MicroRNA-144 hæmmer metastase af gastrisk kræft ved at målrette MET expression

MicroRNA-144 hæmmer metastase af gastrisk kræft ved at målrette MET udtryk
Abstract
mavekræft (GC) er fortsat en af ​​de mest almindelige typer af ondartet kræft, og den molekylære mekanisme bag dens metastaser er stadig stort set uklar. MikroRNA'er er dukket op som vigtige regulatorer af metastase grund af deres evne til at virke på flere signalveje. I vores undersøgelse fandt vi, at MIR-144 er betydeligt nedreguleret i såvel højt metastatiske GC cellelinjer og væv. Resultater fra både gain-of-funktion og tab af funktion eksperimenter viser, at øget miR-144-ekspression betydeligt reduceret GC celle migration, mens faldet miR-144 udtryk dramatisk forøget GC celle migration. Met-protoonkogen (MET), som ofte amplificeret i humane cancere og funktioner som en vigtig regulator af cellevækst og tumorinvasion, blev identificeret som et direkte mål for MIR-144. Desuden nedregulering af MET hjælp små interfererende RNA (siRNA) sammenfattet anti-metastatisk funktion af miR-144, mens genoprette MET udtryk svækket funktion miR-144 i GC celler. Desuden fandt vi, at miR-144, ved at målrette MET, undertrykker fosforylering af Akt. Endelig observerede vi en omvendt korrelation mellem ekspressionen af ​​MIR-144 og MET-mRNA i GC metastatiske væv. Sammenfattende MIR-144 undertrykker GC progression ved direkte at nedregulere MET-ekspression, som efterfølgende forhindrer aktivering af pro-onkogene Akt pathway. Genindførelse af miR-144-ekspression i GC celler præsenterer en attraktiv terapeutisk tilgang til at blokere metastaser af mavekræft.
Nøgleord
microRNA miR-144 MET mavekræft Metastaser Introduktion
Globalt mavekræft (GC) er en af de mest fremherskende typer af malign sygdom. I 2008 blev ca. 989.600 nye tilfælde af GC diagnosticeret. Endvidere GC var impliceret som en årsag til 738.000 dødsfald, hvilket gør GC den fjerde mest almindelige malignitet og den førende årsag til kræft død verdensplan [1]. Når tumoren skrider frem, det udvikler evnen til at invadere omgivende væv og metastasere. Den hepatocytvækstfaktor-receptoren, MET, er kendt for at fremme motilitet og invasive evne af tumorceller [2]. MET er et medlem af receptortyrosinkinase-familien og er blevet vist at være opreguleret i mange tumorer [3-5]. Det foreslås, at MET ekspressionsniveauet forøges ved enten genamplifikation eller hypoxi via HIF1α. Hos patienter med metastatisk GC, MET forstærkning og stærk proteinekspression er ikke sjældne. Disse begivenheder synes at være signifikant associeret med ugunstige kliniske resultat [6]. Ca. 10% af hvide patienter huser en gevinst på fem eller flere kopier af MET. Derudover er denne gevinst i MET kopital signifikant associeret med ugunstige prognose [7]. Endvidere MIR-34a /c microRNA har vist, at negativt modulerer MET ekspression i cellelinjer afledt fra prostatacancer, hepatocellulært carcinom og GC [8-10]. Salg MikroRNA'er (miRNA) er ikke-kodende RNA-molekyler, ca. 21-23 nukleotider i længden, som regulerer genekspression på det transskriptionelle eller post-transkriptionel niveau [11-13]. miRNA ekspressionsprofil analyser har afsløret en global nedregulering af modne miRNA niveauer i humane tumorer i forhold til normale væv [14]. Endvidere kan miRNA fungere i enten en tumorsuppressor eller oncogen rolle, afhængig af funktion af deres mål. For eksempel MIR-133b blev signifikant nedreguleret i GC væv og udøvede sin tumor suppressor rolle i GC-celler [15]. Ekspression af MIR-337-3p var signifikant nedreguleret i lymfeknude metastatiske væv af GC patienter, og induktion af MIR-337-3p ekspression gjorde reducere gastrisk cancercelleinvasion kapacitet [16]. miR-25 fremmer GC progression ved direkte at nedregulere TOB1 udtryk; derfor forøget ekspression af MIR-25 udgør en potentiel invasiv biomarkør for prognosen for GC patienter [17]. Derudover er MIR-7 betydeligt nedreguleret i såvel højt metastatiske GC cellelinjer og metastatiske væv. Overekspression af MIR-7 markant inhiberer GC metastase ved at målrette ekspressionen af ​​insulin-lignende vækstfaktor-1-receptor (IGF1R) oncogenet [18]. I GC cellelinjer, genindførelse af miR-144 ekspression resulterer i undertrykkelse af ZFX, som moderat øger kræftcelle modtagelighed for 5-fluorouracil kemoterapi. I 93 tilfælde af primær GC, formindsket MIR-144-ekspression blev associeret med dårlig prognose [19]. Disse eksempler har fremhævet den centrale rolle, miRNA i GC malignance og kræft progression.
I denne undersøgelse, vi karakteriseret målene og defineret virkningsmekanismen for miR-144 i GC. Ved at inducere ektopisk udtryk for miR-144, opdagede vi MET er en roman mål for miR-144 regulering. Dette resultat blev bekræftet på begge mRNA og protein niveauer, og reportergen luciferaseassays verificerede direkte binding af miR-144 til de lovgivningsmæssige bindingssted i 3'UTR af markedsøkonomisk behandling. Desuden fandt vi, at MET udtryk omvendt korrelerer til MIR-144 niveauer i en lille, men veldokumenteret GC kohorte. Vi hypotesen, at miR-144 hæmmer GC metastase, og at nogle af denne hæmning medieres ved at målrette MET udtryk.
Materialer og metoder
Humane vævsprøver og cellelinier
GC prøver blev indsamlet fra patienter, som gennemgik kirurgi på Fudan University i Shanghai Cancer center mellem 2012 og 2013. protokollen blev godkendt af Clinical Research etiske komité for Fudan University, og forskningen blev udført i henhold til bestemmelserne i Helsinki-erklæringen af ​​1975. Alle prøver blev opnået med informeret samtykke af patienterne. Den humane GC cellelinie AGS (ATCC @ CRL 1739 ™), SNU-1 (ATCC @ CRL-5971 ™), SNU-5 (ATCC @ CRL-5973 ™), SNU-16 (ATCC @ EF- referencelaboratoriet 5974 ™) , NCI-N87 (ATCC @ CRL-5822 ™), og KATO III (ATCC @ HTB-103 ™) blev opretholdt i DMEM indeholdende 10% føtalt bovint serum. Alle cellelinier blev opretholdt i medium indeholdende penicillin (100 IE /ml) og streptomycin (100 mg /ml) ved 37 ° C med 5% CO2. MiRNA efterligner og inhibitorer blev indkøbt fra Ambion (Austin, TX, USA).
RNA-ekstraktion og real-time PCR
Totalt RNA blev ekstraheret fra celler under anvendelse af TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). For miRNA analyse blev poly (A) haler tilsat til totalt RNA under anvendelse af poly (A) polymerase (Ambion, Carlsbad, CA) forud for revers transkription. Den MiRcute miRNA qPCR detektion kit (TIANGEN, Beijing, Kina) blev anvendt til at kvantificere ekspressionsniveauerne af MIR-144 ifølge den medfølgende protokol. De følgende PCR-betingelser blev anvendt: 95 ° C i 30 s, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 31 s. Mængden af ​​mål (MET /miR-144), normaliseret til det endogene husholdning gen GAPDH /U6snRNA og i forhold til en reference prøve, er givet ved følgende ligning: mængde target = 2- △△ CT
Microarray hybridisering.
Kort fortalt blev RNA-prøver anvendes til at syntetisere dobbeltstrenget komplementær DNA (cDNA), og dobbeltstrenget cDNA blev mærket og hybridiseret til mikroarrayet (Arraystar, Rockville, MD). Efter hybridisering og vask blev forarbejdet objektglas scannet med Axon GenePix 4000B microarray scanner (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). P-værdien blev beregnet ved hjælp af parret t-test. Tærsklen sat for op- og nedreguleret gener var en fold ændring > 2.0 og en p-værdi < 0,05. Hierarkisk klyngedannelse blev udført på grundlag af differentielt udtrykte gener og miRNA ved hjælp Cluster Treeview software fra Stanford University (Palo Alto, CA).
MiRNA-gen netværk
Vi konstrueret netværket adjacency mellem to gener, i og j, defineret som en magt Pearson korrelation mellem tilsvarende gen-udtryk profiler, xi og xj. Nabomatricen, M (i, j), blev visualiseret som en graf, og de topologiske egenskaber af denne graf blev undersøgt. For at gøre en visuel repræsentation, kun de stærkeste korrelationer (> 0,98), er opstillet i disse gengivelser. I miRNA-gen net, hvert gen svarer til et knudepunkt. To gener er forbundet med en kant, hvilket indikerer en stærk korrelation. Inden for netværksanalyse, en grad er den enkleste, vigtigste foranstaltning af det centrale i et gen i et netværk, og bestemmer den relative betydning. En vis grad er defineret som antallet af direkte knyttet naboer
Forudsigelse af MIR-144 bindingssted
formodet MIR-144 bindingssteder i MET-mRNA 3 'utranslaterede region blev forudsagt af Target Scan program (http:. //www.targetscan.org). Position 1430-1436 af MET 3'UTR har en bevaret bindingssted for miR-144 målretning.
Plasmid transfektion
Den ORF sekvenser af MET blev amplificeret fra genomisk DNA isoleret fra SNU-5 cellelinie og blev derefter subklonet ind i pLenti vektor. Plasmidet blev transficeret i SNU-5-celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Efter 24 timer blev cellerne anvendt til en rednings eksperiment.
Oligonukleotid transfektion
MIR-144 efterligner, MIR-144-inhibitor (anti-MIR-144), og MET siRNA (siRNA-MET) blev syntetiseret af Genepharma , Shanghai, Kina. Oligonukleotid transfektion blev udført med lipofectamin 2000 reagenser (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Slutkoncentrationen af ​​MIR-144 efterligner, anti-MIR-144 eller siRNA-MET i transfektion systemet var 100 nM. Transfektion effektivitet for de enkelte og co-transficeret undersøgelser blev bestemt ved fluorescens mikroskop.
Immunoblotting
Ækvivalente mængder af cellelysater blev løst med 7% SDS /PAGE og blev overført til polyvinylidenfluorid membraner. Membranen blev inkuberet med et kanin polyklonalt anti-met-antistof (1: 500, Abcam, ab47431), et gede polyklonalt anti-ADAM12 antistof (0,3 ug /ml, Abcam, ab28747), og en kanin polyklonalt anti-versican antistof (1 ug /ml, Abcam, ab19345). IRdye-mærkede sekundære antistoffer blev anvendt til kvantificering af immunoblotting signal, og signalerne blev analyseret ved anvendelse af en Odyssey scanner (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE, USA).
RNA-chip assay
RNA-protein-interaktioner fikseres med formaldehyd, og chromatin forskydning kombineret med DNase-behandling til opnåelse af RNA /protein-komplekser, der kan immunpræcipiteret med antistoffer mod MET proteiner. Cross-links efterfølgende vendes; RNA udvindes og igen behandlet med DNase for at sikre fravær af DNA. RNA udfældes fra immunkomplekset derefter analyseres ved real-time PCR. I denne RNA-chip-analysen, der anvendes følgende formel:% af input (recovery) = AE (Ct input-Ct prøve) * Fd * 100%. Her, AE er amplificeringseffektiviteten (10 (-1 /hældning)) og Fd er en fortyndingsfaktor på input-RNA til afbalancere forskellen i mængderne af RNA-chip prøve og input-RNA anvendes til real-time PCR.
Luciferase assay
fuld MET 3'UTR blev amplificeret ved PCR under anvendelse SNU-5-cDNA som template og klonet ind pGL3 kontrolvektoren. Vi anvendte Quick Change mutagenese til mutation af MIR-144 formodede bindingssted (Stratagene, Santa Clara, CA, USA). SNU-5-celler og AGS celler blev transficeret med MIR-144 efterligner /inhibitorer og pGL3 luciferase reporter-konstruktioner huser MET 3'UTR. Efter 24 timer blev aktiviteterne i ildflue-luciferase og renilla luciferase i cellelysaterne målt med Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, USA). Salg Migration assays Hus Til Transwell migration assays, 1 × 105 celler blev udpladet i det øverste kammer, som indeholder en ikke-coatet membran. Cellerne blev udpladet i serum-frit medium, og medium suppleret med 10% (v /v) serum blev anvendt som en kemoattraktant i det nedre kammer. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i en vævskultur-inkubator med 5% (vol /vol) CO2. Efter 16 timer blev de ikke-migrerede celler fjernet fra de øvre sider af transwell membranfilter skær. De migrerede celler på de nederste sider af inserterne blev farvet med coomassie brilliant blue, og cellerne blev talt.
Celleproliferationsassay
De transficerede celler blev podet i plader med 96 brønde ved en densitet på 1 x 104 celler /godt. En celle proliferation assay blev udført under anvendelse af Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan) ifølge producentens instruktioner. Før tilsætningen af ​​CCK-8, blev cellerne vasket med varmt dyrkningsmedier ved spinding pladen ved 500 rpm i 3 m og derefter bortkastning af supernatanten Salg Primere
Følgende primere blev anvendt til realtids-PCR.: mIR-144: 5-TACAG TATAG ATGAT GTACT-3; U6snRNA: 5-CGCAA GGAUG ACACG CAAAU UCGUG AAGCG UUCCA UAUUU UU-3; SKIL fremad primer: 5-GTTAA GCGAA CCTGT ACTTC TGT-3, revers primer: 5 GTAGG CGACA TGCTT TCTTG G-3; MET forward primer: 5-GTCGG AGTAG AGCGT CGAGA-3, revers primer: 5-CAGCG CGATC AGGTA GAGC-3; TOP2A forward primer: 5-ACCAT TGCAG CCTGT AAATG A-3, reverse primer: 5-GGGCG GAGCA AAATA TGTTC C-3; ADAM12 fremad primer: 5-TCAAC CTGGA TACCC GATTC C-3, reverse primer: 5-GCTCT GTCTG CCGAT GGAG-3; VCAN forward primer: 5-GTAAC CCATG CGCTA CATAA AGT-3, revers primer: 5-GGCAA AGTAG GCATC GTTGA AA-3. Følgende primere blev anvendt til fuld MET 3UTR ansøgning: MET 3'UTR fremadrettet primer: 5-TCACT GCCTG ACCTT TA-3, MET 3'UTR reverse primer: 5-ATCAC TTACT CCCAC AAT-3. Den siRNA nukleotid om markedsøkonomisk behandling blev anvendt som følger: siRNA-MET frem: 5-GUGCC ACUAA Cuaca UUUAU U-3, siRNA-MET omvendt:. 5-UAAAU GUAGU UAGUG GCACU U-3
Statistisk analyse
Resultaterne præsenteres som middelværdi ± SEM, og dataene blev analyseret med Students t-test. En værdi på p < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.
Resultater Salg MicroRNA ekspressionsprofil i gastrisk cancer
Sammenligning af peritoneale metastatiske væv med parrede primære foci prøver af GC under anvendelse af hierarkisk clustering analyse afslørede systematisk variation i ekspressionen af ​​miRNA og gener (figur 1A og B). Vores data tyder på, at et sæt af miRNA og gener ofte udtrykkes afvigende i de peritoneale metastatiske væv af GC. Derudover har vi også konstateret, at nogle tidligere godt bevist molekyler, såsom miR-7 [18], miR-25 [17], TOB1 og IGF1R, ikke var identificeres i vores microarrays. Vi troede disse forskel kan induceres ved mangfoldighed af kliniske prøver kom fra forskellige områder. Figur 1 Core miRNA-gen-netværk, herunder 8 centrale miRNA og deres mål. Hierarkisk klyngedannelse analyse af 27 miRNA (A) og 32 gener (B), der var differentielt udtrykte mellem metastatiske væv i de peritoneale og parrede delprøver af GC (større end 2,0-fold; p < 0,05). Ekspressionssystemer værdier er repræsenteret i nuancer af rød og grøn, hvilket indikerer ekspression over og under medianen udtryk værdi på tværs af alle prøver. (C) The miRNA-genet netværk viser forholdet mellem 8 centrale miRNA og tumorassocierede gener, de forventes at regulere. Farverne angiver de annoterede ekspressionsniveauerne af miRNA og gener.
MiRNA-gen-netværk blev samlet med det formål at identificere de vigtigste miRNA, der regulerer tumor-associerede genekspression under progression af tumor metastase. Fordi coekspression moduler sandsynligvis svare til biologiske veje, fokuserede vi på coekspression moduler, der er forbundet med et stort antal af protein-kodende gener. Desuden NCBI RefSeq beskriver de funktioner mange gener, som hjulpet vores identifikation af GC-associerede gener. Under anvendelse af denne fremgangsmåde, kendetegnet vi rollen som MIR-144 i den peritoneale metastatiske foci af GC. I kræft coekspression netværk, miR-144 forbundet til 6 protein-kodende gener, der er involveret i tumorvækst og metastase (figur 1C).
Regulatory rolle miR-144 gastrisk cancer metastaser
At undersøge miR- 144 funktion, vi først undersøgt mIR-144-niveauer i et panel af 6 humane GC cellelinier. Som vist i figur 2A, valgte vi AGS, kendetegnet med opreguleret MIR-144, og SNU-5, kendetegnet med nedreguleret MIR-144, til yderligere undersøgelse. AGS-cellelinjen blev afledt fra gastriske tumorfragmenter der blev reseceret fra en patient, som ikke havde modtaget nogen tidligere behandling, mens SNU-5 blev afledt af ascites fra en patient med dårligt differentieret carcinom i maven. Figur 2 MIR-144 undertrykker migrationen af ​​GC-celler. (A) Ekspressionsniveauer af MIR-144 blev kontrolleret i et panel af 6 humane GC cellelinjer under anvendelse realtids-PCR-metode. (B) Migration af SNU-5 celler behandlet med miR-144 efterligner blev kontrolleret ved hjælp af no-matrigel behandlet Transwell kammer. (C) Migration af AGS celler behandlet med en miR-144-inhibitor blev kontrolleret ved hjælp af no-matrigel behandlet Transwell kammer. (*** P < 0,001).
I vores undersøgelse observerede vi en tæt sammenhæng mellem miR-144 tab og metastaser i GC (figur 1A og C). Tilsvarende har tidligere undersøgelser dokumenteret MIR-144-baseret inhibering af tumorcelle migration og invasion i epitel pladecellecarcinom. Vi antager, at genindførelsen af ​​miR-144-ekspression ville undertrykke kræft celle migration. Hensigtsmæssigt indførelse af MIR-144-ekspression inhiberes cellemigrering i SNU-5 (figur 2B). Sammenlignet med SNU-5, AGS celler har en relativt højere niveau af endogen MIR-144-ekspression. Overraskende, inhibering af MIR-144 forøgede AGS migration celle (Figur 2C). Faktisk udførte vi også invasionen assay under anvendelse af matrigel-behandlede transwell, og der er ingen forskel for invasiv evne SNU-5 /AGS celler efter behandlet med MIR-144 /anti-MIR-144 (data ikke vist). Disse resultater er illustreret, at miR-144 spiller en vigtig rolle i migration, men ikke i invasion af GC celler.
MiR-144 påvirker MET udtryk
Gennem ektopisk udtryk for miR-144 i SNU-5 celler, vi bestemt ADAM12 , VCAN og MET er formodede miR-144 mål. Som vist i figur 3A, MIR-144-ekspression drastisk påvirket mRNA-niveauerne af ADAM12, VCAN og MET. ADAM12, VCAN og MET protein udtryk niveauer blev også påvist gennem western blot i kræftceller transficeret med miR-144 efterligner. Som vist i figur 3B, kun mødt proteinniveauer blev nedreguleret ved MIR-144. Dette indikerer, at MIR-144 påvirker MET ekspression på det transskriptionelle niveau, måske gennem spaltning eller destabilisering af mRNA struktur. Men vi fandt også, at ADAM12 og VCAN protein niveauer er ikke faldet med eksogen indførelse af miR-144. Vi troede, at mRNA og protein niveauer ikke kan korreleres direkte på grund af forskellige halveringstid. Vi troede også de viste, at kan skyldes tilstedeværelsen af ​​MIR-144, som blev kontinuert undertrykke translation i ét tilfælde, men ikke den anden. MET: MIR-144 vekselvirkning blev også vist i levende celler ved RNA-CHIP assay. Faktisk var endogen MIR-144 findes associeret med endogen MET i anti-MET, men ikke anti-IgG immunopræcipitater fra celler (figur 3C). Figur 3 Ekspression af MET blev reguleret af miR-144. (A) mRNA-niveauer af formodede MIR-144 mål blev undersøgt ved real-time PCR i SNU-5-celler transficeret med MIR-144 efterligner eller MIR-NC. (B) Protein niveauer af formodede MIR-144 mål blev undersøgt ved western blotting i SNU-5-celler transficeret med MIR-144 efterligner eller MIR-NC. (C) De% input for genfindelse af de RNA-CHIP reaktioner illustrerer berigelse af MET antistof. RNA-chip assay for MIR-144 udført på anti-met-antistof fra lysater af celler. RNA-chip med en nonrelated IgG tjente som kontroller. (D) En skematisk billede af den forudsagte MIR-144-bindingssted i 3'UTR af MET. (E) SNU-5-celler blev forbigående co-transficeret med LUC-MET 3'UTR og MIR-144 mimic. (F) AGS celler blev transient co-transficeret med LUC-MET 3'UTR og et MIR-144-inhibitor. (G) mutere af miR-144 bindingssted i MET 3'UTR afskaffet miR-144-induceret luciferaseaktivitet undertrykkelse. Luciferaseaktivitet blev målt efter 24 timer og normaliseret til cotransficeret Renilla. (* P < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001).
Brug bioinformatisk-baseret analyse, identificerede vi et enkelt miRNA bindingssted for miR-144 i 3'UTR af MET mRNA (figur 3D). For at teste om MIR-144 direkte binder 3'-UTR af MET-mRNA, udførte vi luciferasereporteren assays i SNU-5-celler. PCR-afledte fragmenter fra MET 3'UTR blev indsat i pGL3-kontrol vektoren ved Xba1 stedet (LUC-MET 3'UTR). Co-transfektion af LUC-MET 3'UTR og MIR-144 efterligner i SNU-5-celler resulterede i et fald luciferase signal (sammenlignet med MIR-NC), hvilket bekræfter, at binding af MIR-144 til 3'UTR af MET har en direkte inhiberende virkning (figur 3E). Den omvendte eksperiment, udført ved at blokere endogen MIR-144 produktion med en MIR-144 inhibitor i AGS celler, resulterede i øget luciferaseaktivitet signal (figur 3F). En muteret luciferase reporter på MIR-144 bindingssted blev også konstrueret (figur 3D). Mutation af miRNA bindingsstedet afskaffet MIR-144-medieret inhibering af luciferaseaktivitet (Fig 3G). Disse data tyder på, at 1430-1436 position MET 3'UTR er kritisk for miR-144-medieret genregulering.
MET formidler miR-144-induceret resistens mod migration
Brug real-time PCR, MET ekspressionsniveauer blev bestemt for seks humane GC cellelinier. Som vist cellelinier med "nedreguleret" MIR-144 niveauer har højere mængder af MET sammenlignet med cellelinjer med "opreguleres" MIR-144 niveauer (figur 4A). Ved hjælp af parametriske tests, vi bestemt en signifikant omvendt korrelation mellem MET mRNA og miR-144 udtryk i GC metastatiske prøver (figur 4B). Figur 4 MET modulation tegner sig for den antimetastatiske virkning af MIR-144. (A) Western blot, der viser MET ekspression i en række humane GC cellelinier. observeres (B) En signifikant omvendt korrelation mellem MIR-144 og Met ekspressionsniveauer i GC væv (n = 52). (C) Den MET og phosphoryleret Akt blev hæmmet af den tvungne ekspressionen af ​​miR-144 eller siRNA-MET. (D, E) Virkningerne af miR-144 eller siRNA-MET på migration og proliferation blev bestemt i SNU-5 celler. (F) Den MET og phosphoryleret Akt blev restaureret af overekspression af MET i miR-144 efterligner-behandlede SNU-5 celler. (G, H) Virkningerne af miR-144 kombineret med MET-ORF på migration og spredning af SNU-5 celler. (I) MET og phosphoryleret Akt blev opreguleret ved blokering af miR-144 i AGS celler. (J, K) Virkningerne af anti-miR-144 på migration og proliferation af AGS celler.
Den MET protein fungerer som en receptortyrosinkinase og spiller en central rolle i at fremme cellevækst og migration ved at transducere ekstracellulære stimuli til intracellulære signalsystemer kredsløb. En fremtrædende komponent af intracellulær signalering maskiner er PI3K (phosphoinositid 3-kinase) pathway [20,21]. Fordi miR-144 hæmmer MET udtryk, vi hypotese, at miR-144 i sidste ende kunne nedsætte Akt phosphorylering og aktivering gennem nedsat MET signalering. Derfor undersøgte vi Akt phosphoryleringsniveauerne efter MIR-144 overekspression og observeres et signifikant fald af Akt-phosphorylering (figur 4C).
Vi besluttede at undersøge, om MIR-144-induceret MET nedregulering havde en effekt på tumorcellemigration og proliferation. Vi transficerede miR-144 og siRNA for MET (siRNA-MET) i SNU-5 celler. Cellemigrering evalueret 16 timer efter transfektion ved Transwell assay, mens celleproliferation blev bestemt gennem CCK-8. Som vist i figur 4D og E, transfektion med MIR-144 inhiberede cellemigration og proliferation sammenlignet med kontrol. Tilsvarende faldende MET-proteinekspression under anvendelse siRNA også faldet tumorcellemigration og proliferation.
For at bestemme om behandling er den kritiske mediator af MIR-144 effekt på den cellulære migration og proliferation konstruerede vi to MET ekspressionsvektor. En indeholder kun den åbne læseramme sekvens af MET-gen (MET-ORF), og en anden vektor indeholder fuld længde nukleotid af MET-gen der indbefatter 3'UTR-sekvens (MET-fuld længe). Vi derefter udført western blot analyse 48 timer efter transfektion af MET-ORF /MET-fuld langt ind miR-144 efterligner-behandlede SNU-5-celler (Figur 4F). I forhold til den negative kontrolgruppe (Tom vektor), ektopisk ekspression af MET-ORF steget markant det samlede udtryk for markedsøkonomisk behandling og phosphoryleret Akt. Endvidere ekspression af MET-ORF fremmet migration og proliferation af GC-celler (figur 4G og H). Overekspression af MET afskaffet MIR-144-induceret inhibering af cellemigration og proliferation. I modsætning hertil proteinniveauet af MET og phosphoryleret-AKT steg i AGS celler behandlet med anti-MIR-144 (fig 4I), og blokering af MIR-144 fremmede også migration og proliferation af AGS-celler (Figur 4J og K). Disse resultater indikerer, at behandling er en kritisk mål for anti-migration effekt af MIR-144 i humane GC celler.
Diskussion
I denne undersøgelse har vi identificeret ikke-overlappende underskrifter et lille antal miRNA og gener som er aberrerende udtrykt i peritoneale metastatiske væv af GC, sammenlignet med parrede primære væv. Analyse af miRNA og genekspressionsprofiler i miRNA-gen-netværk identificeret miR-144 som en regulator af større onkogene veje, såsom spredning og migration. GC patienter med peritoneale metastaser havde lavere MIR-144 ekspressionsniveauer end patienter uden metastaser. Dette fund implicerer MIR-144 som en potentiel tumorsuppressor i GC. Desuden er MIR-144, der er forbundet med mekanismerne for metastase. Vores resultater stemmer overens med resultaterne af tidligere undersøgelser om betydningen af ​​miR-144 i kræft spredning, migration og invasion [22,23]. miR-144 hæmmer kræftcelle metastase ved at målrette A disintegrindomæne og metalloproteinase (ADAM) protein familiemedlem ADAMTS5. MicroRNA dysregulering er forbundet med øget tumorindtrængen og metastase, samt reduceret patient prognose i visse epiteliale cancere [24]. Vi undersøgte yderligere rolle miR-144 deregulering i GC. Vi undersøgte effekten af ​​MIR-144-ekspression i SNU-5-cellelinie, som det er kendetegnet ved lav ekspression af MIR-144. Ektopisk udtryk for miR-144 i SNU-5 celler resulterer i dybe fænotypiske ændringer, såsom nedsat migration. Den omvendte eksperiment, blokering MIR-144-ekspression, blev gennemført i AGS-cellelinien, som har en relativ høj endogen niveau af MIR-144-ekspression. Hæmning af miR-144-ekspression resulterede i øget AGS celle migration.
At undersøge mekanismen bag miR-144-afhængige faldt migration af GC, vi identificeret de formodede mål for miR-144 som forudsagt af miRNA-gen-netværk. MIR-144 overekspression kan reducere MET-ekspression både mRNA og protein niveauer, og tilsvarende, afslørede luciferase reporter assays, MIR-144 direkte kan interagere med MET 3'UTR. Vi evaluerede derefter mødtes ekspressionsniveauer i en kohorte af 52 GC patienter og fandt, at MIR-144 niveauer er omvendt korreleret til MET-ekspression. Derfor vi hypotese, at miR-144 hæmmer GC tumorigenese ved at målrette MET udtryk. MET er også blevet beskrevet som en MIR-34a /c mål i andre cellulære modeller og er kendt for at fremme motilitet og den invasive evne af tumorceller. Overekspression af MET er tæt korreleret med tumor invasion og patient prognose i GC [6]. I GC, MET overekspression er en uafhængig prognostisk faktor og potentielle lægemiddel mål. Desuden kan MET overekspression forudsige, hvilke patienter kan have gavn af målrettet behandling med MET hæmmere [25]. I vores undersøgelse blev MET udtryk signifikant associeret med GC differentiering, TNM og metastase [26]. Vi bestemt, at ændringer i celle proliferation og migration gennem miR-144 kan udøves gennem reguleringen af ​​MET udtryk. miR-144 undertrykkelse fører til øgede niveauer af MET, hvilket kan forklare den metastaser fænotype af miR-144-forarmet celler. Interessant MIR-144 påvirket hepatocytvækstfaktor (HGF) signalering. HGF, som liganden af ​​markedsøkonomisk behandling, kan fremkalde aktivering af MET i epitelceller. Mens MET overekspression ikke helt kunne genoprette GC tumorigene kvaliteter, blev GC celle migration og proliferation delvist genoprettet efter MET overekspression. Derfor kan MIR-144 regulere andre gener i GC-celler. Tidligere undersøgelser har vist, at behandling kan inducere GC tumorigenese gennem aktivering af PI3K pathway. I denne undersøgelse fandt vi, at miR-144 betydeligt svækket Akt fosforylering, og at Akt fosforylering blev fuldstændig restaureret med overekspression af markedsøkonomisk behandling. Vores resultater tyder på, at miR-144 regulerer Akt fosforylering gennem MET regulering i GC.
Afslutningsvis vores undersøgelse identificeret et grundlag for nedsat niveau af miR-144 set i GC metastatiske væv. MIR-144, blev identificeret som et potentielt tumorsuppressor i GC og er blevet forbundet med mekanismerne GC metastase. Desuden miR-144 hæmmer GC tumorigenese ved at målrette behandling, og efterfølgende, den PI3K /Akt vej. Så vidt vi ved, er dette den første gang MIR-144 har vist sig at målrette MET i GC-celler. Derfor kan yderligere undersøgelser udforsker anticancer rolle miR-144 bidrager til udviklingen af ​​nye terapeutiske strategier for GC.
Noter
juni Liu og Hui Xue bidrog ligeligt til dette arbejde.
Erklæringer
Tak
Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (Grant nr 81.201.897). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.
Konkurrerende interesser
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.
Forfattere bidrag
JL foretaget de molekylærbiologiske undersøgelser. HX udarbejdet manuskriptet. Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• Foreningen af ​​tilstedeværelse /fravær og on /off mønstre af Helicobacter pylori oipA gen med mavesår sygdom og gastrisk kræft risici: en meta-analyse
• Forholdet mellem gut hormoner og glukose homøostase efter fedmekirurgi