet af EGFR - missense mutation (2300 C > T) i exon 20, der fører til substitution af alanin 767 til valin. (B) Diffus gastrisk karcinom med EGFR øget kopi nummer forårsaget af kromosom 7 polysomy. (C) Neoplastiske celler, der udviser genamplifikation med dannelsen af ​​klynger med mange signaler for EGFR.
Adskillige EGFR polymorfismer blev fundet i exon 20 (tabel 2). Den polymorfisme 2361G > En Gln787Gln, tidligere beskrevet af Mu et al
[16], var til stede i 55,8% (43/77) af tilfældene, og i ni af de 43 tilfælde i en homozygot tilstand. Vi screenede 50 normale kontroller og 2361G > En Gln787Gln var til stede i 82% af kontrollerne (41/50). To andre EGFR stumme mutationer (den 2301 C > T Ala767Ala og 2415 C > T His805His) blev fundet i exon 20, ingen af ​​dem tidligere beskrevet. Begge ændringer blev fundet i et enkelt tilfælde og var fraværende i normale controls.Table 2 Sequence ændringer fundet af direkte sekventering

Ændring

Skriv
Frekvens
Referencer
Exon 18
2184 + 19 G > A
Intronic variant
2/77
Ensembl
SNP rs17337107 (dbSNP126) [17]
Exon 19
2185-9 C > G
Intronic variant
1/77 endnu ikke
beskrevet
2283 + 11 G > A
Intronic variant
1/77 endnu ikke
beskrevet
2283 + 47 G > A
Intronic variant
1/77
endnu ikke beskrevet
2283+ 49 C > T
Intronic variant
1/77 endnu ikke
beskrevet
Exon 20
2284-60 C > T
Intronic variant
2/77
Ensembl
SNP rs10241451 (dbSNP126) [17]
2300 C > T
missense Ala 767 Val
1/77
endnu ikke beskrevet
2301 C > T
Silent Ala 767 Ala
1/77
endnu ikke beskrevet
2361G > A
Silent Gln 787 Gln
43/77
[16]
2415 C > T
Silent Hans 805 Hans
1/77
endnu ikke beskrevet
Exon 21
2524 A > G
missense Asn 842 Asp
1/77
endnu ikke beskrevet
Vi fandt seks forskellige sekvensvarianter lokaliseret i intron regioner af EGFR, to af dem tidligere beskrevet i Ensembl [17].
EGFR Copy Number variation Screening
analysen af ​​EGFR
kopital, som vurderet ved fluorescens in situ hybridisering (FISH), var kun muligt i 30 af de 77 tilfælde analyseret for EGFR-mutationer. Alle EGFR
signaler blev sammenlignet med signaler for centromere prober til kromosom 7. Mere end 2,0 EGFR
kopier per celle (balanceret polysomy eller genamplifikation) blev påvist i 13,3% (4/30) af tilfældene. Af de fire tilfælde, der viser mere end 2 kopier af EGFR
pr kromosom 7, tre havde øget kopi nummer grund polysomy og én havde genamplifikation, en diffus gastrisk karcinom, udstiller dannelsen af ​​klynger med mange signaler for EGFR
(fig. 1B, C).
EGFR strukturelle ændringer og clinicopathologic parametre for patienterne og tumorer
tabel 3 viser de statistiske sammenhænge mellem EGFR ombygninger og de clinicopathologic egenskaber ved patienter og tumorer. Når man sammenligner gastrisk karcinom huser EGFR ændringer med carcinomer med normal EGFR status eller antal kopier, observerede vi en signifikant sammenhæng mellem EGFR strukturelle ændringer og øget tumor størrelse. (P
= 0,0094). Ingen signifikante associationer blev fundet mellem EGFR ændringer og andre clinicopathologic parametre for patienterne og tumorer, nemlig køn og patienternes alder, tumorlokalisering, histologisk type, væggennemføring, tilstedeværelsen af ​​lymfeknudemetastase, vaskulær invasion og tumor staging af tumoren .table 3 Foreningen af ​​EGFR genændringer med klinisk-patologiske parametre
klinisk-patologisk parametre
EGFR status

Forstærkning /mutation (n = 6)
Normal (n = 24)
alt (n = 30)
p Drømmeholdet værdi
Sex (F /M)
1/5
10/14
11/19
0,2557
Alder (SD)
62,3 ± 14,1
56,3 ± 16,8
57,5 ​​± 16,2
0,4271
Tumor lokalisering
0,8548
proksimale
3
11
14
Distal
3
13
16
Størrelse (SD)
11,6 ± 9,8
5,8 ± 2,0
6,9 ± 5,0
* 0,0094
Laurens klassifikation
0,1261
Intestinal
1
12
13
Diffus
5
9
14
atypisk
0
3
3
Wall penetration
0,4642
Tidlig (T1)
0
2
2
Avanceret (T2-T4)
6
22
28
vaskulær invasion
0,7125
Fraværende ( n0)
3
14
17
Present (N = 1)
3
10
13
lymfeknudemetastase
0,1921
Fraværende
1
11
12
Present
5
13
18
Iscenesættelse
0,3845
jeg
1
7
8
II
0
5
5
III
5
11
16
IV
0
1
1
diskussion
EGFR genet er lokaliseret på kromosom 7p12 og koder for et 170-kDa receptoren, til stede i membranen af ​​celler som et inaktivt monomerer. Ved ligandbinding til det ekstracellulære domæne, receptoren undergår konformationelle ændringer, dimerises og bliver autophosphoryleret i vigtige tyrosinrester i det intracellulære tyrosinkinasedomæne (TK) domæne. Dette fører til aktivering af downstream veje, der styrer cellernes overlevelse, hæmning af apoptose og proliferation [18]. Hvor meget opmærksomhed er blevet henledt på onkogene effekt af EGFR og mest af alt til succes af EGFR mål behandlingsformer, som er godt etableret for ikke-småcellet karcinom. Rolle EGFR i gastrisk cancer er meget kontroversiel. Nogle forfattere rapporteret, at EGFR udtrykkes kraftigt i gastrisk cancer, hvilket antyder dets egnethed som et mål for receptor tyrosinkinaseinhibitorer [19, 20]. Omvendt Takehana og kolleger rapporterede, at overekspression af epidermal vækstfaktor receptor er en sjælden begivenhed i gastrisk carcinom [21] og forekommer overvejende skyldes EGFR genamplifikation, hvilket bekræfter resultaterne fra tidligere undersøgelser [22-24]. EGFR mutationer i primær gastrisk karcinom eller gastrisk cancer cellelinjer blev aldrig rapporteret [25-27]; alligevel vi for nylig viste, at arvelige diffuse mavekræft forbundet E-cadherin germline missense mutationer føre til øget EGFR aktivitet.
På dette grundlag vi overvejet at søge efter EGFR ændringer i mavekræft kunne have været vigtigt at identificere terapi modtagelige sager.
Her rapporterer vi tilstedeværelsen af ​​EGFR
øget kopi nummer i 13,3% af de 30 sager, hvor FISH-analyse var muligt. Af de fire sager med øget kopi nummer, blot én præsenteret genamplifikation, mens de resterende 3 sager viste polysomy af kromosom 7. Disse resultater passer tidligere rapporter undersøger EGFR kopi nummer i gastrisk kræft [22-24]. Den mutationsanalyse af kinasedomænet af EGFR afslørede tilstedeværelsen af ​​mutationer i 2,6% af 77 gastriske carcinomer. De identificerede mutationer var af den missense type og var til stede i exon 20 og 21 i EGFR-genet. Ingen af ​​de identificerede mutationer var tidligere blevet beskrevet, og deres funktionelle betydning er endnu ikke vurderet. Men på grund af deres lokalisering i kinasedomænet af EGFR, er det fristende at spekulere, at de påvirker aktiviteten af ​​receptoren og derfor patienter indeholdende disse EGFR mutationer kan drage fordel af tyrosinkinaseinhibitorer som terapeutisk fremgangsmåde.
Udover disse mutationer fundet blev andre sekvensændringer identificeret, alle klyngedannelse i exon 20. EGFR polymorfisme 2361 G > a (tidligere beskrevet i Ensembl) forekommer i en høj procentdel af tilfælde og i normale kontroller. I modsætning hertil de to andre endnu beskrevet tavse varianter i exon 20 (2301 C > T, 2415 C > T) var fraværende i normale kontroller. Ud over disse EGFR sekvens varianterne kodende regioner, har vi også identificeret variationer i intronsekvens flankerende exon 18, 19 og 20, men deres funktionelle effekt er fortsat uklart.
Korrelation af de kliniske parametre for de tilfælde, hvor både mutation og FISH-analyse var muligt, viste en signifikant sammenhæng mellem EGFR ændringer og tumorstørrelse. Interessant alle tilfælde med ændringer i EGFR (amplifikation /mutation) var carcinomer allerede invaderende basalmembranen og spredes til mavevæggen (T2-T4), hvilket antyder, at ændringer af dette gen kan give en invasiv adfærd til neoplastiske celler.
det er imidlertid nødvendigt, denne hypotese skal afklares ved yderligere undersøgelser, da vi ikke verificere en statistisk signifikant sammenhæng mellem EGFR ændringer og invasion i mavens væg (p = 0,4642), som vi netop har analised et meget lavt antal tidlige gastriske carcinomer ( n = 2) i vores serie. Begge resultater er i overensstemmelse med rapporterne fra Hirono et al
., 1995 [23], og Tsugawa et al
., 1998 [24], tyder på, at EGFR er involveret i tumorvækst og aktiverende ændringer kan være en sen begivenhed involveret i tumorudvikling.
Selv om ingen anden statistisk signifikant sammenhæng blev fundet, er det interessant at bemærke, at EGFR ændringer forekommer især i carcinomer i diffuse type. Tilstedeværelsen af ​​EGFR ændringer i diffuse carcinomer er i modsætning til hvad der tidligere er konstateret for andre medlemmer af erbB-receptorfamilien i gastrisk cancer. I gastrisk karcinom ERBB2 amplifikation blev detekteret fortrinsvis i intestinale carcinomer i mavesækken [5].
Konklusion
Som konklusion i denne undersøgelse påviste vi, at EGFR-aktiverende ændringer er ikke en hyppig begivenhed i gastrisk carcinogenese. Ændringer fortrinsvis optræder i gastriske carcinomer i diffuse undertype og er knyttet til tumorstørrelse. Trods den lave hyppighed af EGFR ændringer, vores resultater viser også, at der er en begrænset gruppe udvalgte gastrisk patienter, der kan drage fordel af ikke-konventionelle behandlingsformer, herunder farmakologiske hæmmere af EGFR-receptoren.
Notes
Cátia Moutinho, Ana R Mateus bidrog ligeligt til dette arbejde
erklæringer
Tak
denne undersøgelse blev finansieret af tilskud fra Fundação para en Ciência ea Tecnologia, Portugal (SFRH /BD /16747/2004, POCI /SAU -. OBS /57.670 /2004 og PTDC /SAU -. OBD /64319/2006)
forfattere 'originale filer indsendt til Images of Nedenfor er links til forfatternes oprindelige indsendte filer til billeder. 12885_2007_948_MOESM1_ESM.pdf Forfatternes oprindelige fil til figur 1 Konkurrerende interesser
forfatter (e) erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.

• Banded gastric bypass - fire år følger op i et prospektivt multicenter analyse
• Udtømning af OLFM4 genet inhiberer cellevækst og forøger sensibilisering over for hydrogenperoxid og tumornekrosefaktor-alfa-induceret apoptose i gastriske cancerceller