PLoS ONE: SIRT3 Verstärkt Glykolyse und Proliferation in SIRT3-exprimierenden Magenkrebszellen

Abstrakt

SIRT3 ist ein Schlüssel NAD ^{+ - abhängige Protein-Deacetylase in den Mitochondrien von Säugetierzellen, die Funktionsweise der Zellalterung und Transformation durch Regulierung der mitochondrialen Stoffwechsel-Homöostase zu verhindern. Allerdings SIRT3 wird auch zum Ausdruck bringen in einigen menschlichen Tumoren gefunden; ihre Rolle in diesen SIRT3-exprimierenden Tumorzellen benötigt aufgeklärt werden. Diese Studie zeigte, dass die Expression von SIRT3 wurde in einer Gruppe von Magenkrebszellen im Vergleich zu normalen Magenepithelzellen erhöht. Obwohl SIRT3 Expressionsspiegel in den Magentumorgewebe im Vergleich zu den benachbarten nicht-Tumorgewebe erhöht waren, waren SIRT3 positive Krebszellen häufiger in den intestinalen Typ Magenkarzinome als die diffuse Art Magenkarzinome nachgewiesen, was darauf hinweist, dass SIRT3 mit Subtypen von Magen verbunden ist Krebs. Die Überexpression von SIRT3 gefördert Zellproliferation und erhöhte ATP-Generation, die Glukoseaufnahme, Glykogenbildung, MnSOD Aktivität und Laktatproduktion, die durch SIRT3 Knockdown gehemmt wurden, was darauf hinweist, dass SIRT3 eine Rolle spielt, die Bioenergetik im Magentumorzellen in die Neuprogrammierung. Eine weitere Analyse ergab, dass SIRT3 interagierten mit und deacetyliert die Laktat-Dehydrogenase A (LDHA), ein Schlüsselprotein in der anaeroben Glykolyse Regulierung, die Verbesserung LDHA Aktivität. In Konsistenz wurde ein Cluster von Glykolyse-assoziierten Gene in den SIRT3-überexprimierenden Magentumorzellen hochreguliert. Somit kann zusätzlich zu den gut dokumentierten SIRT3 vermittelte mitochondrialen Homöostase in normalen Zellen kann SIRT3 Glykolyse und die Zellproliferation in SIRT3-exprimierenden Krebszellen erhöhen}

Citation. Cui Y, Qin L, Wu J, Qu X, Hou C, Sonnen W, et al. (2015) SIRT3 Verstärkt Glykolyse und Proliferation in SIRT3-exprimierenden Magenkrebszellen. PLoS ONE 10 (6): e0129834. doi: 10.1371 /journal.pone.0129834

Editor: Xianglin Shi, University of Kentucky, USA

Empfangen: 16. April 2015; Akzeptiert: 13. Mai 2015; Veröffentlicht: 29. Juni 2015

Copyright: © 2015 Cui et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorgesehen sind der ursprüngliche Autor und Quelle genannt

Datenverfügbarkeit: Alle relevanten Daten sind innerhalb des Papiers und seiner Hintergrundinformationen Dateien

Finanzierung:. Diese Studie teilweise von der National Natural Science Foundation of China, Schlüsselprogramm (30930105), National 5.12 Support-Plan-Projekt des Ministeriums für Wissenschaft unterstützt wurde and Technology of China (2012BAH30F03), der National Natural Science Foundation of China (31070740), die 985 und 211 Projekte der Xi'an Jiaotong University (JKL) und National Cancer Institute RO1 Zuschuss CA152313-01-A1 (JJL).

konkurrierende Interessen:. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Sirtuine, eine Familie von NAD ^{+ - abhängige Histon-Deacetylasen (HDACs) in Säuger Zellen werden in einem weiten Bereich von physikalischen Prozessen einschließlich Zellüberleben, Apoptose, Metabolismus, Stressreaktionen, Altern und Langlebigkeit [1,2] gebracht. Unter sieben Sirtuin-Mitglieder (SIRT1-7), ist SIRT3 die am besten charakterisierte mitochondrialer Sirtuin, funktionierende Mitochondrien-Proteine ​​in die oxidative Phosphorylierung, Fettsäureoxidation, Harnstoffzyklus, und die antioxidative Reaktion [2-9] beteiligt zu regulieren. Mehrere Studien haben die Rolle der SIRT3 in den Stoffwechsel und die Homöostase in normalen Zellen und offenbart neue Targets und Substrate für SIRT3 abhängigen Deacetylierung [10] markiert. Kim et al berichtet, dass SIRT3 ist ein Schlüssel Mitochondrien-Protein, und das Fehlen des SIRT3 Expression zu einer erhöhten mitochondrialen DNA-Schädigung und Alterung verbunden sind, sowie erhöhte Potential zu Ras-induzierte Zelltransformation und SIRT3 vermittelte MnSOD Aktivierung der mitochondrialen Homöostase beitragen [11,12]. Zur Unterstützung weisen menschliche embryonale Nieren-293-Zellen (HEK293-Zellen) eine verbesserte SIRT3 Expression unter oxidativem Stress, was zur Deacetylierung und Aktivierung von MnSOD [13]. SIRT3 wird angenommen, als Tumor-Suppressor-Gen zu funktionieren und spielt eine Schlüsselrolle bei der Verbesserung der Zellhomöostase gegen das Altern und Karzinogenese.}

Allerdings zeigen einige Tumorzellen die Expression von SIRT3 und die mögliche Rolle von SIRT3 in diesen Tumorzellen , vor allem ihr Potenzial gegenüber dem aggressiven Phänotyp, ist umstritten [14] gewesen. SIRT3 Ausdruck niedriger oder nicht nachweisbar in einer Reihe von menschlichen Krebsarten, einschließlich Brustkrebs, Glioblastom, Darmkrebs und Osteosarkom, Prostata- und Eierstockkrebs [11,15,16]. SIRT3 induziert Wachstumsarrest und Apoptose durch selektive Silencing von Bcl-2 in HCT116 Zellen durch Modulation JNK2 Signalweg [17]. Auch wird SIRT3 berichtet erhöhte Empfindlichkeit des menschlichen Leukämiezellen gegenüber Chemotherapie möglicherweise durch die Induktion von Mitochondrien vermittelte Apoptose [18] beitragen. Auf der anderen Seite wird SIRT3 Ausdruck fand auch in Mundkrebs, node-positive Brustkrebs, Speiseröhrenkrebs, und Schilddrüsenkarzinome erhöht werden; und die erhöhte SIRT3 zugeordnet ist höher malignen Phänotyp und Herunterregulieren der SIRT3 verbessert Tumorempfindlichkeit Antikrebsbehandlung [19-23]. Diese Ergebnisse alarmieren eine andere Rolle von SIRT3 in bestimmten Tumoren, die aufgeklärt werden muss.

Krebszellen sind metabolisch aktiv und verbrauchen mehr zellulären Kraftstoff als normale Zellen. Jedoch Relais Krebszellen hauptsächlich auf die ATP-Synthese durch aerobe Glykolyse, eine Funktion als Warburg-Effekt bekannt [24]. Solch eine aerobe Glykolyse wird angenommen, Krebszellen bilden oxidativem Stress zu schützen, da die mitochondriale Atmung die Hauptquelle für die intrazelluläre ROS ist [25]. Die Lactatdehydrogenase A (LDHA) ist ein Enzym zwischen Pyruvat und L-Lactat reversibel bei dem letzten Schritt des anaeroben Glykolyse [26] steuern gegenseitige Umwandlung. Die Hemmung der LDHA vermindert das tumorigene Potential mit einer erhöhten mitochondrialen Sauerstoffverbrauch und verringerte mitochondriale Membranpotential [26] und die allgemeine zelluläre ATP-Produktion und Glykolyse [27].

In dieser Studie untersuchten wir die mögliche Rolle von SIRT3 im Magen Krebszellen, die SIRT3 auszudrücken. Expression von SIRT3 wurde mit dem aggressiven Wachstum verbunden, die über SIRT3-deacetylierten und aktiviert LDHA vermittelt wurde, die Glykolyse und die Expression einer Gruppe von Glykolyse-assoziierter Gene zu erhöhen. So SIRT3-LDHA-vermittelte Glykolyse Stoffwechsel kann ein potenzielles therapeutisches Ziel sein, um Krebszellen zu behandeln, die SIRT3 auszudrücken.

Materialien und Methoden

Zelllinien und Kultur

Menschliche Magenkrebs Zellinien MGC-803 HGC-27, SGC-7901 [28] und AGS [29] und immortalisierten menschlichen Magen Epithelzelllinie GES-1 [30] wurden in RPMI-1640-Medium (Invitrogen) mit 10% fötalem Rinder ergänzt beibehalten Serum und 1% Penicillin /Streptomycin, und bei 37 ° C unter einer Atmosphäre von 5% CO2.

Immunpräzipitation und western-Blot

Subkonfluente Zellen wurden lysiert und die Lysate wurden mit Protein A inkubiert, /G-Agarose beads plus die empfohlene Menge an Antikörpern gegen entweder SIRT3 (Cell Signaling Technology) oder LDHA (Santa Cruze) bei 4 ° C über Nacht. Proben wurden durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Elektroblotting auf Nitrocellulose-Membranen zentrifugiert und getrennt. mit 5% fettfreier Milch in TBST Nach dem Blockieren wurden die Membranen mit primärem Antikörper bei 4 ° C über Nacht, gefolgt von Inkubation mit sekundärem Antikörper für 1 Stunde bei RT inkubiert. Die Proteine ​​von Interesse wurden durch ECL-Nachweis-Kit (Thermo Fisher) sichtbar gemacht.

Immunhistochemie Assay

Pathologische Dias von Magenkrebs mit angrenzenden normalen Gewebe wurden durch Immunhistochemie Assay analysiert wurden nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Das Polymer Detection Kit für die Immunhistochemie-Analyse wurde von Zhongshan Golden Bridge Biotechnology erworben. Kurz gesagt, wurden Paraffinschnitte entwachst und rehydratisierten in Ethanol (100%, 90% und 75%). Die Schnitte wurden 10 Minuten lang mit 3% H _{2 O 2 bei RT inkubiert und dann 15 Minuten lang mit nicht-immunem Ziegenserum bei RT blockiert. Die Schnitte wurden dann mit dem primären Antikörper zu SIRT3 (Cell Signaling Technology) für 2 Stunden bei RT, gefolgt von anti-Kaninchen-Sekundär-Antikörper-Inkubation für 15 Minuten bei RT inkubiert. Die Schnitte wurden dann mit DAB Nachweisreagenz für jeweils 2 Minuten, mit Hämatoxylin gegengefärbt und dehydraded in Ethanol (90% und 100%) inkubiert. Die Schnitte wurden montiert, und die Färbung wurde unter der Mikroskopie analysiert.}

Plasmidkonstruktion und Zelltransfektion

SIRT3 gesamte Länge cDNA synthetisiert wurde unter Verwendung von RT-PCR mit Gesamt-RNA aus extrahierten GES-1-Zellen als schablone (Primer: 5 'CCGCGGTACCATGGCGTTGTGGGGTTG 3' und 5 'CCGCTCTAGACTATTTGTCTGGTCCATCAAGC 3'). Die cDNA wurde dann kloniert in pcDNA3.1 + Expressionsvektor (Invitrogen). Die pGPH1 /GFP /Neo-SIRT3-shRNA Plasmid menschliche SIRT3 (5 'CTTGCTGCATGTGGTTGAT 3') und die Kontrolle shRNA Plasmid Targeting wurden von Genepharma erhalten. Um eine stabile Transfektanten erzeugen, AGS und SGC-7901-Zellen wurden unter Verwendung von Lipofectamin 2000 Reagenz (Invitrogen) und die stabilen Transfektanten wurden durch 400ug /ml G418 (Gibco) ausgewählt.

Die Zellproliferation und Klonogenizität Assay

Für Proliferationsassays wurden plattierten Zellen in einer 6-Well-Platte mit 2 x 10 ^{4 Zellen /Vertiefung. Die Zellproliferation wurde an den Tagen berechnet, 2, 4, 6 und 8 nach dem Ausplattieren. Für Klonogenizität Assay wurden plattierten Zellen in einer Platte mit 6 Vertiefungen mit unterschiedlichen Zellzahlen und kultiviert für 14 Tage, und Kolonien wurden dann mit Kristallviolett gefärbt, und die Anzahl der Kolonien (> 50 Zellen /Kolonie) wurde nach den etablierten Verfahren gezählt [31].}

Messung von Glukose, Laktat und Glykogen

Das Phenolrot freien Medium zur Kultivierung von Zellen in 6-Well-Platte für 24 Stunden und das Niveau der Glukose-Aufnahme und Laktaterzeugung verwendet wurde Verwendung des Glucose-Assay-Kits und Milchsäure Kit (Jiancheng Bioengineering Institute) gemessen. Die relativen Werte wurden auf die Zellzahl von jeder Vertiefung normalisiert. Cellular Glykogenspiegel wurden mit dem Glykogen-Assay-Kits (Biovision) nachgewiesen. Kurz gesagt, 1 × 10 ^{6 Zellen wurden in 200 ul Wasser auf Eis homogenisiert und die Homogenate wurden für 5 Minuten gekocht Enzyme zu inaktivieren und bei 4 ° C bei 13000 rpm für 5 Minuten zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen. Die Glykogen-Produktion wurde bei 570 nm mit dem OD-Wert gemessen.}

Die Messung der ATP-Produktion

Cellular ATP und ROS Ebenen, wie zuvor beschrieben gemessen wurden [32]. Zellen, die in einer 6-Well-Platte nach verschiedenen Behandlungen, wurden lysiert und zellulären ATP-Spiegel wurden mit ATP Biolumineszenz-Assay-Kit (Sigma) gemessen. Glykolyse-vermittelte ATP-Produktion Zur Messung wurden mit 2 &mgr; M Rotenon behandelten Zellen für 24 Stunden vor der Messung.

Die Messung der ROS Generation

Cellular ROS Generation wurde mit 5- getestet (und 6-) Carboxy-2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFDA) Verfahren unter Verwendung von Mikrotiterplatten-Spektrometer (Thermo Fisher) bei 488 nm /530 nm Wellenlänge.

MnSOD Aktivität

Zellen, die in einer 6-Well Platte wurden lysiert und MnSOD-Aktivität wurde durch WST-8-Verfahren unter Verwendung des MnSOD-Assay-Kits (Beyotime) nach den Anweisungen des Herstellers.

Tumorigenität Assays in Nacktmäusen

SGC7901 Zellen (7,5 x 10 bestimmt ^{6) mit SIRT3 Überexpression oder wurden in jeder Flanke von 5 Wochen alten männlichen in 0,1 ml PBS und geimpft suspendiert Knockdown Balb /c Nacktmäusen ohne Thymus und an die 28 th Tag nach der Impfung, wenn die maximale Tumorvolumen (~ 1500 mm 3) in der Kontrollgruppe erreichte, wurden die Versuche beendet und alle Tumoren, die aus jeder Gruppe wurden exzidiert und gewogen. Das experimentelle Verfahren beteiligt Tierversuchen wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts durchgeführt; die Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) in Xian Jiao Tong University speziell diese Studie (Protokollx181) genehmigt.}

Lactatdehydrogenase-Assay

Die Laktat-Dehydrogenase-Aktivität nach dem festgelegten Protokoll bestimmt wurde durch die Reduktionsrate der Extinktion bei einer Wellenlänge von 340 nm gemessen wurde aus der Oxidation von NADH resultierenden [27]. Kurz gesagt, wurden die Zellen in 10 cm-Schalen und homogenisiert in PBS auf Eis. Die Homogenate wurden hinzugefügt, in Puffer, enthaltend 6,6 mM NADH, 30 mM Natriumpyruvat und 0,2 M Tris-HCl, pH 7,3 und gemischt. Inkubieren Sie die Mischung für 5 Minuten zum Temperaturausgleich zu erreichen und dann die Abnahmerate der Absorption bei 340 nm aufgezeichnet.

SIRT3 In-vitro-
Deacetylierung Assay

Human SIRT3 rekombinanten Enzyms ( BPS) wurde mit L-Lactatdehydrogenase aus Rinderherz (Sigma) in Reaktionspuffer (50 mM NaCl, 4 mM MgCl _{2, 10 mM NAD ^{+, 50 mM DTT, 50 mM Tris, pH 8,0) inkubiert, mit /ohne SIRT3 Inhibitor Nicotinamid (NAM, 10 mM) bei 37 ° C für 1,5 Stunden, und dann wurden die Reaktionen für LDHA Aktivitätsassay verwendet, wie oben beschrieben.}}

Real-time PCR

gesamt-RNA wurde mit Trizol-Reagens (Invitrogen) gefolgt von der Behandlung mit Phenol /Chloroform und Fällung mit 2-Propanol isoliert. Gesamt-RNA-Pellet wurde dann mit 75% Ethanol gewaschen und in Wasser gewaschen. RNA wurde mit PrimeScript RT-PCR Kit (Takara) und quantitative Echtzeit-PCR-Analyse von Genen von Interesse reversen Transkription unterzogen wurde unter Verwendung von SYBR PremixExTaq II-Kit durchgeführt (Takara) nach den Anweisungen des Herstellers. Daten wurden normalisiert auf das Niveau von γ-Tubulin.

Immunofluorescence

AGS ausgesäten Zellen auf dem Deckglas in einer 6-Well-Platte wurden in 4% Paraformaldehyd für 10 Minuten fixiert und in 1% blockierte BSA für 1 Stunde bei RT. Inkubiere Zellen mit primären Antikörpern gegen SIRT3 und LDHA bei 4 ° C über Nacht, gefolgt von einer Inkubation mit fluoreszenz-konjugiertem Sekundärantikörper für 1 Stunde bei RT. Gegenfärbung wurde mit DAPI Immunofluoreszenz-Kit (Beyotime) durchgeführt. Zellen wurden montiert und durch Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop abgebildet wird.

Statistical analysis

Die Daten sind als Mittelwert ± SE aus zumindest drei unabhängigen Experimenten dargestellt. Die statistische Analyse wurde mit ungepaarten two-tailed Student t-Test durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. P
< 0,05 wurde als signifikant betrachtet.

Ergebnisse

• PLoS ONE: Lymphknotenmetastase, eine einzigartige unabhängiger prognostischer Faktor in Magenfrüh Cancer
• PLoS ONE: Identifizierung und Charakterisierung von CXCR4-positivem Magenkrebs Stammzellen