PLoS ONE: Multiple-to-Multiple Beziehungen zwischen MicroRNAs und Zielgene in Gastric Cancer

Abstrakt

MicroRNAs (miRNAs) als Transkriptionsregulatoren wirken und eine entscheidende Rolle bei der Krebsentstehung spielen. Nach miRNA Zieldatenbanken kann man miRNA viele Gene wie seine Ziele zu regulieren, während ein Gen von vielen miRNAs gezielt werden kann. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Beziehungen zwischen miRNAs und ihre Ziele nicht eins zu eins sein. Allerdings haben viele Berichte beschrieben nur eine Eins-zu-Eins, Eins-zu-mehrere oder mehrere zu eins Beziehung zwischen miRNA und dessen Zielgen in menschlichen Krebsarten. Somit ist es notwendig, zu bestimmen, ob eine Kombination von einigen miRNAs mehrere Ziele regulieren würde und in der Karzinogenese beteiligt sein. Um einige Gruppen von miRNAs finden, die synergetisch ihre Ziele in der menschlichen Magenkrebs (GC) regulieren können wir unseren bisherigen miRNA-Expression Array-Daten erneut analysiert und festgestellt, dass 50 miRNAs waren hochreguliert bei der Behandlung mit 5-Aza-2'-Desoxycytidin in einer GC-Zelllinie. Die "TargetScan" miRNA Zieldatenbank prognostiziert, dass einige dieser miRNAs gemeinsame Zielgene haben. Wir verwies auch auf die GEO-Datenbank für die Expression dieser gemeinsamen Zielgene in menschlichen GCs, die Magen-Krebsentstehung in Zusammenhang stehen könnten. In dieser Studie untersuchten wir zwei miRNA Kombinationen, miR-224 und -452, und miR-181c und -340. Die Überexpression beider miRNA Kombinationen dramatisch herunterreguliert ihre Zielgene, DPYSL2
und KRAS
und KRAS
und MECP2
sind. Diese miRNA Kombinationen synergistisch verminderte Zellproliferation bei Transfektion. Darüber hinaus ergab wir, dass diese miRNAs wurden herunterreguliert durch Promotor-Hypermethylierung in GC-Zellen. Somit ist es wahrscheinlich, dass die Beziehungen zwischen miRNAs und ihre Ziele sind nicht eins-zu-eins sondern mehrere zu mehreren in GCs und dass diese komplexen Zusammenhänge magen Karzinogenese in Beziehung gesetzt werden kann

Citation. Hashimoto Y, Akiyama Y, Y Yuasa (2013) Multiple-to-Multiple Beziehungen zwischen MicroRNAs und Zielgene in Magenkrebs. PLoS ONE 8 (5): e62589. doi: 10.1371 /journal.pone.0062589

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan

Empfangen: 14. Dezember 2012; Akzeptiert: 24. März 2013 beginnen; Veröffentlicht am: 8. Mai 2013

Copyright: © 2013 Hashimoto et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse von der A3 Foresight-Programm der Japan-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaft (JSPS) (YY) und Forschungsstipendien der JSPS für junge Wissenschaftler (YH) unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

MicroRNAs (miRNAs), eine Klasse von kleinen nicht-Protein-kodierenden RNAs wurden als eine neue Art von Gen-Regulator identifiziert, die den 3'-untranslatierten Regionen (UTRs) der Ziel-mRNA binden, wodurch sich ergeb in mRNA Abbau oder die Blockade von mRNA-Translation [1]. Es ist allgemein bekannt, dass Veränderungen miRNA mit Tumorigenese assoziiert sind [1]. Nach miRNA Zieldatenbanken kann man miRNA viele Gene wie seine Ziele zu regulieren, während ein Gen von vielen miRNAs gezielt werden kann. zahlreiche Untersuchungen zeigten jedoch eine Eins-zu-Eins-Beziehung zwischen miRNA und dessen Zielgen. Es wurde auch berichtet, dass mehrere oder eine Gruppe von miRNAs kooperativ ein Gen regulieren, die Karzinogenese verbunden ist [2] - [4]. Auf der anderen Seite sind mehrere Gene, die durch eine miRNA [3] gezielte, [4]. Auch mehrere zu vielfältigen Beziehungen zwischen miRNAs und Ziele wurden unter Verwendung von Computeranalysen berichtet [5], [6]. Allerdings gab es nur wenige Papiere experimentell mehrfach zu mehrere Beziehungen in Krebszellen zu validieren.

Magenkrebs die vierthäufigste menschliche bösartige Erkrankung ist und die zweithäufigste Ursache von Krebs-Todesfälle weltweit, mit schätzungsweise eine Million neue Fälle pro Jahr [7]. Magenkarzinome sind histologisch klassifiziert in zwei Haupttypen, die Darm- und diffuse Typen [8]. Diffuse-Typ GC ist oft schwer zu und zeigt eine schlechte Prognose für den Patienten. Vor kurzem haben wir gezeigt, dass der Verlust der Cdh1 und Trp53 Funktionen diffuse Modelle Typ GC unter Verwendung von Mäusen induziert [9]. Obwohl diese Erkenntnis wird uns helfen, neue menschliche Magenkrebstherapien, weitere Untersuchungen über die molekularen Mechanismen zugrunde liegenden Magen-Krebsentstehung zu entwickeln, sind notwendig, andere Ansätze für eine gezielte Therapie zu entwickeln.

Promoter CpG-Insel-Hypermethylierung ist eine der häufigsten Mechanismen durch die Tumorsuppressor-Gene sind in menschlichen Krebsarten inaktiviert [10]. Vor kurzem hat es sich gezeigt, dass einige miRNAs sind ebenfalls Ziele der epigenetischen silencing in Krebserkrankungen [11]. Unsere und andere Gruppen haben bisher diese pharmakologische oder genetische Störung der DNA-Methylierung in Krebszelllinien gezeigt, induziert die Hochregulation der beträchtlichen Zahl von miRNAs [12] - [15]. Diese Daten führten zur Identifizierung von Kandidatentumorunterdrückende miRNAs, deren Silencing ist im Zusammenhang mit CpG-Insel-Methylierung. Bisher Methylierung von miR-124 Familienmitglieder wurde bei Darmkrebs und in Tumoren anderer Organe [11] identifiziert. Darüber hinaus hat die miR-34b /c-Cluster eine typische CpG-Insel, und wird nach unten reguliert durch häufige Methylierung in Darm- und Magenkrebs [12]. Ebenso fanden wir, dass miR-181c-Methylierung mit Magen-Karzinogenese über Regulierung von onkogenen Gene KRAS
und NOTCH4
[13] verbunden ist. Down-Regulation vieler miRNAs durch Methylierung erfolgt gleichzeitig in Krebszellen und kann mehrere zu mehreren Beziehungen zwischen miRNAs und Zielen zu verbessern.

In dieser Studie zu bestätigen multiple-zu-mehrere Beziehungen zwischen miRNAs und -ziele in Krebszellen haben wir gezeigt, dass zwei Paare von mehreren miRNAs, miR-224 und -452, und miR-181c und -340, mehrere Zielgene hatte und synergistisch verminderte Zellproliferation durch Regulierung ihrer Ziele in menschlichen Zellen GC.

Ergebnisse |

50 miRNAs in einer GC-Zelllinie nach oben reguliert wurden, KATO-III, nach 5-Aza-2'-Desoxycytidin Behandlung

Kandidat miRNAs zu identifizieren, die synergistisch beeinflussen ihre Zielgene, wir unsere bisherigen Microarray-Daten (GEO-Zugangsnummer GSE16006) [13] erneut analysiert. Wir Auffassung vertreten, dass miRNA-Spiegel waren hochreguliert auf 5-Aza-2'-Desoxycytidin (5-Aza-CdR) Behandlung, wenn die Netto-Intensitäten von bestimmten 3 Spots waren mehr als das 1,5-fache. Darüber hinaus haben wir auch davon ausgewählt miRNAs die Mittelwerte gefunden wurden, um mehr als 3-fach auf Microarray-Analyse erhöht werden. Auf der Grundlage dieser neuen Kriterien haben wir festgestellt, dass 50 miRNAs wurden in einer GC-Zelllinie nach oben reguliert, KATO-III (Tabelle S1). Wir bestätigten die Hochregulierung von 5 von 6 repräsentativen Vorläufer miRNAs, das heißt, miR-145, -148a, -152, -224 und -340, nach 5-aza-CdR Behandlung mittels RT-PCR (1A).

TargetScan Prognostizierte gemeinsame Zielgene des Kandidaten miRNAs

Um zu bestimmen, ob oder ob nicht epigenetisch regulierten miRNAs gemeinsame Zielgene haben, suchten wir die TargetScan Datenbank (Version 5.1) für ihre gemeinsame Ziele. Nach TargetScan könnte 50 miRNAs in 46 Gruppen auf ihren Samen Sequenzen basierend klassifiziert werden. TargetScan zeigte auch, dass diese 46 Gruppen 6.460 Gene ausrichten können. Unter diesen Zielgene, wählten wir 13 davon Expression berichtet wurde in der GEO-Datenbank (GEO Zugangsnummer GSE2685) oder werden im Zusammenhang mit Magen-Karzinogenese (Tabelle S2) in GC erhöht werden. Hier konzentrieren wir uns auf vier miRNAs, miR-152, -181c, -224 und -340, denn wir haben bereits berichtet, dass miR-181c ist epigenetisch herunterreguliert in GC [13] und CpG-Inseln sind in den vorgelagerten Regionen von drei andere miRNAs (2A und C und Abbildung S1). Abbildung 2a zeigt auch, dass miR-452 mit miR-224 gruppiert ist. TargetScan vorhergesagt, dass die fünf miRNAs gemeinsame Ziele zu regulieren. Zum Beispiel, DPYSL2
(Dihydropyrimidinase-like 2, die auch als Kollabieren Antwort Mediator Protein bekannt 2, CRMP2
) wird gezielt von miR-224, -452 und -181c, KRAS und Videos miR-224, -452, -181c, -340 und -152, und MECP2
(Methyl CpG-Bindungsprotein 2) von miR-181c und -340 bzw. (Abbildung 3).

die Expression von miR-224, -452, -152 und -340 abnehmend auf DNA Hypermethylation in GC-Zelllinien

Wir untersuchten die Beteiligung von epigenetischen Veränderungen in Downregulation der miRNAs. Die Expression von miR-224, -340 und -152 wurde in mehrere GC-Zelllinien (1B) von 5-Aza-CdR Behandlung erhöht. Wir analysierten quantitativ reifen miR-224 Expression in 9 GC Zell-Linien und ein Kolorektalkarzinom (CRC) Zelllinie. Keine Expression von miR-224 wurde in 7 von 10 Krebszelllinien (1C) nachgewiesen. Wir analysierten auch die Expression Änderung des miR-224 /-452 Cluster in KATO-III mit einer niedrigen Dosis von 5-Aza-CdR (0,2 mmol /l), ein Histon-Deacetylase-Inhibitor behandelten Zellen, Trichostatin A (TSA, 0,3 &mgr; mol l /) oder eine Kombination dieser beiden Mittel. KATO-III-Zellen mit niedrig dosiertem 5-Aza-CdR Behandlung Hochregulation des miR-224 ausgestellt /-452 Cluster, während TSA allein nicht verursacht Hochregulierung. Die miR-224 /-452 Cluster wurde synergistisch hochreguliert in KATO-III-Zellen kombiniert mit 5-Aza-CdR und TSA-Behandlung (Abbildung 1D). Diese Ergebnisse zeigen, dass miR-224 und miR-452 herunterreguliert, durch DNA-Methylierung in GC-Zelllinien werden als die gleiche Transkriptionseinheit.

Es wurde berichtet, dass Intron miRNAs durch Promotor-Methylierung ihrer Wirts geregelt Gene, [14], [15]. Nach den Ergebnissen der Computeranalyse, die miR-224 /-452 Cluster und miR-340 in Intron 6 in befindet Gabre
und Intron 2 in RNF130
jeweils, von denen beide enthalten dichte CpG islands nur in den Promotorregionen der Wirtsgene (2A und C). Wir untersuchten die Beziehung zwischen den Expressionsniveaus dieser miRNA und dem Methylierungsstatus ihrer Wirtsgene in GC-Zelllinien von MSP-Analyse. GC-Zelllinien ohne miR-224 Expression zeigte nur Methylierungssignale, während die Expression-positive Zelllinien zeigten starke unmethylation Muster (2B). Eine ähnliche Beziehung wurde für miR-340 in GC-Zelllinien (2D) erfasst. Diese Daten zeigen, dass die Expression dieser miRNAs in GC-Zelllinien können durch Promotor-Methylierung ihres Wirtes Gene zum Schweigen gebracht werden.

epigenetisch regulierten miRNAs könnte GC-Zellproliferation in Beziehung gesetzt werden

Um zu bestimmen, ob epigenetisch geregelt miRNAs sind tumorunterdrückende oder nicht, wir untersuchten die Wirkung von 5-Aza-CdR in siDICER1 transfizierten KATO-III und DICER1 KO HCT116 (D1KO) Zellen (4A). Die unbehandelten KATO-III und Eltern HCT116-Zellen zeigten abgebremsten Proliferation nach der Behandlung mit 5-Aza-GGV. Auf der anderen Seite, in siDICER1 transfizierten KATO-III und D1KO Zellen wurde die Wirkung von 5-aza-CdR Behandlung auf die Zellproliferation in beiden Fällen gering. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Wirkung von 5-Aza-CdR wurde in niedrig oder null DICER1 Zellen verringert wird, und dass die epigenetisch regulierten miRNAs spielen eine wichtige Rolle bei GC und CRC-Zellen.

Um die Beziehung zwischen diesen zu analysieren miRNAs und 13 Zielgenen in Tabelle S2 gezeigt, transfizierten wir KATO-III-Zellen mit siDICER1 und /oder mit 5-Aza-CdR behandelt. Obwohl die Expression von 3 ( DPYSL2
, KRAS
und MECP2
) der 13 Gene wurden sank nach 5-Aza-CdR Behandlung, die Expression dieser Gene tat nicht auf 5-Aza-CdR Behandlung durch Transfektion von siDICER1 (4B).

kombinatorische Transfektion von miR-224 und -452 Drückte GC Cell Proliferation

Wir transfizierten Linien GC Zelle gefolgt ändern mit miR-224 und /oder -452-Mimetika als Vertreter der miRNA Cluster oder eine negative Kontrolle, und erfolgt dann in Wasser gelöst Tetrazolium-8 (WST-8) Assays. Zweiundsiebzig Stunden nach der Transfektion beobachtet, dass die ektopische Expression von miR-224 oder -452, das Wachstum von beiden Zelllinien unterdrückt, KATO-III und AGS (5A). Bemerkenswert ist, kombinatorische Transfektion der miR-224 und -452 ahmt verringert weitgehend das Wachstum der beiden GC-Zelllinien (5A).

Die miR-224 /-452 Cluster Co-operativ verminderte Expression von DPYSL2
und KRAS

um zu untersuchen, ob die miR-224 /-452 Cluster tatsächlich auf die Regulierung von DPYSL2
und KRAS
analysierten wir die Expression von DPYSL2
nach der Transfektion von KATO-III und AGS-Zellen mit der miR-224 /-452 Cluster allein oder zusammen. Wir führten RT-PCR und Western-Blot-Analysen. Die DPYSL2
und KRAS
mRNA-Spiegel wurden verringert nach der Transfektion mit der miR-224 oder miR-452 nachahmen (5B). Interessanterweise wurde im Fall von Kombinations Transfektion mit miR-224 und -452, Expression dieser Zielgene weiter nach unten reguliert (5B). Die Herunterregulierung der DPYSL2 wurde auch auf Proteinebene in den beiden Zelllinien (5C) beobachtet. Wir untersuchten auch die Expression von anderen fünf Gene, MECP2, MYC, JUNB, MUC1
und SETDB1
, die nicht als Ziele für die miR-224 oder -452 von TargetScan gezeigt wurden. Wie erwartet, wurden keine expressional Änderungen dieser fünf Gene in KATO-III-Zellen nach der Transfektion mit miR-224 oder -452 (Abbildung S2) gefunden. Diese Daten legen nahe, dass miR-224 und -452 speziell herunterreguliert DPYSL2
und KRAS
.

DPYSL2
wurde mit GC Zellproliferation assoziiert

Wir untersuchten die Wirkung von Zuschlags von DPYSL2
, die ein Ziel der miR-224 /-452 Cluster zu sein, auf die Zellproliferation gezeigt wurde. Die Transfektion von DPYSL2
siRNA verringert deutlich das Niveau des DPYSL2
Transkripte (5D) und hemmte das Wachstum von AGS und KATO-III-Zellen 72 Stunden nach der Zuschlags von DPYSL2
(5E), was darauf hinweist, dass DPYSL2 eine onkogene Aktivität hat.

kombinatorische Transfektion von miR-340 und -181c Drückte GC Zellproliferation und induzierte Herunterregulierung von KRAS
und MECP2
Expression

Als zweites Beispiel von mehreren zu vielfältigen Beziehungen zwischen microRNAs und Zielgene, wir die Beziehung zwischen miR-340 /-181c analysiert und KRAS /MECP2 .
Wenn miR-340 und miR-181c in KATO-III-Zellen transfiziert wurden, war die Proliferation synergistisch herunterreguliert durch zwei miRNAs (6A). Um zu bestimmen, ob oder ob nicht epigenetisch reguliert miR-340 und miR-181c kooperativ ihre Ziele wirken, analysierten wir die mRNA-Spiegel von KRAS
und MECP2.
Bei RT-PCR-Analyse KRAS
und MECP2
gefunden werden herunterreguliert von miR-340 und miR-181c allein oder kombinatorische Transfektion in KATO-III-Zellen (6B). Was die vier Gene, MYC, JUNB, MUC1
und SETDB1
, zeigt keine vorhergesagten Stellen für diese beiden miRNAs durch TargetScan wurden die Expressionsniveaus in dieser Studie nicht verändert. Repräsentative Daten sind in 6B gezeigt. Somit können die Auswirkungen von miR-340 und -181c auf ihre gemeinsame Zielgene sowie miR-224 und -452 spezifisch sein.

Expression und Methylierungsstatus von miR-224 und -340 in Primary GC Cases

Wir untersuchten den Methylierungsstatus von miR-224 und -340 in primären GC Fällen. Methylierte Muster miR-224 wurden in 15 von 26 (57,7%) GC primäre Gewebe (7A und Tabelle 1) nachgewiesen. Gepaart nicht bösartig Magenschleimhäuten zeigte kaum eine Methylierungsmuster von miR-224. Als nächstes untersuchten wir quantitativ die miR-224 Stufen in primären GC Geweben und entsprechenden nicht kanzerösen Schleimhäuten von TaqMan RT-PCR. Eine signifikante Reduktion der miR-224 Expression in GC Gewebe in Methylierungs-positiven Krebsfälle im Vergleich zu in der Methylierungs-negativen und nicht bösartig Magenschleimhäuten (7C) beobachtet wurde.

Wir analysierten weiter die DPYSL2
mRNA-Spiegel im Vergleich mit dem Methylierungsstatus von miR-224 in GC Gewebe: GCs mit miR-224-Methylierung (Ca miR-224 Mt), GCs mit miR-224 unmethylation (Ca miR-224 Un) und nicht -cancerous Gewebe mit unmethylation (N miR-224 Un). Die DPYSL2
mRNA-Ebene im "Ca miR-224 Mt" Gruppe war signifikant höher als die in der "N miR-224 Un" und "Ca miR-224 Un" Gruppen, p = 0,049 und p = 0,035, bzw. (Figur 7D). Somit gibt es eine Korrelation zwischen der Methylierungsstatus von miR-224 und DPYSL2
Ausdruck in GC Geweben.

Die miR-340-Methylierungs-Frequenz in den primären GC getesteten Geweben relativ gering war (4 scheinbare Methylierungsmuster von miR-340 von 26, 15,4%) (7B und Tabelle 1), wohingegen keine der 26 zeigten nicht kanzerösen Magenschleimhäuten gepaart. Wie für miR-152 Methylierungsanalyse, versuchten wir drei Primersätze in der stromaufwärtigen Region entworfen miR-152 enthaltenden CpG islands (Abbildung S1), aber keine von ihnen vollständig angepaßt miR-152-Expression auf MSP analysiert (Daten nicht gezeigt).

Diskussion

Obwohl es, daß die Expression einiger miRNAs berichtet wurde in verschiedenen Krebsarten, durch DNA-Methylierung verringert wird, beschrieben meisten Berichte, dass die Beziehung zwischen aberrante Expression von miRNAs und seine Zielgene war eins-zu-eins, eins-zu-mehrere oder mehrere zu eins. Um die Möglichkeit von mehreren zu vielfältigen Beziehungen zwischen miRNAs und Ziele in Krebszellen zu untersuchen, konzentrierten wir uns auf zwei Kombinationen von miRNAs in GC-Zellen, die miR-224 /-452 Cluster und miR-181c und -340, die in dieser Studie . Wir fanden heraus, dass die beiden Sätze von miRNAs, miR-224 und -452, und miR-181c und -340, mehrere Zielgene hatte, DPYSL2
und KRAS
und KRAS
und MECP2
sind, und verringert synergistisch die Zellproliferation in menschlichen GC-Zelllinien. Es ist bemerkenswert, dass ein Onkogen, KRAS
[16], gefunden wurde von vier miRNAs ausgerichtet werden, obwohl Kandidatenbindungsstellen der vier miRNAs verschieden sind in der 3'-UTR von KRAS
(TargetScan). Wir bereits berichtet, dass miR-181c herunterreguliert NOTCH4
zu [13]. So Multiple-zu-Mehrfachbeziehungen zwischen miRNAs und Targets wurden von der Datenbank nicht nur angezeigt, analysiert, sondern auch durch Transfektion Experimente menschlichen Zellen beteiligt sind.

miR-224- und /oder -340-Ausdruck-negativen GC-Zelllinien Ausgestellte Hyper Signale auf MSP-Analyse und die Expression von miR-224 und -340 auf Demethylierungsmittel Behandlung wieder hergestellt. Darüber hinaus Hyper von miR-224 und -340 wurde häufiger in der primären GCs beobachtet als noncancerous Schleimhäuten entspricht. In miR-224-Methylierungs-positiven Fälle, die Expression von miR-224 war signifikant niedriger als in der Methylierungs-negativen. Diese Daten deuten stark darauf hin, dass anomale DNA-Methylierung ist einer der wichtigsten Mechanismen, die Herabregulation von miR-224 und -340 in GC-Zellen.

Wir haben gezeigt, dass die Hemmung der miRNA Verarbeitung durch siDICER1 Transfektion oder mit DICER1 Knockout-Zellen verringert, um die Wirkung von 5-aza-CdR, das heißt, die Zellproliferation verringert und Herunterregulierung von Zielgenen, in GC und CRC-Zellen. Es wurde berichtet, dass die Fülle der DICER1, das Enzym, das den letzten Schritt der miRNA-Reifung katalysiert, direkt mit der Tumorprogression [17] verbunden ist. Diese Ergebnisse legen nahe, dass abweichende Regelung der miRNA-Reifung trägt zur GC und CRC-Bildung.

Wir fanden, dass die miR-224 /-452 Cluster wurde aberrantly herunterreguliert in GCs durch Hypermethylierung. Aberrante Expression von miR-224 wurde auch in anderen Tumoren berichtet. Die Expression von miR-224, let-7f und miR-516a ist bei Eierstockkrebs verringert, und sie synergistisch Expression von Peptidase-Kallikrein-bezogene regulieren 10 (KLK10) [18]. miR-224 wird herunterreguliert in Methotrexat-resistenten CRC-Zelllinien im Vergleich zu in sensitiven Zellen [19]. Hier haben wir auch gezeigt, dass der Methylierungsstatus des miR-224 wurde korreliert mit dem DPYSL2
Ebene in der menschlichen GCs. Zusammengenommen spielt miR-224 eine wichtige Rolle als tumor-suppressive miRNA in GC als auch in verschiedenen anderen Krebsarten. Im Gegensatz dazu wird miR-224 in hepatozellulären Karzinomen hochreguliert [20] und Medulloblastome [21] im Vergleich mit in den normalen Geweben. Somit sind weitere Studien erforderlich, um die Rolle der miR-224 in der Karzinogenese zu klären.

Wir, die gemeinsamen Ziele von epigenetisch herunterreguliert miRNAs untersucht. wurde DPYSL2
gezeigt von miR-224 und -452 herunterreguliert werden. DPYSL2 spielt eine wichtige Rolle bei der Etablierung von neuronalen Polarität [22]. DPYSL2 auch in Wegen beteiligt sind, die die Proliferation von nicht-neuronalen Zellen durch die Phosphorylierung durch regulatorische Proteine ​​regulieren. DPYSL2 erfährt dynamische Phosphorylierung Veränderungen in Reaktionsinhibition-induzierte quiescence und Hyperphosphorylierung Kontakt von DPYSL2 in einem Tumor auftritt [22]. Obwohl die Rolle der DPYSL2 in GCs nicht klar ist, unsere siRNA-basierte Knockdown von DPYSL2 Expression eine Reduktion der Proliferation in den beiden GC-Zelllinien induziert, onkogenen Aktivität von DPYSL2 hindeutet.

Zusammenfassend unsere Ergebnisse zeigen, dass multiple-zu-Mehrfachbeziehungen zwischen miRNAs und Zielgene existieren wirklich in GC. Es ist wahrscheinlich, dass abweichende Methylierung der Expression mehrerer Tumor-unterdrückende miRNAs abnimmt, wie miR-224, -452, -340 und -181c, die dann eine Überexpression von mehreren onkogenen Gene induzieren, wie KRAS
DPYSL2
und MECP2
. Diese abnormen Multiple-zu-Mehrfachbeziehungen zwischen miRNAs und Ziele würde eine der wichtigsten Mechanismen, die Magen-Krebsentstehung sein. Es ist daher sehr wahrscheinlich, dass epigenetische Medikamente, die Expression nicht nur tumorunterdrückende Gene normalisieren können, sondern auch mehrere tumorunterdrück miRNAs, was zu einer Abnahme der abnormalen multiple-zu-mehrere Beziehungen zwischen miRNAs und Zielen und somit kann sich hervorragende therapeutische Medikamente gegen Krebs.

Materialien und Methoden

Ethik Statement

Eine schriftliche Einverständniserklärung von allen Probanden erhalten wurde, und die Ethikkommission der Tokyo Medical and Dental University School of Medizin genehmigt diese Forschung.

Zelllinien und Gewebeproben

Wir untersuchten 9 GC-Zelllinien (KATO-III, MKN45, AGS, MKN74, TGBC11TKB, HSC59, HSC43, HSC58 und GCIY), 2 CRC-Zelllinien (HCT116 und DICER1
HCT116 Knock-out [23]) und 26 primäre GC Fälle. MKN45, MKN74, TGBC11TKB und GCIY wurden von RIKEN Cell Bank erworben und KATO-III und AGS wurden von ATCC (American Type Handy Collection). HSC59, HSC43 und HSC58 wurden von Dr. Kazuyoshi Yanagihara erhalten [24], [25]. KATO-III, MKN45, MKN74, HSC59, HSC43 und HSC58 wurden in RPMI 1640, und AGS, TGBC11TKB, GCIY und die beiden CRC-Zelllinien in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, Minimalmedium oder McCoys 5A, ergänzt mit 10% fötalem Rinder gewachsen Serum. Chirurgisch reseziert Proben von 26 primären GC Patienten zufällig aus der Affiliated Hospital der School of Medicine, Tokyo Medical and Dental-Universität erhalten.

In silico Analyse

Wir sind auf die GEO-Datenbank bezeichnet für miRNA und Genexpressionsprofile (GEO-Zugangsnummer GSE16006 und GSE2685). Wir haben auch miRNA Zieldatenbank "TargetScan".

medikamentöse Behandlung von Zellen und RNA-Extraktion

Für Demethylierung Studien wurden die Zellen täglich behandelt mit 5 &mgr; mol /l 5-Aza-CdR (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO) für 72 h. Wir auch Zellen mit 0,3 &mgr; mol /l TSA allein und mit einer Kombination von 0,2 umol /l 5-aza-CDR- und TSA behandelt. Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von Trizol-Reagenz (Invitrogen, Carlsbad, CA) oder ein miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland).

Quantitative Echtzeit-Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion

isoliert Echtzeit-Reverse-Transkriptions-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) analysiert wurden unter Verwendung eines StepOne Echtzeit-PCR-System (Applied Biosystems, Foster City, CA) durchgeführt, EagleTaq Master Mix mit ROX (Roche, Mannheim, Deutschland), ein TaqMan Transcription Kit (Applied Biosystems) und TaqMan miRNA-Assays (Applied Biosystems) nach den Anweisungen des Herstellers umkehren. Die Expressionsniveaus von miRNA wurden aus der Menge an Ziel-miRNA relativ zu der RNU6B als Kontrolle berechnet die anfängliche Eingabe von der Gesamt-RNA zu normieren.

Methylierungsanalyse

Bisulfit-Behandlung von DNA war ausgeführt mit Methylamp (Epigentek, Brooklyn, NY). Methylierungsspezifischen Polymerase-Kettenreaktion (MSP) Analysen wurden wie früher beschrieben durchgeführt [26]. Die Primer-Sequenzen und Produktgrößen PCR sind in Tabelle S3 gezeigt.

Synthetische miRNA Transfection

KATO-III und AGS-Zellen wurden mit einem Vorläufermolekül nachahmen miR-224 transfiziert, -452, -340 oder -181c oder verwürfelten Reihenfolge miRNA (Sigma) auf eine Endkonzentration von 25-50 nmol /l zu verleihen, indem eine Elektroporator Verwendung, Neon (Invitrogen) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Bei 24-72 h nach der Transfektion wurden die Zellen für die RT-PCR oder Western-Blot-Analyse geerntet.

Cell Proliferation Assay

miR-mimische-transfizierten KATO-III und AGS-Zellen bei 1 plattiert × 10 ^{3 oder 1 x 10 4 Zellen pro Vertiefung auf 96-Well-Platten. Die Zellproliferation wurde durch Bestimmung der Anzahl von Zellen an den Tagen 1-4 nach der Transfektion bewertet mit Zellproliferation Reagenz WST-8 (Dojindo Molecular Technologies, Inc., Mashikimachi, Japan) nach den Anweisungen des Herstellers.}

miRNA Ziel Vorhersage und Western Blotting

Die prognostizierten Ziele von miRNAs und deren Zielstellen wurden mit TargetScan analysiert. Die mRNA-Expressionsniveaus der vorhergesagten Zielen in transient transfizierten Zellen wurden 24 h nach der Transfektion durch RT-PCR analysiert. Western-Blot-Analysen wurden wie beschrieben durchgeführt vorher [26]. Der primäre Antikörper verwendet wurde, war Kaninchen-anti-DPYSL2 (1:500;Ϋ3, Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Wir verwendeten Maus-anti-α-Tubulin (1:1000; sc-8085, Santa Cruz Biotechnology) als interne Kontrolle für Western-Blot. Die sekundären Antikörper verwendet wurden, mit alkalischer Phosphatase konjugiertem anti-Kaninchen-IgG und anti-Maus-IgG (1:2000; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Die Blots wurden mit ImmunoStar AP-Substrat (Bio-Rad Laboratories) entwickelt.

Hintergrundinformationen
Abbildung S1.
Schematische Darstellung des COPZ2
Region miR-152 enthält. Gefüllten Kästen stellen die Exons von COPZ2
A und eine leere Box bezeichnet die untranslatierte Region von COPZ2
. Ein gebogener Pfeil zeigt die Transkriptionsstartstelle von COPZ2
. Ein vertikaler Pfeil zeigt die Lage von miR-152. Vertikale Linien zeigen CpG-Stellen. Pfeilspitzen zeigen die Regionen für MSP geprüft
doi:. 10.1371 /journal.pone.0062589.s001
(TIFF)
Abbildung S2.
Auswirkungen der Transfektion von miR-224 und -452 in KATO-III-Zellen. RT-PCR-Analysen nach der Transfektion mit miR-224 und /oder -452. Die Expression von Zielgenen wurde 48h später durch RT-PCR analysiert. miR-224 und -452 speziell herunterreguliert DPYSL2
und KRAS
, aber nicht anderen fünf Gene untersucht, die mit den Ergebnissen der Datenbankanalyse konsistent sind (Abbildung 3).
doi: 10.1371 /journal.pone.0062589.s002
(TIFF)
Tabelle S1.
Expression Profilierung des menschlichen miRNAs in KATO-III-Zellen nach 5-Aza-CdR Behandlung
doi:. 10.1371 /journal.pone.0062589.s003
(XLSX)
Tabelle S2.
Liste der Zielgene, von denen die Expression suchten wir mittels RT-PCR nach der Behandlung mit oder ohne 5-aza-GGV und Transfektion mit 20 nmol /l siDICER1 oder verwürfelt siRNA
doi:. 10.1371 /journal.pone .0062589.s004
(XLSX)
Tabelle S3.
Sequenzen der Primer in dieser Studie verwendeten
doi:. 10.1371 /journal.pone.0062589.s005
(XLSX)

Acknowledgments

Wir wünschen Dr. danken Bert Vogelstein für die Bereitstellung der DICER1 Knock-out-HCT116-Zelllinie.

• PLoS ONE: Hypoxie Stimuliert die EMT von Magenkrebszellen durch Autokrine TGFß Signaling
• PLoS ONE: Flotillin2 Expression korreliert mit HER2-Stufen und einer schlechten Prognose bei Magenkrebs