Stomach Health > mave Sundhed >  > Stomach Knowledges > undersøgelser

Betydningen af ​​attrap-receptor 3 (DcR3) og eksterne signal reguleret kinase 1/2 (Erk1 /2) i gastrisk cancer

betydning af attrap-receptor 3 (DcR3) og eksterne signal reguleret kinase 1/2 (Erk1 /2) i gastrisk cancer
Abstract
Baggrund
Decoy receptor 3 (DcR3), et medlem af tumornekrosefaktorreceptor (TNFR) superfamilien, er forbundet med anti-tumor-immunitet undertrykkelse. Den er stærkt udtrykt i mange tumorer og dets ekspression kan reguleres ved MAPK /MEK /ERK signalvej. MAPK /MEK /ERK-vejen er blevet rapporteret at være en regulator i tumor forekomst, udvikling og klonal ekspansion. Eksterne signal reguleret kinase (ERK) er et afgørende element af denne vej.
Resultater Salg Ekspressionen af ​​DcR3 og ERK1 /2 i tumorvæv af mavecancerpatienter var signifikant højere end den ikke-kræft gruppe (P
< 0,05). Der var ingen statistisk forskel mellem tumorvæv fra patienter med forskellige aldre eller køn, og selv forskellige differentiering (P
> 0,05). Men hos patienter med stadium I mavekræft, DcR3et og ERK1 /2 niveauer var signifikant lavere end patienter med mere avancerede stadier.
Konklusioner
DcR3 og ERK1 /2 spiller en afgørende rolle i udviklingen af ​​mavekræft, og de kan være nye markører til angivelse af virkningsgraden af ​​gastrisk cancer behandling i fremtiden.
Baggrund
Decoy receptor 3 (DcR3) er et medlem af tumornekrosefaktorreceptor (TNFR) superfamilien. Det har vist sig at være den afledningsindretningen receptoren for Fas-ligand (FasL), LYS og TL1A [1-3], også kendt som TR6 [4]. DcR3et er for det meste udtrykt i tumorceller og kompetitivt hæmmer TNF-signalering. Overekspression af DcR3 i tumorceller beskytter dem mod apoptose. DcR3 beskytter tumorceller fra immune overvågning, da det bidrager til undertrykkelse af værtens anti-tumor immunitet.
DcR3 mRNA og protein forstærkes i forskellige maligne væv, såsom lungekræft, tyktarmskræft, mavekræft, øsofageal cancer, pancreas cancer og malignt melanom [1, 5, 6]. Wu et al.
[7] rapporterede, at DcR3 ikke kunne detekteres i ikke-tumor patienter, men kunne påvises i 98,8% (82/83) af patienterne med maligne cancere.
Dette fænomen viser, at den forhøjede DcR3 ekspression er signifikant korreleret med tumorigenese og tumorprogression. Wu et al.
[8] rapporterede, at DcR3 var højt udtrykt i human gastrisk cancer (GC), og positivt korreleret med udviklingen og metastaser af gastriske læsioner. Gastric kræftpatienter med et højt DcR3 udtryk præsenteret en mere avanceret pN2-3 sygdom end dem med en lav DcR3 udtryk.
DcR3et for FasL kan være involveret i udviklingen af ​​mavekræft. Yderligere vurdering af de mulige roller DcR3 og regulering af DcR3 ekspression i maligne celler er meget vigtig for udviklingen af ​​nye strategier til bekæmpelse af væksten af ​​maligne celler, der undslipper værtens immunovervågning.
På det tidlige stadium, MAPK /ERK-vejen aktiveres i tumorer, hvilket er en bemærkelsesværdig tegn for mange former for kræft hos mennesker. For nylig flere linjer af beviser, at der ERK kunne være en parameter til at forudsige prognose af forskellige cancere, såsom brystcancer, coloncancer, bugspytkirtelkræft og cholangiocarcinom. Wang et al.
[9] rapporterede, at ekspressionen af ​​ERK1 /2 var høj i cholangiocarcinoma, som korrelerede med TNM stadier.
Kim et al.
[10] fandt, at LPS-induceret DcR3 frigivelse i humane intestinale epitelceller (IEC), som syntes at være via aktiveringen af ​​mitogen-aktiverede proteinkinaser (MAPK), såsom ekstracellulært signal-regulerede kinase 1 og 2 (ERK1 /2) og c-Jun NH2-terminal protein kinase ( JNK). LPS-induceret DcR3 udgivelse i SW480 celler blev afskaffet af ERK1 /2 og JNK-hæmmere. Desuden Yang et al.
[11] rapporterede, at 3 g /ml DcR3et markant inducerede phosphorylering af ERK og p38.
I overensstemmelse med disse rapporter, foreslår vi, at DcR3 og ERK1 /2 er nært beslægtede. DcR3et gener tæt korreleret med forekomsten og udviklingen af ​​mange slags tumorer. I dette studie undersøgte vi udtrykket og placeringen af ​​DcR3 og ERK1 /2 i gastrisk patienter i forskellige aldre, køn, stadie og differentiering kræft, til at udforske forholdet mellem DcR3 /ERK1 /2 og mavekræft forekomst og udvikling. Desuden giver vi forslag til klinisk diagnose af gastrisk kræft.
Metoder
Kliniske prøver
Tumorer var fra mavecancerpatienter, som blev gennemgået endoskopisk biopsi eller helbredende operationer i Zhongshan hospital tilknyttet Xiamen Universitet. Tumorvæv, hvorfra DNA og protein blev isoleret var fra friske eksemplar af resektion kirurgi. Alle prøver blev opnået med patientens samtykke og godkendelse af Udvalget for medicinsk etik Zhongshan Hospital Xiamen University. Blev udført
Mus
Alle forsøgene hjælp 6-8 uger mandlige nøgne mus købt fra Model Animal Research Center of Medical College Xiamen University. Alle dyr har været opstaldet under SPF forhold med konstant adgang til vand og foder. Alle eksperimentelle procedurer blev udført efter godkendelsen af ​​Animal Care og brug Udvalg Xiamen University.
Celledyrkning
humane mavekræft cellelinje BGC823 blev opretholdt i vores laboratorium, som blev dyrket i kolber med Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2. Salg Reagenser
DMEM, FBS og penicillin-streptomycin blev indkøbt fra Hyclone Corporation (Utah, USA). Hematoxylin-og-eosin (H &E) assaykit blev indkøbt fra Chemicon International, Inc (Temecula, CA, USA). ERK1 /2 og DcR3 Abs blev indkøbt fra Santa Cruz Bio-teknologi. RT-RCR reagenser blev indkøbt fra TaKaRa (Dalian, Kina). Primeren sekvens blev syntetiseret fra Sangon (Shanghai, Kina).
In vivo dyretumormodeller
Tumorer blev genereret i mandlige nøgne mus ved intramuskulær (im) injektion af BGC823 celler (1,0 × 105 celler i 100 pi PBS) i den højre flanke. Tumormålinger blev omdannet til tumorvolumen (V) med formlen (L × W2 × 0,52), hvor L og W er længden og bredden, henholdsvis. Målinger blev foretaget med en skydelære. Alle tumorbærende mus blev inddelt tilfældigt i grupper (2 mus /gruppe).
RT-PCR og Western blotting-analyse til undersøgelse af ekspression af DcR3 /ERK
Totalt RNA af DcR3 og ERK1 /2 blev ekstraheret fra stimulerede celler under anvendelse af Trizol. For at måle ERK /DcR3 genkopiantal, DNA fra friske tumorprøver blev analyseret med RT-PCR. De forudgående og efterfølgende primere til ERK1 mRNA var 5'-CCTGCTCATCAACACCACC-3 'og 5'-CGTAGCCACATACTCCGTCA-3', og for ERK2 mRNA var 5'-TCTTCC AGCCCTCCTTCCTG-3 'og 5'-CGTTTCTGCGCCGTTAGGT-3'. Prøverne blev denatureret ved 95 ° C i 4 min, efterfulgt af 35 amplifikationscykler (95 ° C, 45 sek; 55 ° C, 45 sek og 72 ° C, 60 sek). Produkterne var 300 bp og 400 bp fragmenter hhv. For DcR3-mRNA, den opstrøms primer var 5'GCAAAGCCAAGGATTCCCCCTG 3 'og nedstrømsprimeren var 5'-GGCACTGCTCTGAGCTGGAGCTG-3'. Prøverne blev denatureret ved 95 ° C i 4 min, efterfulgt af 30 amplifikationscykler (95 ° C, 45 sek; 55 ° C, 45 sek og 72 ° C, 60 sek). Produktet var en 921-bp fragment. Salg BGC823 celler blev høstet og lyseret i cellelyse-buffer (1% (vol /vol) Nonidet P-40, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCI (pH 8), 1 mM PMSF, 2 g /ml aprotinin, og 2 g /ml leupeptin), der kan frigøres DcR3 og ERK1 /2-proteiner. Femogtyve mikrogram totalt lysat blev fraktioneret ved SDS-PAGE og underkastet Western blotting-analyse under anvendelse af anti-ERK eller anti-DcR3 mAb (klon 3 H5).
Western blotting og ELISA-assay til undersøgelse af ekspression af DcR3 /ERK efter hæmmere behandling
BGC823 celler kultursupernatanter blev indsamlet med forskellige intervaller, og niveauer af U0126, PD98059, APDC, MEK1 /2 og ERK1 /2 interferenser blev kvantificeret ved hjælp af kommercielle ELISA kits, i henhold til leverandørens anvisninger. Celler behandlet med ERK1 /2 shRNA (5: 2, 6: 2), U0126 /PD98059 (0 pmol /l, 5 pmol /L, 10 pmol /l, 20 pmol /L, 40 pmol /L) og APDC (0 pmol /L, 10 pmol /l, 20 pmol /L, 40 pmol /l, 80 pmol /L) hhv. Efter en 5- eller 7-dages inkubation blev cellerne underkastet cytokinerne som indikeret assay. Femogtyve mikrogram totalt lysat blev fraktioneret ved SDS-PAGE og underkastet Western blotting-analyse under anvendelse af anti-ERK eller anti-DcR3 mAb (klon 3 H5).
Immunhistokemi analyse for ekspression af DcR3 og ERK1 /2
Tumor væv blev fikseret i en formaldehyd medium og indlejret i paraffin. Afsnit 6 mm tykke blev monteret på objektglas forbehandlet med 0,1% poly-L-lysin. De blev derefter deparaffinaged i xy-lene, dehydreret i gradueret ethanol og lægges i blød i 3% H 2O 2 i 10 min for at eliminere endogen peroxidaseaktivitet. Dernæst blev objektglassene nedsænket i citratbuffer (pH 6,0) og koges ved 92-98 ° C i en mikrobølgeovn i 10 minutter. Efterfølgende blev de skyllet 3 gange med PBS i 10 minutter hver og blokeret med 10% normalt gedeserum i PBS i 1 time ved stuetemperatur. Objektglassene blev derefter omsat med affinitetsoprenset kanin-anti-TR6 Ab (1,67 g /ml) ved stuetemperatur i 2 timer. Efter vask blev objektglassene inkuberet med biotinyleret gede-anti-kanin-antistof i 10 min. TR6 signalet blev afsløret ved streptavidin-peroxidase hjælp DAB som substrat i henhold til vejledningen fra Histostain-Plus-kit (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA). DcR3 signaler blev afsløret i brun. Endelig blev objektglassene kontrastfarvet med hematoxylin og forseglet med vandigt monteringsmedium (Zymed).
Statistisk analyse
Data blev præsenteret som gennemsnit ± SD. Betydningen af ​​forskellen mellem grupperne blev vurderet ved Student`s to-halet t-test. Sandsynlighed værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som signifikant. Alle midler blev beregnet ud fra mindst tre uafhængige forsøg.
Resultater
Kræftpatienter har forhøjede DcR3 niveauer
For at undersøge sammenhængen mellem DcR3 udtryk og tumor forekomst og udvikling, blev tumorer fra 50 patienter mavekræft indsamlet og testet for DcR3 mRNA og protein niveauer. Som vist i figur 1a, blev DcR3 båndene 921 bp genereret ved RT-PCR fra tumorvæv hos de fleste patienter (36/50), sammenlignet med de ikke-ondartede væv (2/50) fra de samme organer disse patienter. Disse resultater viser, at DcR3 niveauer blev signifikant forøget (otte tilfældigt valgte kliniske prøver er vist i figur 1a). For yderligere at bekræfte vores resultater blev DcR3 proteinniveauer undersøgt ved western blotting. Resultaterne viser, at kunne påvises DcR3-protein i de fleste kræftpatienter; DcR3 protein blev påvist i 74% (37/50) af tumorvæv, men kun i 6% (3/50) af de ikke-ondartede væv (tabel 1 og figur 1b; otte tilfældigt valgte kliniske prøver er vist i figur 1b ). Figur 1 Ekspressionen af ​​DcR3 i gastrisk cancer og ikke-cancervæv analyseret ved RT-PCR (Figure1a) og Western blotting (Figure1b). a: Lane M, DNA-markører; lanes1-7, tumorvæv; bane 8, ikke-kræft væv; DcR3-mRNA var positiv i 36 ud af 50 tumorvæv (1-7) og negativ i ikke-kræft væv (8). b: lanes1-7, tumorvæv; bane 8, ikke-kræft væv. DcR3-protein var positiv i 37 af 50 prøver af tumorvæv (1-7), som kun 3 af 50 i ikke-cancervæv (8).
Tabel 1 Analyse af gastriske cancerpatienter med DcR3 og ERK1 /2-ekspression i tumor og normalt væv

Cases
Positiv nummer
Positiv sats (%)
tumor
50
mRNA
Protein
+ /+
mRNA
Protein
+ /+
DcR3
36
37
28
72,0
74,0
56,0
ERK1
37
42
36
74,0
84,0
72,0
P
> 0.05
ERK2
32
37
27
64,0
74,0
54,0
Ikke-kræft
50
DcR3
2
3
0
4.0
6,0
0
ERK1
6
5
1
12,0
15,0
2.0
ERK2
9
10
3
18,0
20,0
6.0
Angivelse af ERK1 /2 i kliniske prøver
at identificere de signalmolekyler relateret til DcR3, ekspressionsniveauerne af ERK1 /2, blev JNK og p38 testet. Vi fandt, at kun ERK1 /2 kunne påvises i tumorprøver (data ikke vist for JNK og p38). ERK1 mRNA blev påvist i 74% af prøverne (37/50), og ERK2 mRNA blev påvist i 64% af prøverne (32/50, tabel 1 og figur 2a). På proteinniveauet, blev ERK1 detekteret i 84% (42/50) og ERK2 i 74% (37/50) af tumorvæv (tabel 1 og figur 2b). Disse resultater indikerer, at patienter med gastrisk cancer tumorer har en højere ERK1 /2-positive forekomst sammenlignet med de ikke-cancervæv (P
< 0,05). Der var en positiv korrelation mellem mRNA og protein niveauer, som i 42 af 50 tumorvæv det ERK1 proteinniveauet var forhøjet, hvoraf 36 sager stemte overens med den mRNA-ekspression. I modsætning hertil blev ERK1 proteinekspression detekteres kun i fem normale væv. Ved behandlingen ERK2, 37 af 50 tilfælde af tumorvæv var positive for ERK2 proteinekspression, hvoraf 27 tilfælde var i overensstemmelse med ERK2 mRNA-ekspression, mens kun ti tilfælde viste positiv proteinekspression i normale væv. De otte tilfældigt valgte prøver er vist i figur 2. Figur 2 Ekspressionen af ​​ERK1 /2 i gastrisk cancer og ikke-cancervæv analyseret ved RT-PCR (figur 2a) og Western blotting (figur 2b). a: Lane M, DNA-markører; lanes1-7, tumorvæv; bane 8, ikke-kræft væv; ERK1 og ERK2 mRNA var positive i tumorvæv. b:. ERK1 og ERK2-protein var positive i tumorvæv (1-8)
Placering af ERK1 /2 i mavecancerpatienter
Til undersøgelse ERK1 /2 fordeling blev tumorer fra 50 patienter testet ved immunhistokemi. Resultaterne viser, at ERK1 /2 blev udtrykt i tumorvæv fra de fleste af patienterne. ERK1 ekspression blev fundet i cytoplasmaet. ERK2 positiv ekspression blev fundet i nogle tumorceller (figur 3). Figur 3 Placeringen af ​​ERK1 /2-protein i gastrisk cancer analyserede væv ved immunohistokemi. A: Kontrol, B: ERK1, C:. ERK2
DcR3 og ERK1 /2 niveauer korrelerer med tumorinvasion men ikke med alder, køn eller differentiering
positive forekomst af DcR3 mRNA i tumorvæv af mavecancerpatienter var 72,0% (36/50), og af DcR3 protein 74,0% (37/50), hvilket var betydeligt højere end i ikke-kræft væv viser kun 4% (2/50) og 6% (3/50), henholdsvis ( P
< 0,05; tabel 1). Den positive forekomst af ERK1 /2-mRNA-ekspression var 74,0% (37/50) og 64,0% (32/50), og proteinekspression 84,0% (42/50) og 74,0% (37/50). Begge af dem var betydeligt højere end de ikke-kræft væv, viser 12,0% (6/50) og 18,0% (9/50), og 10,0% (5/50) og 20,0% (10/50), henholdsvis (tabel 1). Disse resultater antyder, at DcR3 og ERK1 /2 ekspressionsniveauer korreleret med tumor forekomst og udvikling.
Som vist i tabel 2, 3 og 4, var der ingen signifikant forskel mellem tumorvæv fra forskellige aldre, kønsgrupper og patienter med forskellige differentiering stadier af mavekræft (P
> 0,05). Men DcR3 og ERK1 /2 ekspressionsniveauer var signifikant høj i TNM stadie II-IV (tabel 5). Således udtryk for DcR3et og ERK1 /2 korreleret med tumor invasion og TNM stadie, men ikke med alder, køn eller differentiation.Table 2 Korrelation af ekspressionen af ​​DcR3 og ERK1 /2 med alderen i gastrisk kræftpatienter
Cases
Positiv nummer
Positiv sats (%)
≥50
32
mRNA
Protein
+ /+
mRNA
Protein
+ /+
DcR3
25
28
21
78,1
87,5
65,6
ERK1
28
31
26
87,5
96,9
81,2
P
> 0.05
ERK2
20
22
16
62,5
68,8
50,0
< 50
18
DcR3
11
9
5
61,1
50,0
27,8
ERK1
13
11
5
72,2
61,1
27,8
ERK2
12
15
6
66,7
83,3
33,3
tabel 3 Korrelation af ekspressionen af ​​DcR3 og ERK1 /2 med køn i gastrisk kræftpatienter
Cases
Positiv nummer
Positiv sats (%)
Mand
39
mRNA
Protein
+ /+
mRNA
Protein
+ /+
DcR3
29
29
24
74,4
74,4
61,5
ERK1
32
35
28
82,1
89,7
71,8
P
> 0.05
ERK2
26
30
23
66,7
76,9
59,0
Female
11
DcR3
7
8
5
63,6
72,7
45,6
ERK1
9
7
6
81,8
63,6
54,5
ERK2
6
7
4
54,6
63,6
36,4
tabel 4 Korrelation af ekspressionen af ​​DcR3 og ERK1 /2 med tumor differentiering i gastrisk kræftpatienter
Cases

Positiv nummer
Positiv sats (%)

9
mRNA
Protein
+ /+
mRNA
Protein
+ /+
DcR3
7
7
5
77,8
77,8
55,6
ERK1
7
9
6
77,8
100,0
66.7
P
> 0.05
ERK2
6
7
5
66.7
77,8
55,6
Moderat
28
DcR3
21
23
20
75,0
82,1
71,4
ERK1
24
24
22
85,7
85,7
78,6
ERK2
19
24
17
67,9
85,7
60,7
Low
13
DcR3
8
7
5
61,5
53,9
38,5
ERK1
10
9
8
76,9
69,2
61,5
ERK2
7
6
5
53,9
46,2
38,5
tabel 5 Korrelation af ekspressionen af ​​DcR3 og ERK1 /2 med patologiske stadier af tumor i gastrisk kræftpatienter
TNM stadie
Cases

Positiv nummer
Positiv sats (%)
jeg
6
mRNA
Protein
+ /+
mRNA
Protein
+ /+
DcR3
1
1
1
16,7
16,7
16,7
ERK1
2
2
1
33,3
33,3
16,7
P
> 0.05
ERK2
1
1
0
16,7
16,7
0,0
II
17
DcR3
12
13
10
70,6
76,5
58,8
ERK1
14
14
11
82,4
82,4
64,7
P
> 0.05
ERK2
10
12
9
58,8
70,6
52,9
III
25
DcR3
21
21
21
84,0
84,0
84,0
ERK1
23
24
22
92,0
96,0
88,0
P
> 0.05
ERK2
20
23
18
80,0
92,0
72,0
IV
2
DcR3
2
2
2
100,0
100,0
100,0
ERK1
2
2
2
100,0
100,0
100,0
P
> 0.05
ERK2
1
1
1
50,0
50,0
50,0
Expression niveauer af DcR3et og ERK1 /2 forstærkes i dyremodeller
Som vist i tabel 6, efter injektion BGC823 celler i den højre flanke hos nøgne mus, tumorerne voksede hver dag. RT-PCR blev anvendt til at teste DcR3 og ERK1 /2 mRNA-niveauer i tumorer og western blot-analyse blev anvendt til at undersøge protein niveauer. I mavekræft dyremodeller, blev DcR3, ERK1 og ERK2 detekteret ved 921 bp, 300 bp og 400 bp. I disse tumorvæv blev opdaget DcR3 mRNA fra dag seks, toppede på dag 10, og forblev opdaget på dag 12. DcR3et blev også påvist fra dag seks til dag 12 i leveren, mens det kun blev påvist på dag 12 i hjerte og lunger ( Figur 4a). ERK1 /2 mRNA udtryk blev påvist fra dag fire i tumorvæv, og ERK1 mRNA toppede på dag 10 (figur 4a og tabel 7) .table 6 vægt BGC823 tumor i nøgne mus (x ± s, n = 6)
Gruppe
Δ vægt /mg
2 d
4d
6d
8d
10 d
12 d
Normal -
-
- -
- -
Model
0. 47 ± 0. 17 △
0. 77 ± 0. 28 △
1. 01 ± 0. 39 △
1. 43 ± 0. 79 △
1. 65 ± 0. 68 △
1. 46 ± 0. 66 △
Bemærk: △ P
< 0,01 vs
normal; ** P
< 0,01 vs
model.
Tabel 7 Ekspression af DcR3 og ERK1 /2-mRNA i tumorvæv af dyremodeller analyseret ved RT-PCR

2d

4d

6d

8d

10d

12d

DcR3


+
+
++
++
ERK1

+
+
+
++
++
ERK2

+
+
+
+
+
Figur 4 Ekspressionen af ​​DcR3 og ERK1 /2 i musemodeller analyseret ved RT-PCR (figur 4a) og Western blotting (figur 4b). a: Lane M, DNA-markør; lanes1-6, hjerte, lever, milt, lunger, nyrer og tumorvæv af musemodeller på den fjerde dag; lanes7-12, der på den ottende dag; lanes13-18, den tolvte; ERK1 mRNA var positiv i lane2,8,9,12,14,15,18, ERK2 mRNA var positiv i lane1,2,6,9,10,12,13,14,15,17,18. DcR3 mRNA blev påvist i lane8, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. b: bane 1, hjerte; bane 2, lever; lane3, milt; Lane4, lunge; lane5, nyrer; lane6, tumorvæv; Udtrykket af ERK1 protein steg i tumorvæv som tiden gik, i hjerte, lever og nyre varede i 12 dage, kunne detekteres Udtrykket af ERK2 i milt og tumor fra den anden dag, som var positiv i tumorvæv indtil den fjerde dag og alle fem organer til den tolvte dag. Udtrykket af DcR3 protein var positiv i tumorvæv og lever på den sjette dag og i milten på den tiende dag, hvilket var negativ i hjerte, lunge, nyre, indtil det tolvte dag.
DcR3 protein blev påvist på dag seks i tumor væv og lever og ekspressionen forblev indtil dag 12. DcR3 protein blev påvist på dag 10 i milt og ved dag 12 i hjerte, nyre og lunge. ERK1 protein blev påvist på dag fire i tumorvæv, og fortsatte med at stige hver dag. ERK1 protein forblev på et stabilt niveau i hjerte, lever og nyre, men det faldt i lunge og milt på dag 10, efter at have nået toppen. ERK2 blev fundet på dag to i milt og tumorvæv. Fra dag fire blev registreret, ERK2 protein i alle seks prøver, og fortsatte med at stige indtil dag 12. Disse resultater tyder på, at ERK1 og ERK2 kan have forskellige virkninger på tumor forekomst, udvikling og klonal ekspansion.
DcR3 udtryk faldt efter at hæmme ekspression eller phosphorylering af ERK1 /2 i BGC823 celler
for at undersøge virkningen af ​​ERK1 /2-ekspression og phosphorylering på DcR3 ekspression blev BGC823 celler behandlet med ERK1 /2 shRNA eller med inhibitorer, som specifikt regulerer ERK-vejen. Western blot-analyse bekræftede, at inhibitorerne effektivt blokeret phosphoryleringen af ​​MEK /ERK pathway molekyler, og at shRNA reducerede ekspressionen af ​​ERK1 /2 (figur 5) betydeligt. Som vist i figur 5A, når BGC823 celler blev behandlet med ERK1 /2 shRNA, ERK1 /2 og P-ERK1 /2 niveauer faldt i forhold til kontrollen. Figur 5 Ekspressionen af ​​ERK1 /2 og P-ERK1 /2 i BGC823 cellelinje med plasmid interferens og inhibitor detekteres ved Western blotting. a: Ekspressionsniveauerne for ERK1 /2 og P-ERK1 /2 faldt sammenlignet med kontrolgruppen. 1) kontrolgruppe; 2) 5: 2 (plasmid: reagens); 3) 6: 2 (plasmid: reagens). b: ERK1 /2 phosphorylering gradvist faldt som koncentrationerne af inhibitoren U0126, PD98059 steget, men total ERK1 /2-protein-ekspression næsten ikke ændret. 1) 0 pmol /l; 2) 5 mmol /l; 3) 10 pmol /l; 4) 20 pmol /l; 5) 40 pmol /L. c: ERK1 /2 fosforylering faldt efterhånden som koncentrationerne af hæmmeren APDC. 1) 0 pmol /l; 2) 10 pmol /l; 3) 20 pmol /l; 4) 40 mmol /l; 5) 80 mmol /l. d: PD98059 kan naturligvis hæmme MEK1 /2 fosforylering niveau, men det ændrede ikke MEK1 /2 eller NF-KB ekspressionsniveauerne. 1) 0 pmol /l; 2) 5 mmol /l; 3) 10 pmol /l; 4) 20 pmol /l; 5) 40 mmol /l.
U0126 er en meget effektiv MEK-inhibitor, hvilket resulterer i inhibering af ERK-phosphorylering, som gør PD98059. ERK phosphorylering faldt gradvist koncentrationerne af de stoffer, imidlertid, selv om den samlede ERK1 /2 proteinekspression næppe ændret (figur 5B).
APDC kan inhibere NF-KB-aktivering celle i en række celler. Gennem nedbrydning af IKB, kan APDC reducere translokationen af ​​NF-KB, således blokerer NF-KB-aktivering. Som vist i figur 5 C, under forskellige koncentrationer af APDC, ændre niveauet af NF-KB-inhibering kan væsentligt dæmpe ERK1 /2 phosphoryleringsniveauerne. Men den specifikke mekanisme kræver yderligere undersøgelser.
For at undersøge effekten af ​​disse inhibitorer og shRNA på DcR3 udtryk vi brugte ELISA-analyse, der påviste, at udskilt DcR3et i supernatanten faldt efter de forskellige behandlinger (Figur 6). Statistisk analyse viste, at DcR3 sekretion niveauer var signifikant forskellig mellem eksperimentet grupper og kontrolgrupper (P
< 0,05). Som vist i figur 6, interferens med ERK1 /2 i BGC823 celler førte til nedsat DcR3 proteinekspression sammenlignet med kontrolgruppen. Tendensen matcher ERK ekspressionsniveauet i figur 5, og viser, at de to er positivt korreleret. Endvidere DcR3 og P-ERK ekspressionsniveauer faldt når celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af U0126, PD98059 og APDC. Disse data indikerer, at sekretion af DcR3 positivt korreleret med P-ERK1 /2 ekspressionsniveauer i BGC823 gastriske celler. Det er værd at bemærke, at i U0126-gruppen, øget DcR3 sekretionsniveauer når lægemiddelkoncentrationen nåede 40 pmol /l; Men den specifikke mekanisme kræver yderligere undersøgelser. I APDC gruppen, havde DcR3 niveauer ikke væsentligt ved koncentrationer højere end 20 mmol /l. Figur 6 Ekspressionen af ​​DcR3-protein med plasmid interferens og inhibitor ved ELISA-analyse. a: DcR3 ekspressionsniveauer i BGC823 kultur supernatant nedsat, når celler blev behandlet med ERK1 interferens plasmid. b: DcR3 ekspressionsniveauer faldt når celler blev behandlet med ERK2 interferens plasmid. c: DcR3 ekspressionsniveauerne faldt når celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af U0126, PD98059 og APDC mmol /l
Diskussion
Det er blevet påvist, at DcR3 genet udtrykkes på et lavt niveau i menneskeligt embryon, lunge,. hjerne, lever, milt, mave, tyktarm, lymfeknuder og rygmarven, mens det blev udtrykt på et højt niveau i kræftformer såsom gastrointestinal cancer, hepatocellulært carcinom og bugspytkirtelkræft [1, 12].
Wu et al.
[8], at ekspressionen af ​​DcR3 i mavecancerpatienter var signifikant højere end normalt. DcR3 udtryk i veldifferentieret mavekræft var signifikant lavere end for dårligt differentierede prøver (P
< 0,05).
DcR3et ekspressionsniveauet blev signifikant associeret med lymfeknude metastaser og patologisk stadium, men korrelerede ikke med tumorstørrelse, metastatisk status eller histologiske typer. Når patienter blev fulgt i 63 måneder, blev DcR3 overekspression fundet at være associeret med en signifikant forkortet overlevelsesrate [13, 14].
Mange rapporter har vist, at høje ekspressionsniveauer af ERK1 /2 tæt korreleret med bryst-, tyktarms- og pancreascancer, samt malignt melanom, leukæmi og myxoma [15-18].
Vores forskning viste, at hos patienter med gastrisk cancer, den positive hyppighed af DcR3 og ERK1 /2-mRNA var højere end i den ikke- cancervæv (P < 0,05). RT-PCR og western blotting viste, at mRNA og protein ekspressionsniveauer af DcR3 og ERK1 /2 i tumorvæv var betydeligt højere end i andet væv, hvilket antyder, at DcR3 og ERK1 /2 niveauer korrelerer med tumorudvikling, men ikke med alderen , køn eller differentiering (P
&0,05).
Vores resultater viste, at den positive hyppighed af ekspression af DcR3 og ERK1 /2-mRNA og DcR3 og ERK1 /2-protein matches hinanden. De immunhistokemi resultater viste også, at i gastriske tumorer, blev ERK1 /2 stærkt udtrykt.
Chen et al.
[19] rapporterede, at den positive rate af DcR3 ekspression var 74,4% (32/43) i hepatocellulært carcinom, og at der var en signifikant korrelation mellem DcR3 ekspression og metastase samt gentagelse og differentiering. Salg In musen gastrisk model, viste RT-PCR, at DcR3-mRNA kunne påvises i tumorer fra dag seks. ERK1 /2-mRNA og protein blev også påvist i tumorer, og Erk1 niveauer steg gradvist i gastriske tumorer. Endvidere blev de også påvist i hjerte, lever, milt, lunge og nyre af gastrisk cancer dyremodel, hvilket antyder, at de har en vigtig rolle i tumorudvikling. ERK1 /2-mRNA blev detekteret fra dag fire i tumorvæv, og ERK1 mRNA toppede på dag 10. ERK1 protein kunne også påvises på dag fire i tumorvæv, og fortsatte med at stige hver dag. ERK1 forblev på et stabilt niveau i hjerte, lever og nyre, men det faldt i lunge og milt på dag 10, efter at have nået toppen. ERK2 blev fundet på dag to i milt og tumorvæv. Fra dag fire blev ERK2 detekteret i alle seks væv, og fortsatte med at stige indtil dag 12. ERK2 kunne ikke påvises i hjerte, lunge og milt ved RT-PCR på dag 12 i dyremodeller, men kunne detekteres proteinniveauer. Disse resultater tyder på, at ERK1 og ERK2 kan have forskellige virkninger på tumor forekomst, udvikling og klonal ekspansion. Mange undersøgelser indikerede, at ekspressionen af ​​ERK1 /2-mRNA og protein varierer i forskellige tumorer og celler [20, 21]. Nogle nylige rapporter tydede de kunne være helt modsat i nogle tilfælde. Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

Other Languages