PLoS ONE: NME2 Reduziert Proliferation, Migration und Invasion von Magenkrebszellen Metastasis

Abstrakt

Magenkrebs zu beschränken, ist eine der häufigsten bösartigen Tumoren und hat eine hohe Rate von Metastasen. Wir vermuten, dass NME2
(Nukleosid Diphosphatkinase 2), die als anti-metastatischen Gen betrachtet wurde, hat eine Rolle bei der Invasivität von Magenkrebszellen spielt. Verwendung eines Gewebe-Chip-Technologie und Immunhistochemie, haben wir gezeigt, dass die Expression mit NME2 Ebenen der Differenzierung von Magenkrebszellen und deren Metastasen in den Lymphknoten assoziiert war. Wenn die NME2
Genprodukt überexprimiert durch; In-vitro-
stabile Transfektion, hatte Magenkrebszellen aus BGC823 und MKN45 Zelllinien Raten der Proliferation, Migration reduziert und Invasion durch das Kollagen Matrix, eine hemmende Aktivität von NME2 bei der Ausbreitung und Invasion von Magenkrebs hindeutet. NME2 könnte daher schwerer als Risikomarker für Magenkrebs Invasivität und ein mögliches neues Ziel für die Gentherapie zu verbessern oder NME2 Expression induzieren

Citation:. Liu Yf, Yang A, Liu W, Wang C, Wang M, Zhang L, et al. (2015) NME2 Reduziert Proliferation, Migration und Invasion von Magenkrebszellen Metastasierung zu begrenzen. PLoS ONE 10 (2): e0115968. doi: 10.1371 /journal.pone.0115968

Academic Editor: Jian Cao, Stony Brook University, UNITED STATES

Empfangen: 18. April 2014; Akzeptiert: 3. Dezember 2014; Veröffentlicht: 20. Februar 2015

Copyright: © 2015 Liu et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, sofern der Autor und Quelle gutgeschrieben

Die Finanzierung: Diese Studie wurde unterstützt durch das Programm unterstützt für Chang-Jiang Wissenschaftler und innovative Forschungsteam in der Universität (PCSIRT: IRT1137) und die Grundlagenforschung Fonds für die zentralen Universitäten (lzujbky 2013-CT06). Die Geldgeber hatten keine Rolle im Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung zu veröffentlichen, oder Erstellung dieses Manuskripts

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Krebs bleibt als führende Todesursache, einem Anteil von 14,1 Millionen Neuerkrankungen und 8,2 Millionen Todesfälle im Jahr 2012 [1]. Die Zahl der neuen Fälle werden voraussichtlich innerhalb der nächsten zwei Jahrzehnte auf 22 Mio. 70% weltweit zu erhöhen [2]. Cancers in der Lunge, Magen, Leber, Darm-und Brüste haben die höchste Sterblichkeit [3]. Magenkrebszellen können auf benachbarte Organe direkt verteilt (lokale Invasion), wie der Bauchspeicheldrüse, dem Colon transversum, der Leber und der Milz sowie an entfernte Lymphknoten, Lunge und Knochengewebe. Während sie zwei verschiedene pathologische Prozesse werden lokale Invasion und Fernmetastasen miteinander verbunden, wo oft die erstere fördert und verbreitet die letztere. Genetische Mutationen und ihre abweichende Produkte sind wichtige Merkmale und Enabler von Krebszellen für die Proliferation, Apoptose-Resistenz, lokale Invasion, Metastasierung, Immunevasion, Angiogenese und als Reaktion auf DNA-Schäden. NME
(Nukleosid Diphosphatkinase 2 oder Nicht-metastatischen Zellen) stellt eine Gruppe von Krebs-assoziierten und /oder Krebs-regulierenden Genen.

NME
einer Familie besteht von 10 Genen, die auch bekannt als der NM23
Gene sind [4] und hat mit Unterdrückung von Krebsmetastasen und Invasion zu lokalen Gewebe in Verbindung gebracht worden [5]. Unter den Mitgliedern dieser Genfamilie, NME1
und NME2
haben für ihre krebsunterdrückenden Aktivitäten intensiv untersucht worden. NME2
, das auf Chromosom 17q21 [6,7] zugeordnet ist, codiert die B-Untereinheit des Nucleosid-diphosphat (NDP) kinase [4]. Ihr Produkt wurde berichtet, die Metastasierung von Brustkrebs und Melanom-Zellen zu hemmen; und eine Abnahme in ihrer Expression wurde mit einem größeren metastatischen Potential dieser Krebsarten korreliert [8,9]. Allerdings NME2
Überexpression wurde auch mit einer schlechten Prognose für Neuroblastom und Osteosarkom [10,11] verbunden. Darüber hinaus wurde die NME2
Gen nicht mit der Metastasierung von Endometrium hepatozellulären und Schilddrüsenkarzinom [12-14] korreliert. Diese scheinbar widersprüchlichen Daten schlagen vor, daß NME2 haben unterschiedliche Effekte auf verschiedene Arten von Krebszellen und ihre Fähigkeit, lokal auf das umgebende Gewebe einzudringen oder an entfernte Organe metastasieren.

Aufgrund dieser vielfältigen NME2 Aktivitäten auf verschiedenen Krebsarten, analysierten wir Gewebe chirurgisch von Patienten mit Magenkrebs entfernt und der NME2 Expression in diesen Geweben mit ihren pathologischen Eigenschaften in Verbindung gebracht. Diese Pathologie Studie wurde von ergänzt in vitro
Experimente, in denen wir Raten der Proliferation, Migration und Invasion von Magenkrebszellen untersucht, die mit einem menschlichen NME2
cDNA stabil transfiziert worden sind, ihr Produkt zu überexprimieren . Diese In-vitro-
Experimente sollen die Invasivität von Krebszellen zu verstehen, die verschiedenen Ebenen der NME2 auszudrücken.

Materialien und Methoden

Diese Studie wurde von der Ethikkommission genehmigt wurde am Humanforschung der Universität Lanzhou, School of Medicine durchführt. Die Patienten oder ihre Erziehungsberechtigten, wenn ihr eine schriftliche Einverständniserklärung, bevor sie in die Studie rekrutiert werden.

Tissue Immunhistochemie

Wir NME2 Ausdruck bei Magenkrebs und angrenzenden normalen Gewebe chirurgisch entfernt analysiert von 139 Patienten in die Armee zugelassen Regional Hospital in der Stadt Lanzhou von 2011 bis 2012 bei keinem der Patienten erhielten eine Chemotherapie oder Strahlentherapie vor der Operation. Diese chirurgisch entfernt Krebsgewebe wurden für Hämatoxylin und Eosin (HE) Färbung verarbeitet. Kurz gesagt, wurde ein Wachsmodul 42 Öffnungslöcher (6 × 7 Löcher /Chip) von je 2 mm gestanzt. Die Gewebeblöcke wurden in diesen Löchern (eine Probe /Loch) eingebettet ist. Dieses Wachs Modul wurde dann geschnitten, so dass Gewebe von 40 Patienten gleichzeitig auf einem einzigen Objektträger untersucht werden konnte Fleck Einheitlichkeit zu gewährleisten. Zur Kontrolle wurden ersten und letzten Löchern mit Gewebe aus dem nicht-kanzerösen Leber und Niere eingebettet sind. NME2 Expression nachgewiesen wurde Kommerzielle Immunhistochemie-Kit (Beijing ZSGB Biotechnology Co., Ltd.) mit einem Kaninchen-Anti-Human NME2 Antikörper (1: 300 Verdünnung, Beijing Biosynthese Biotechnology Co., Ltd.) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Ebenen der NME2 Expression wurden numerisch erzielt, wie in Tabelle 1 durch einen Pathologen gezeigt, die an der klinischen Informationen dieser Patienten geblendet wurde.

Zellkultur und cDNA-Transfektion

Zellen aus dem BGC823 und MKN45 Magen Krebszelllinien wurden von der chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) erworben. Die Zellen in der BGC823 Linie waren ursprünglich von einem 62-jährigen Mann mit schlecht differenzierten Adenokarzinom des Magens und die in der von einer metastatischen Masse der Leber von einem 62-jährigen Japanerin mit einem undifferenzierten Adenokarzinom abgeleitet MKN45 Linie der Magen. Zellen, die aus den beiden Linien hatten Restmengen an NME2 Expression und sind daher ideal für die Auswirkungen von überexprimierten Genprodukts dieses auf Magenkrebszellen studiert in vitro
.

Die Zellen in einem kultiviert DMEM-Medium (Sigma, St. Louis, MO, USA) mit 10% fötalem Kälberserum (Hangzhou Sijiqing Biological Engineering Materials Co., Ltd, Hangzhou, China) bei 37 ° C mit 5% CO _{2 und 95 % Luft. Bei 70-80% Konfluenz wurden diese Zellen für die menschliche NME2
Gen mit einer cDNA transfiziert, die in einen Vektor pcDNA3.1 (Shanghai Genepharma Co., Ltd. Shanghai, China) unter Verwendung von Lipofectamin 2000 kloniert als DNA-Träger (Invitrogen, Grand Island, NY, USA). Zellen wurden durch Züchten der transfizierten Zellen in DMEM-Medium, das 1 ausgewählt stabil NME2 (bezeichnet als NME2) Exprimieren mg /ml G418. Die Kontrollzellen mit dem pcDNA-Vektor transfiziert wurden, ohne die NME2
cDNA-Insert (als Mock bezeichnet) und unterzog die gleiche Auswahl. Un-parentale Zellen wurden auch als Baseline-Kontrollen untersucht. Eine Überexpression von NME2 wurde durch RT-PCR bestimmt die Höhe von NME2
mRNA und durch Immunblots von transfizierten Zelllysaten unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers NME2 zu quantifizieren (. 1: 100 Verdünnung, Beijing Biosynthesis Biotechnology Co, Ltd)}

RNA-Isolierung und RT-PCR

Gesamt-RNA aus transfizierten und nicht-transfizierten Zellen isoliert wurde eine kommerzielle RNA Isolation Kit (Takara Biotechnology, Dalian, Liaoning, China) nach den Anweisungen des Herstellers. RNA (2 &mgr; g) aus jeder Probe wurde revers transkribiert eine PrimeScript RT Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers. Die komplementäre DNA umgekehrt von der aus diesen Zellen extrahiert RNA transkribiert wurde durch eine Taq-Polymerase unter Verwendung der folgenden Primer für die NME2
cDNA amplifiziert: 5'-AAGCAGCACTACATTGACCTGAAA-3 '(vorwärts) und 5'-GGTCTCCCCAAGCATCACTC-3 '(rückwärts). Glyceraldehyde 3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) wurde auch als Kontrolle unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert: 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 '(vorwärts) und 5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3' (rückwärts). Die Amplifikationsreaktion wurde bei 95 ° C, gefolgt von 30 Zyklen der Vorlage bei 94 ° C für 1 min, Primer-Annealing bei 60 ° C für 1min, und Primerextension für 1 min bei 72 ° C Denaturierung für 5 Minuten, gefolgt durch Denaturierung DNA initiiert. Die NME2 Überexpression wurde quantitativ als eine Zunahme in NME2
mRNA, die durch zweifache oder mehr von der Grundlinie durch Schein-transfizierten Zellen gesetzt definiert.

Immunfluoreszenzfärbung der NME2
Produkt

transfizierte Zellen stabil mit dem NME2
cDNA und einem Fahrzeug Vektor wurden auf Deckgläser plattiert und bis zur Konfluenz wachsen gelassen. Sie wurden zweimal mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), fixiert in 4% Paraformaldehyd in PBS für 15min, permeabilisiert mit 0,5% Triton X-100 gespült und mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) inkubiert, 30 min zu blockieren unspezifische Bindung. für 24 h bei 4 ° C, gefolgt von Inkubation mit einem FITC-konjugierten sekundären Antikörper (1: 100, Beijing Biosynthesis Biotechnology) 1 Stunde: Die Zellen wurden dann mit einem Kaninchen-Antikörper gegen menschliches NME2 (100, Beijing Biosynthesis Biotechnology 1) inkubierten . Alle Antikörper wurden verdünnt in PBS 1% BSA enthält. . Die Zellkerne wurden mit DAPI (1: 100 in PBS, 10 min bei Raumtemperatur) gegengefärbt

Zellzyklusanalyse

Zellen, die stabil NME2 und Kontrollzellen in Kultur exprimieren, wurden gesammelt und mit 70% Fest eiskaltem Ethanol bei 4 ° C für 24 h, zweimal mit eiskaltem PBS und dann mit RNase A (20 &mgr; g /ml) für 30 min bei 37 ° C behandelt. Sie wurden mit Propidiumiodid (10 ug /ml Endkonzentration) in der Dunkelheit für 30 min bei Raumtemperatur vor der Analyse mittels Durchflußzytometrie für die DNA-Ploidie inkubiert.

Colony-Bildungstest

Transfizierte und Kontrollzellen wurden bei einer anfänglichen Dichte von 1000 Zellen kultiviert pro 100-mm-Kulturschale in einem vollständigen DMEM Medium für bis zu 4 Wochen. Sie wurden dann mit Methylviolett gefärbt. Alle Zellkolonien, die größer als 2 mm im Durchmesser waren (≥50 enthaltenen Zellen) wurden in drei separaten Speisen gezählt und als Mittelwert ± SEM. Zum Zwecke der Datenvalidierung, wir gezählt auch lebensfähige Zellen, die für bis zu 96 Stunden kultiviert worden waren. Kurz gesagt, die elterliche BCG823 und MKN45-Zellen und Zellen, die stabil mit entweder einem menschlichen transfiziert wurden NME2
cDNA oder dem Fahrzeug-Vektor (pc-DNA 3.1) wurden bei einer Dichte von 2 x 10 ^{4 Zellen /ml. Sie wurden bei 1600 x g 48-96 Stunden nach der ersten Aussaat mit 1% Trypsin und zentrifugiert abgelöst. Zellpellets wurden in PBS gewaschen und mit 0,04% Trypanblau für 3 min resuspendiert. Überlebende Zellen wurden mit einem Hämocytometer gezählt.}

Assays für Zellmigration

Zwei komplementäre Assays durchgeführt wurden, um die Auswirkungen von überexprimierten NME2 auf die Geschwindigkeit der Zellmigration zu messen. Erste war ein Wundheilungs Assay, wo Zellen wurden in Platten mit 6 Vertiefungen plattiert und man ließ sie ≥ 95% konfluent wachsen. Nach dem Waschen wurden die Zellen zweimal mit PBS, um eine sterile Pipettenspitze verwendet, um die Zellschicht (4-5 parallel Kratzer /Platte) zu kratzen. Die Zellen wurden wieder mit PBS gewaschen, fotografiert verkratzt Spuren zu markieren, und mit 2,5 ml serumfreiem DMEM-Medium inkubiert. Bei einer Basisrate von Zellmigration wurde eine verkratzte Fläche teilweise durch Zellen bedeckt in den verletzten Bereich von 24-48 h nach der Verletzung migriert, was zu einer kleineren zellfreien Umgebung. Weil dieser Wundheilungs Assay semi-quantitativ ist, wurden die Ergebnisse weiter durch eine Zellmigrationsassay Transwell validiert. Kurz gesagt, 6 × 10 ^{5 in 500 &mgr; l serumfreiem Medium, enthaltend 0,1% BSA suspendierten Zellen wurden in einem Transwell (BD Biosciences) überzogen, die in einer Platte mit 24 Vertiefungen platziert wurde. Die untere Kammer enthielt 500 ul komplettem DMEM Medium. Die Zellen wurden für 24 h in der oberen Kammer wachsen gelassen, um die Zellmigration aus der oberen Kammer in die untere Kammer erleichtern. Am Ende dieser Inkubationsperiode wurde die Membran in der oberen Kammer mit 4% Paraformaldehyd fixiert für 30 min, mit distill Wasser gewaschen und luftgetrocknet. Zellen, die auf der gegenüberliegenden Seite der Kammer (transmigrierten) wurden unter einem Mikroskop oben rechts mit 0,1% Methylviolett (Dade-Behring, Newark, DE) 30 min, gewaschen und gefärbt betrachtet (x 400, Nikon). Die Zellmigration wurde als Anzahl von Zellen auf der Membran in 5 zufällige Bewertung Felder definiert.}

Assay für
Zellinvasion

Transwell Kammern wurden mit Rattenschwanz Typ beschichtet I fibrillärem Kollagen [15] 30 min bei 37 ° C. Überschüssige Flüssigkeit wurde entfernt und beschichteten Kammern wurden Luft für 1 Stunde in einer sterilen Umgebung getrocknet. Zellen wurden in 500 ul serumfreies DMEM-Medium, enthaltend 0,1% BSA auf eine endgültige Dichte von 6 × 10 ^{5 und ausplattiert auf der Kollagenmatrix in einem Transwell suspendiert, die in einer Platte mit 24 Vertiefungen platziert wurde. Die untere Kammer enthielt 500 ul komplettem DMEM Medium. Zellen auf der Membranoberfläche blieb wurden vorsichtig 24 Stunden entfernt, nachdem die Zellen ausgesät und die Membran wurden, wurde fixiert und gefärbt für Zellen, die durch die Kollagen-Matrix zu der gegenüberliegenden Seite der Transwell-Membran transmigrierten hatte.}

Statistische Analysen

Alle Daten wurden analysiert, um die SPSS 20.0 statistische Programm. Quantitative Werte wurden als Mittelwert und SEM ausgedrückt. Die folgenden statistischen Analysen wurden in der Studie verwendet: Fisher-Test oder Chi-Quadrat-Test für die Definition der Beziehung zwischen NME2 Ausdruck und pathologischen Eigenschaften von Krebsgewebe; Einweg-ANOVA für Gruppenvergleich zwischen Elternzellen und entweder mit einem Fahrzeug Vektor oder ein humaner Zellen NME2
cDNA; und Pearson-Analyse für die Korrelation zwischen NME2 Expression und Differenzierung und Metastasierung von Krebszellen.

Ergebnisse |

Verband der NME2 Ausdruck mit histologischen Eigenschaften von Magenkrebs

Wir sammelten chirurgische Probe aus 139 Patienten mit einem Adenokarzinom des Magens. Tabelle 2 listet die demografische Informationen dieser Patienten und histologischen Eigenschaften von Krebsgewebe von diesen Patienten. NME2 Ausdruck war schwach oder nicht in schlecht differenzierten Gewebe entdeckt, war aber auf einem Niveau, in gut differenzierten Gewebe intensiv vergleichbar mit angrenzenden normalen Gewebe (Abb. 1). Ein hohes Maß an NME2-Expression wurde mit einem deutlich reduzierten Rate von Metastasen in den Lymphknoten assoziiert ( p
= 0,038), aber nicht mit der Größe des Primärtumors und einer Tiefe von Krebs Invasion. Ein Pearson-Korrelationsanalyse zeigte, dass NME2 Ausdruck unabhängig mit Raten der Zelldifferenzierung (r = 0,436, p
= 0,000) und die Ausbreitung auf die lokalen Lymphknoten (r = -0,281, assoziiert p
= 0,001, Tabelle 1).

Wirkung von NME2 auf die Proliferation von Magenkrebszellen in Kultur

weiter Um die Zuordnung von NME2 Ausdruck mit pathologischen Eigenschaften von Magenkrebszellen zu untersuchen, untersuchten wir Zellen von der BGC823 und Magenkrebs Linien MKN45, die im Vergleich zu schlecht differenzierten Krebsgewebe NME2 schwach auf einem Niveau exprimiert (Abb. 1). Diese Zellen wurden mit einem menschlichen transfizierten NME2
cDNA NME2 überexprimiert quantitativ gemessen durch eine Erhöhung der NME2
mRNA (quantitative RT-PCR) und NME2 Proteinprodukt (Immunofluoreszenz, Abb. 2 ).

Wir untersuchten dann, wie durch Messung der DNA-Ploidie und Koloniebildung dieser Zellen NME2 reguliert Zellwachstum überexprimieren. Wir haben festgestellt keinen Unterschied in der DNA-Ploidie zwischen Zellen NME2 und diesen nicht-transfizierten und mock-transfizierten Zellen, die aus den beiden Linien (Tabelle 3 und Fig S1.) Überexprimieren, was darauf hindeutet, dass eine Erhöhung in NME2 Expression keinen Einfluß auf die Zellzyklen hatten. Jedoch hatte NME2-überexprimierenden Zellen eine signifikant reduzierte Fähigkeit Kolonien in der Kultur zu bilden, im Vergleich zu Schein-transfizierten und nicht-transfizierten Zellen (Fig. 3). Diese Beobachtung wurde durch die Ergebnisse aus einer Zelle-Zählmethode (Abb. 3C) validiert

Wirkung von NME2 auf die Zellmigration und Invasion

Wir untersuchten neben der Fähigkeit von NME2-überexprimierenden Zellen zu migrieren, weil eine gerichtete Migration ist eine wichtige Voraussetzung für die Invasion von Krebszellen umgebende Gewebe. Diese gerichtete Migration wurde mit einem Wundheilungs Test untersucht, die die Geschwindigkeit der Zellen Migration in den Bereich der Verletzung durch einen scharfen Gegenstand geschaffen misst. Wie in gezeigt. 4A und 4B, die Breite eines verletzten Bereich nach 48 Stunden in Kulturen größer war für NME2
transfizierten Zellen als bei nicht-transfizierten und mock-transfizierten Zellen. Die langsame Migration wurde in Zellen aus beiden Zellinien gefunden, was darauf hindeutet, dass die Zellen NME2 überexprimieren migrierten viel langsamer. Da diese Wunde Assay Heilung ist semi-quantitative, messen wir auch quantitativ die Rate der Zellmigration eine Transwell-Assay. Übereinstimmend mit der Wundheilungs Assay NME2 überexprimierenden Zellen bei ~ 50% der nicht-transfizierten oder mock-transfizierten Zellen (Fig. 4) migriert.

Eine Abnahme der Zellmigration potentiell die Fähigkeit dieser Zellen verringern könnte einzufallen umgebende Gewebe. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, messen wir die Invasion von Krebszellen in die Kollagenmatrix in einem gut etablierten Transwell-Kammer-Assay. BGC823 Zellen, die NME2 überexprimiert deutlich reduziert ihre Fähigkeit, eine Kollagen-Matrix zu 60% der nicht-transfizierten und mock-transfizierten Zellen (Abb. 5) einzudringen. Die Rate der Invasion wurde in MKN45 Zellen mit dem NME2
cDNA Elternzellen im Vergleich transfiziert ähnlich reduziert und die mit einem Fahrzeug Vektor transfiziert (Abb. 5).

Diskussion

Wir haben die Beziehung zwischen der NME2 Expression und Eigenschaften von Magenkrebs in Geweben von Patienten chirurgisch und in kultivierten Zellen von zwei bekannten Magenkrebs Leitungen entfernt sucht. Die Studie ist notwendig, weil NME2
zunächst als erste Metastase-Suppressor-Gen identifiziert wurde, aber seine Fähigkeit, erscheint Krebs lokale Invasion und Metastasierung remote zu blockieren Zelltyp spezifisch unter Krebsarten sein, die bisher untersucht worden [8- 14]. Zum Beispiel zeigte eine Analyse von 35 Patienten mit Schilddrüsen Papillarkarzinom und 11 der Lymphknotenmetastasen eine signifikant reduzierte Niveau des NME1
mRNA in metastatischen Lymphknoten, während NME2
mRNA nicht geändert wurde in den ursprünglichen Tumor und Lymphknoten [14], was darauf hindeutet Differentialrollen NME1 und NME2 in der Krebsinvasion und Metastasierung. Eine Meta-Analyse von 278 Patienten mit Darmkrebs, 177 mit Brustkrebs, 137 mit Eierstockkrebs und 77 mit Lungenkrebs fand auch ein geringeres Maß an NME2 Ausdruck bei metastasierendem Krebs im Vergleich mit nicht-metastasiertem Krebs [17]. Doch trotz einer negativen Assoziation zwischen NME1 /NME2 Ausdruck und Krebsinvasion auf den lokalen Lymphknoten und Endometrium-Infiltration, NME-Expression wurde nicht mit TNM-Scores und die Differenzierung von intrauterine Membran-Karzinom und Gebärmutterhalskrebs [16] verbunden. Hier bieten wir verschiedene Hinweise, dass NME2 begrenzt die Proliferation, Migration und Invasion an die extrazelluläre Matrix von Magenkrebszellen.

Als erstes wird ein höheres Maß an NME2 Ausdruck gefunden wird in gut differenzierte und weniger invasive Gewebe von Magenkrebs chirurgisch vor der Chemotherapie und Strahlentherapie in einer großen Patientengruppe (Tabelle 1 &. Bild 1) entfernt. Die Metastasierung von Krebs zu lokalen Lymphknoten wurde häufiger in Krebsgewebe gefunden, die einen niedrigen Gehalt an NME2 Ausdruck und diese Korrelation zwischen NME2 Ausdruck und Differenzierung /Metastasierung bei diesen Patientengewebe hatte bleibt, nachdem die Daten für Alter, Geschlecht geschichtet wurden die Größe des Primärtumors und der Tiefe der Invasion (Tabelle 1 & 2). Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit einem kürzlich veröffentlichten Bericht, dass NME2 die Telomer-Wiederholungs bindet Faktor 2 im Kern Bindung Telomerase-Aktivität zu reduzieren [37], eine mechanistische Verbindung zwischen NME2 Expression und Überleben von Krebszellen hindeutet.

Zweitens: Wir suchten Wirkungen der über~~POS=TRUNC NME2 auf die Raten der Proliferation, Migration und Invasion der extrazellulären Matrix in vitro
von Zellen aus den zwei gut untersuchten Magenkrebszelllinien und BGC823 MKN45 [18-21]. Die Transfektion mit einem menschlichen NME2
cDNA resultierte in einem zweifachen oder höheren Grad an NME2 Expression in diesen Zellen als transfizierten Zellen zu mock verglichen (Fig. 2). Diese NME2 Überexpression hatte keinen Einfluss auf DNA-Ploidie (Tabelle 3), aber deutlich verlangsamt die Koloniebildung dieser Zellen (Fig. 3), was darauf hindeutet, dass überexprimieren NME2 einen Übergang von DNA-Replikation zu Mitose verzögert. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit früheren Berichten, dass NME2 nicht das Wachstum von kultivierten Krebszellen beeinflussen und ist nicht mit der Größe der primären Krebs in Tiere implantiert assoziiert [22-27]. Es ist jedoch nicht mit Berichten, dass NME2 fördert [28,29] oder verringert [30] die Proliferation von anderen Arten von Krebszellen. Genaue Gründe für die Diskrepanz bleibt weiter untersucht werden, aber diese Daten deuten darauf hin, zelltypspezifische Effekte der NME2
Gen auf die Pathogenese von Krebserkrankungen.

Drittens im Gegensatz zu einem minimalen Effekt auf die Proliferation von Magenkrebszellen, führt die Überexpression von NME2 eine signifikante Reduktion der Zellmigration und Invasion durch die Kollagenmatrix, wie in gezeigt, drei verschiedene, aber komplementäre Assays (Figuren 4 &. 5). Unsere Daten unterstützen frühere Ergebnisse von ähnlichen hemmende Wirkung auf Brustkrebs [8], oral Plattenepithel-Krebs [28] und Melanomzellen [9], obwohl Ausnahmen wieder in hepatozellulären festgestellt wurden [13,29] und kolorektalen Karzinomen Zellen [31]. Es bleibt als ob reduzierte Migration und Invasion von NME2-überexprimierenden Zellen bestimmt werden, werden von einer verminderten Fähigkeit dieser Zellen zur Proliferation geführt.

Unsere Ergebnisse Magenkrebszellen empfindlich gegen überexprimiert NME2 identifiziert, sondern ein kritische Frage bleibt, was diese vielfältigen NME2 Aktivitäten zwischen den verschiedenen Arten von Krebszellen reguliert. Ein potentieller Mechanismus ist, dass eine NME2 Aktivität hängt von up- und downstream-Moleküle, die mit NME2 in einem bestimmten Zelltyp zu interagieren. Mehrere Moleküle wurden zuvor identifizierten interagieren oder zu regulieren NME2 wie EGFR, c-erbB-2
, c-erbB-3
und Sexualsteroidrezeptor in Ovarialkarzinomen [32]. Plakoglobin wurde berichtet, mit NME2 zusammenzuwirken seine Expression in Zellen von menschlichen Zunge Plattenepithelkarzinom zu fördern [33]. NME2 wurde auch mit MDM2 (Mouse Doppel Minute 2 homolog) zu verringern, die Motilität der Nierenkarzinomzellen [34] gefunden zu interagieren. MDM2 ist eine E3 Ubiquitin-Protein-Ligase und dient als negativer Regulator des p53-Tumor-Suppressor. Die Beziehung zwischen NME2
Gen und Gene von myc
Familie scheint komplizierter zu sein. Produkte von der NME1
und NME2
Gene wurden vorgeschlagen, die hinter dem c- myc
Regulationsweg zu sein [7] und in der Down-Regulation beteiligt von cdc42-Funktion in neuroblastoma [35]. NME2 ist auch mit dem G-Quadruplex-DNA in Nucleasefragment überempfindlich Element des c-myc
Promotor zur Interaktion berichtet c-myc-Expression [36] induzieren. Ein System biologischer Ansatz diese spezifischen Wege statt einzelner Moleküle zu untersuchen, erforderlich sein können Rollen der NME2
Gen und sein Produkt in verschiedenen Krebsarten zu sezieren.

Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass eine Überexpression von NME2 die Migration und Invasion von Magenkrebszellen auf die zelluläre Matrix reduziert in-vitro-
. Als Ergebnis wird NME2 Ausdruck mit der gut differenzierten und weniger invasitve Histologie von Magenkrebs in Verbindung gebracht. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die NME2
Gen und sein Produkt als potentieller Marker dienen können die Invasivität von Magenkrebs und auch als ein therapeutisches Ziel für die Vorhersage, dass hochreguliert durch Gentherapie werden kann.

Hintergrundinformationen
S1 Abb. Wirkung von NME2 Überexpression auf die Magenkrebszellen, Zellzyklus.
Die DNA-Ploidie von Zellen, transfiziert mit NME2
cDNA mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung eines kommerziellen Kits nach den Anweisungen des Herstellers analysiert. Die Platten A-C wurden für die elterliche BCG823 Zellen und solche, transfiziert mit dem NME2
cDNA oder Vektor. Die Platten D-F wurden für MKN45 Zellen mit den gleichen Behandlungen
doi:. 10.1371 /journal.pone.0115968.s001
(DOC)

• PLoS ONE: Transkriptionsfaktoren und microRNA-Co-regulierte Gene in Magenkrebs Invasion in Ex Vivo
• PLoS ONE: Die klinische Bedeutung und Risikofaktoren von Solitary Lymphknotenmetastase in Magenkrebs