PLoS ONE: N-terminale Polypeptid von Annexin A2 Vermindert Infektion von Mycoplasma hyorhinis an Magenkrebs Cells

Abstrakt

Mycoplasma-Infektion bei Mensch und seine Kontamination in Zellkulturen sind weltweit Probleme. Die derzeit verfügbaren Medikamente zur Vorbeugung oder Behandlung Mykoplasmen-Infektion leiden unter geringer Empfindlichkeit, starker Widerstand und hohe Toxizität. Unsere bisherigen Arbeiten zeigten, dass Mycoplasma hyorhinis
( M
. hyorhinis
) Infektion durch die Wechselwirkung zwischen p37 von M
vermittelt wurde. hyorhinis
und Annexin A2 (ANXA2) von Wirtszellen, aber die Translations Wert dieses Mechanismus war unbekannt. Hierin synthetisierten wir den N-Terminus des Polypeptids ANXA2 (A2PP) und festgestellt, dass die Infektion von A2PP M
verringern könnte. hyorhinis
Magenkrebszellen und Block M
. hyorhinis
Infektion induzierte Zellmigration. Darüber hinaus fanden wir, dass A2PP M
reduzieren könnte. hyorhinis
Kontamination von Passage-Zellen. Darüber hinaus, verglichen mit den kommerziellen Antibiotika häufig in der Zellkultur, die zur Vorbeugung M
. hyorhinis
Infektion zeigte A2PP eine Wirksamkeit, aber eine geringe Toxizität auf das Zellwachstum. Somit unserer Studie zum ersten Mal offenbart A2PP Potenzial für die Behandlung und Prävention von M
. hyorhinis
Infektion

Citation:. Yuan S, Qu L, Shou C (2016) N-terminale Polypeptid von Annexin A2 Vermindert Infektion von Mycoplasma hyorhinis
zu Magenkrebszellen . PLoS ONE 11 (1): e0147776. doi: 10.1371 /journal.pone.0147776

Editor: Gernot Sissel, Universitätsklinikum Freiburg, DEUTSCHLAND

Empfangen: 16. Oktober 2015; Akzeptiert: 7. Januar 2016; Veröffentlicht: 26. Januar 2016

Copyright: © 2016 Yuan et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Datenverfügbarkeit. Alle relevanten Daten sind in dem Papier. . Gefördert durch National Natural Science Foundation of China (81572532): Microarray-Daten wurden in NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (Beitritt no.GSE73777)

Die Finanzierung hinterlegt. http://www.nsfc.gov.cn/publish/portal1/. SCC erhielt die Finanzierung. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung zu veröffentlichen oder um die Herstellung von Manuskript

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einleitung

Pathogene Mycoplasmen, einschließlich Mycoplasma pneumoniae ( M
. pneumoniae
), Mycoplasma hyorhinis ( M
. hyorhinis
), orale Mykoplasmen ( M
. Orale
) und Mycoplasma genitalium ( M
. genitalium
), gehören zu Klasse Mollicutis, was der kleinste Mikroorganismus Leben ist in der Natur und kann unabhängig duplizieren [1-2]. Viele Studien haben gezeigt, dass eine Infektion mit diesen Mykoplasmen mit Tumorentwicklung [3-8] verbunden war. M
. Orale
Chromosomenanomalie in humanen diploiden Zellen verursacht und führt zu Zelltransformation [6]. Eine Infektion mit M
. hyorhinis oder in M
. genitalium
konnte die Migration und Invasivität von Prostata-Epithelzellen erhöhen [3]. M
. hyorhinis
Infektion hat Arthritis, Serositis, Unfruchtbarkeit und Krebs des menschlichen Verbindung gebracht worden [9-12].

Zusätzlich Mycoplasmen-Kontamination in Zellkultur ist ein ernstes Problem, und die Rate der Durchgangszellen infiziert von Mykoplasmen ist hoch. Die Zellkultur wird in den Lebenswissenschaften, wie in der Grundlagenforschung, klinische Studie der Forschung, Entwicklung und Produktion von biologischen Produkten, sowie auf dem Gebiet der biopharmazeutischen und Impfstoffproduktion weit verbreitet. die Zellen vor einer mikrobiellen Kontamination zu verhindern, ist entscheidend für die Qualität der Forschung zu gewährleisten. Die Mycoplasmen-Kontamination ist das häufigste Problem in der Zellkultur mit einer Inzidenz von 30% -60% [1]. Es wurde gezeigt, dass vier Arten von Mykoplasmen entfallen mehr als 95% der Infektionen in der Zellkultur, einschließlich M
. Orale
, Arginin Mykoplasmen ( M
. arginini
), M
. hyorhinis
und Levin keine Acholeplasma ( A
. laidlawii
) [13,14,15,16]. Aufgrund der geringen Größe ist Mycoplasma kaum unter dem Lichtmikroskop gefunden werden und wird leicht von den Forschern ignoriert. In den letzten Jahren zahlreiche für Mykoplasmen Behandlung verwendeten Antibiotika immer wieder bei der Entstehung von Mykoplasmen Widerstand geführt. Aus diesen Gründen ist es unerlässlich, neue Mittel zur Verhinderung oder Verringerung Mykoplasmen-Infektion zu entwickeln.

Unsere früheren Arbeiten zeigten, dass M
. hyorhinis
Infektion hängt von der Wechselwirkung von p37 (major membrane protein of M
. hyorhinis
) und Host-ANXA2 über ihre N-terminalen Domänen. Wir fanden auch polyklonalen Antikörper gegen p37 könnte die Infektion von M
blockieren. hyorhinis
und Abnahme M
. hyorhinis
-vermittelte Migration von Magenkrebszelle [17]. Basierend auf diesen Entdeckungen konnten wir eine Hypothese, daß das Peptid nach der Aminosäuresequenz synthetisiert von ANXA2 N-terminale Bereich (von 1 ^{st bis 30 th aa, hier wir dieses Peptid als A2PP genannt), Block M
könnte. hyorhinis
Infektion über seine Konkurrenz mit ANXA2 und möglicherweise als Arzneimittel verwendet werden, zu verhindern, dass M
. hyorhinis
Infektion in Zellkultur. In dieser Studie untersuchten wir diese Hypothese und verglichen auch die Auswirkungen von A2PP mit anderen Arzneimitteln bei der Verhinderung M
. hyorhinis
Infektion.}

Materialien und Methoden

Cell Culture

AGS Magenkrebs-Zelllinie wurde von der American Type Culture Collection (ATCC). BGC823 Magenkrebs-Zelllinie wurde von der Peking-Universität gegründet Volkskrankenhaus und wurde von Cell Culture Center of Chinese Academy of Medical Sciences (Peking, China) erworben. AGS und BGC823-Zellen wurden in RPMI-1640-Medium, ergänzt 10% fötales Kälberserum von Invitrogen (Carlssbab, CA, USA) erhalten. Mycoplasma-Test wurde vor jedem neuen Versuch durch PCR-Amplifikation von M
umgesetzt. hyorhinis p37
.

Mycoplasma Vermehrung und Co-Kultur

Mycoplasma Vermehrung und Co-Kultur wurde wie zuvor berichtet, durchgeführt [17,18,19].

Antikörper und Reagenzien

Anti-p37 monoklonalen Antikörper PD4 erzeugt wurde und zuvor charakterisiert [5,20,21]. Polyklonale anti-p37-Antikörper wurde von immunisierenden Kaninchen mit GST-p37-Fusionsprotein nach dem Standardprotokoll erhalten. Anti-EGFR und Anti-phospho-EGFR wurde von Cell Signaling Technology (CST, USA) erworben. Anti-ANXA2 war von Novus Biotechnologie (Novus Biotechnology, USA). Anti-phospho-ANXA2 war von Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA). A2PP (1 ^{st bis 30 th aa) und verschiedene abgeschnittene A2PP Peptide, einschließlich A2PP-Nd4 (5 th bis 30 th aa), A2PP-ND8 (9 th 30 th aa), A2PP-ND12 (13 rd bis 30 th aa), A2PP-ND16 (17 th bis 30 th aa), A2PP-CD4- (1 st bis 26 th aa), A2PP-Cd8 (1 st bis 22 nd aa), A2PP-Cd12 (1 st bis 18 th aa), A2PP- CD16 (1 st bis 14 th aa) zusammen mit zufälligen Kontrollpeptide (CONP) wurden durch Sbsbio (Beijing, China) synthetisiert. Antimikrobielle Mykoplasmen I (MYCO I) und Mykoplasmen II (MYCO II) wurden von M gekauft & C GENTECHNIK (Beijing, China). Ciprofloxacin (CIP) wurde von Double-Crane Pharm (Beijing, China).}

Erkennung von M
. hyorhinis
durch quantitative PCR (qPCR)

DNA von AGS oder BGC823 Zellen nach M
extrahiert wurde. hyorhinis
Infektion durch DNA-Lysepuffer (50 mM Tris pH 8,5, 1 mM EDTA, 0,5% Tween-20 und 200 mg /L Proteinase K) nach dem Standardprotokoll. qPCR wurde mit 30 ng DNA und SYBR Green Real-time PCR 2 × Premix-Kit (Takara, Otsu, Japan) unter Verwendung von Step One-System von ABI (Foster City, CA, USA) durchgeführt. Die Reaktionsprogramme und p37
-spezifische Primer (vorwärts: 5'-TATCTCATTGACCTTGACTAAC-3 'Reverse: 5'-ATTTTCGCCAATAGCATTTG-3') wurden vorher [22] berichtet. Zum Vergleich M
. hyorhinis
DNA-Spiegel in Zellen, GAPDH
(vorwärts: 5'-TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3 ', reverse: 5'-CCTGGAAGATGGTGATGGG-3') wurde als Kontrolle verstärkt und die Daten wurden analysiert die 2 ^{-ΔΔCt Methode. Die Primer wurden von Sangon (Shanghai, China) synthetisiert.}

Western Blotting

Die Zellen aus Kulturschale mit 2 × SDS-Ladepuffer geerntet wurden. Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Western-Blot wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt [23].

Zell ELISA

96 Vertiefungen mit Zellen ausgesät wurden (1 × 10 ^{4 /well), gefolgt von der Behandlung der angegebenen Peptide und Infektion von M
. hyorhinis
für 24 Stunden. Zellen, die mit 0,05% Glutaraldehyd immobilisiert wurden für 10 min, dann Zelle ELISA wurde wie zuvor beschrieben [24] durchgeführt.}

Festphasen-Bindungstest und Pull-Down-Assay

Das rekombinante GST-p37 und GST-Proteine ​​wurden erzeugt und gereinigt, wie zuvor beschrieben [17]. GST-p37 und GST wurden über Nacht in Puffer (0,1 M Na _{2 CO 3, 0,1 M NaHCO 3, pH 9,6) und beschichtet in 96-Mulden-Platten bei 4 ° C verdünnt. Die Platten wurden dreimal mit PBS gewaschen und blockiert mit 5% Milch /PBS bei Raumtemperatur (RT) für 2 Stunden entrahmte. Nach dem Waschen mit PBS angegebenen Konzentrationen von Biotin-konjugiertem A2PP (synthetisiert durch Sbsbio) wurde 2 h bei RT zugegeben und inkubiert. Nach dem Waschen mit PBST für 3-mal, Streptavidin-konjugierte HRP (Baltimore Pike, West Grove, PA, USA) gegeben und 30 min bei RT inkubiert. Nach der Farbentwicklung mit Ortho-Phenylendiamin (Sigma), optische Dichte bei 490 nm (OD 490) wurde mit einem Mikroplatten-Reader (Bio-rad 550) aufgezeichnet. Für Pull-Down-Assay, 100 ng GST-p37 oder GST-Protein war co-inkubiert mit 20 &mgr; M Biotin-A2PP und Streptavidin-Kügelchen (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA) in Bindungspuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% NP-40, 0,5 mM DTT, 1 mM PMSF und 1 × komplette Proteaseinhibitoren) bei 4 ° C über Nacht. Die Niederschläge wurden viermal mit Bindungspuffer gewaschen und mittels Western-Blot analysiert.}

Co-Immunpräzipitation

M
. hyorhinis
infizierten Zellen (BGC823 oder AGS) wurden in Lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 1 mM PMSF homogenisiert und 1 × Inhibitoren vollständige Protease) bei 4 ° C für 10 min. Nach 12, 000 g Zentrifugation für 10 min bei 4 ° C wurden die Überstände gewonnen. Protein-Lysate (500 ug), inkubiert mit 20 &mgr; M oder A2PP CONP, 1 &mgr; g anti-ANXA2 und Protein G-Sepharose-Perlen (GE Healthcare) bei 4 ° C über Nacht. Präimmun-IgG (1 ug) wurde als Kontrolle verwendet. Gefällte Kügelchen wurden viermal mit Lysepuffer gewaschen, in 2 × Ladepuffer eluiert, gekocht, und mittels Western-Blot analysiert.

Immunofluoreszenzassay

Die Zellen auf Deckgläsern und über Nacht kultiviert ausgesät wurden. Am nächsten Tag wurden die Zellen mit angegebenen Peptide behandelt und infiziert mit M
. hyorhinis
für 24 Stunden. Dann wurden die Zellen dreimal mit eiskaltem PBS gewaschen, fixiert in 4% Paraformaldehyd für 15 min bei RT. Nach Blockieren für 1 Stunde in 5% BSA /PBS wurden die Zellen für 1 Stunde mit angegebenen Antikörper bei RT inkubiert. Als nächstes wurden die Zellen 3-mal wieder mit PBST gewaschen und mit FITC oder TRITC-markierten Sekundärantikörper für 30 min bei RT inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS und Gegenfärbung mit DAPI wurden die Zellen auf 50% Glycerin /PBS gelagert. Ein ZEISS LSM780 konfokalen Mikroskop (ZEISS Microsystems, Oberkochen, Deutschland) wurde verwendet, um die Lokalisierung der angegebenen Proteine ​​zu beobachten.

Zellmigration Assay

Transwell-Kammer mit 8,0 um Porenmembranen (Corning, NY, USA) wurde in der Zellmigrationsassay verwendet. Die untere Kammer wurde mit 800 &mgr; l Medium, das 10% FBS als chemoattractant gefüllt. Die Zellen wurden in serumfreiem Medium, enthaltend M
resuspendiert. hyorhinis
Plus A2PP oder CONP, dann vorsichtig auf die obere Kammer mit einer Dichte von jeder Transwell-Gerät übertragen wurden, von 2 x 10 ^{5 Zellen /ml (120 &mgr; l /Kammer). Zellen wurden 24 h bei 37 ° C zu migrieren gelassen. Die obere Oberfläche jeder Membran wurde von Zellen mit einem Wattestäbchen gelöscht. Zellen an der Unterseite der Membran penetriert wurden in kaltem Methanol fixiert, mit 0,1% Kristallviolett gefärbt, und in neun zufällig ausgewählten mikroskopischen Feldern pro Vertiefung gezählt. Jede Probe wurde in dreifacher Ausführung hergestellt und Kammern jedes Experiment wurde mindestens 3-mal wiederholt.}

Cell Proliferation Assay

Magenkrebszellen wurden in 96-Well-Kulturplatten bei einer Dichte von 5 × 10 ausgesät ^{3/100 ul /Vertiefung in dreifacher Ausführung, und wurden mit den angegebenen Reagenzien behandelt. Die Proliferation von Zellen wurden von der Zelle Einmündung mit einem CloneSelect Imager (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) quantifiziert.}

Microarray-Analyse und Real-Time RT-PCR

AGS und BGC823 Zellen ( 1 x 10 ^{6 pro 10 cm 2-Platte) wurden mit A2PP, CIP, MYCO I und II MYCO 24 h, mit PBS gewaschen und in Trizolreagenz geerntet. RNA-Proben wurden in OE Biotechnologie (Shanghai, China) unter Verwendung von Affymetrix Genechip ® Primeview ™ Human Gene Expression Array untersucht. Microarray-Daten wurden in NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (Beitritt no.GSE73777) hinterlegt. Raw-Daten wurden unter Verwendung von Affymetrix Genechip Command Console (Version 4.0, Affymetrix) aufgezeichnet. Als nächstes wurde Genespring-Software (Version 12.5, Agilent Technologies), um die Basisanalyse mit den Rohdaten zu beenden eingesetzt. Zunächst wurde die Rohdaten mit dem RMA-Algorithmus normalisiert. Unterschiedlich wurden exprimierte Gene dann durch fache Veränderung identifiziert. Der Schwellenwert eingestellt für Aufwärts- und Abwärts regulierte Gene war ein fache Veränderung ≥ 2,0. Danach GO und wurden KEGG Analyse ausgewählt aus Genen angewandt, die auf Zellzyklus und Zell-Apoptose im Zusammenhang. Real-time RT-PCR wurde verwendet, um die Ergebnisse von Microarray zu validieren und erfolgt nach der Herstelleranweisung (SYBR, Toyobo). Die Expressionsniveaus von verwandten Gene wurden normalisiert durch GAPDH
und die 2 -ΔΔCT verwendet wurde, relativ Genexpression zu berechnen. Die Primer, die für Echtzeit-RT-PCR ( ATF
, vorwärts, 5'-GAGTGGCGACAGGATAGAGC-3 ', Reverse, 5'-TTTAGCCTCCCTCCCTTAGC-3'; DDIT3
, vorwärts, 5 ' -GCGCATGAAGGAGAAAGAAC-3 ', Reverse, 5'-ACCATTCGGTCAATCAGAGC-3'; CEBPB
, vorwärts, 5'-AGCGACGAGTACAAGATCCG-3 ', Reverse, 5'-AGCTGCTCCACCTTCTTCTG-3') wurden von Sangon synthetisiert <. br>}

Statistische Analyse

Die Daten wurden als Mittelwert ± SD dargestellt. Die Unterschiede wurden durch ANOVA mit SPSS 11.0 Software und P <analysiert; 0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet.

Microarray-Zugangsnummer

Microarray-Daten in NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (Zugangs-Nr. GSE73777).

Ergebnisse

Hat A2PP keine Auswirkung auf die Lebensfähigkeit oder die Migration der Magenkrebszellen

um die Rolle von ANXA2 der N-terminalen Domäne in M
zu bewerten. hyorhinis
Infektion wir zunächst synthetisiert A2PP Peptid N-terminal von ANXA2 (1A) entspricht. Biotin markiert A2PP wurde gezeigt, spezifisch mit GST-p37 in der Festphase-Bindungstest (Fig 1B) und Pull-down-Assays (1C) zusammenwirken. Wir haben festgestellt, dass A2PP nicht die Morphologie von AGS und BGC823 Zellen (1D) nicht beeinträchtigte. Zusätzlich in Konzentrationen von weniger als 20 um, hat A2PP nicht die Zellproliferation (Fig 1E) inhibieren, was darauf hindeutet, dass A2PP minimale Toxizität für Zellen aufweist. EGFR wurde bei der Regulierung der ANXA2 Phosphorylierung [17,25,26] verwickelt, während A2PP keine Auswirkungen hatte auf die Phosphorylierungen oder Proteinspiegel von EGFR und ANXA2 [2A]. Außerdem hatte A2PP keine Auswirkungen auf die Migration von AGS und BGC823 Zellen (2B und 2C). Zelluläre Lokalisierung von ANXA2 wird durch seine Phosphorylierung reguliert, die für ihre Funktion wichtig ist [17,27,28]. Wir fanden A2PP nicht die subzelluläre Lokalisation von endogenem ANXA2 ändern (Abb 2D). Diese Ergebnisse zeigen, dass A2PP allein hat keine Auswirkungen auf die maligne Phänotypen oder EGFR-ANXA2 Signalisierung von Magenkrebszellen.

A2PP Vermindert M
. hyorhinis
Infektion

Die bisherige Arbeit hat gezeigt, dass N-Terminus von ANXA2 vermittelt M
. hyorhinis
Infektion [17]. Wie durch das Ergebnis der Zell ELISA-Assay gezeigt, fanden wir, dass M
. hyorhinis
Infektion wurde durch A2PP in einer dosisabhängigen Weise in BGC823 und AGS-Zellen blockiert, aber CONP-behandelten Zellen wurden vor stark infiziert M
. hyorhinis
(3A). Diese Ergebnisse wurden durch qPCR-Tests (Fig 3B) unterstützt. Konsequent, verringerte A2PP auch Proteinspiegel von p37-Protein in der Western-Blot-Analyse (3C und 3D). Inzwischen Ebenen phophos-AXNA2 und phophos-EGFR in den infizierten Zellen wurden nach unten reguliert durch Behandlung mit A2PP (3C und 3E), während die Gesamtniveaus AXNA2 und EGFR relativ stabil waren (3C). In der Immunfluoreszenzanalyse wurde A2PP gefunden M
zu hemmen. hyorhinis
Infektion induzierte p37 Akkumulation und Co-Lokalisation zwischen p37 und ANXA2 (4A). In der Ko-Immunopräzipitation mit Proteinlysaten von M
. hyorhinis
infizierten Zellen, verringert A2PP die Wechselwirkung zwischen p37 und ANXA2 (4B). Gemeinsam unterstützt diese Beweise die Idee, dass A2PP M
verringern könnte. hyorhinis
Infektion und bestätigt unsere früheren Entdeckung, dass die N-terminal von ANXA2 erforderlich ist für die Vermittlung M
. hyorhinis
Infektion [17].

A2PP Unterdrückt M
. hyorhinis
-induzierte Migration

Unsere bisherigen Studien legten nahe, dass M
. hyorhinis
Infektion könnte die Migration von Magenkrebszellen fördern [17, 23]. In dieser Studie haben wir festgestellt, dass M
. hyorhinis
-vermittelte Migration von Magenkrebszellen wurde durch CONP betroffen, aber war dosisabhängig inhibiert durch A2PP (5A und 5B). Diese Ergebnisse legen nahe, dass A2PP gehemmt M
. hyorhinis
-induzierte Migration, die sich mit seiner Fähigkeit verbunden war infektions gefördert Phosphorylierungen von EGFR und ANXA2 (3C und 3E).

A2PP hat wesentliche Motiv zu verringern M zu verringern
. hyorhinis
Infektion

Um die kritische Motiv der A2PP charakterisieren, haben wir versucht, ob diverse verkürzten Peptide von A2PP (6A) zu bestimmen konnte reduziert M
. hyorhinis
Infektion. In der qPCR-Analyse, A2PP und verkürzten Peptide A2PP-Nd4, ND8, ND12, CD4, CD8 und Cd12 reduziert M
. hyorhinis
Infektion im Magen-Krebszellen, aber A2PP-ND16 und A2PP-CD16 gescheitert zu verringern M
. hyorhinis
Infektion (6B). Ähnliche Muster der Hemmung wurde von Western-Blot-Assay (6C) erhalten. Diese Ergebnisse legen nahe, die Existenz eines bestimmten Motivs von A2PP wesentlich ist für seine Fähigkeit, M
zu reduzieren. hyorhinis
Infektion. Um die Kernsequenzen dieses möglichen Motiv abzubilden, synthetisierten wir die beiden Peptide bis 11 entsprechende ^{th -20 th aa (bezeichnet als A2PP-10aa) und 13 th -18 th aa (bezeichnet als A2PP-6AA) (7A). In qPCR-Assay konnten beide Peptide verringern M
. hyorhinis
Infektion (7B), die durch Western-Blot-Assay (7C) unterstützt wurde. Bemerkenswerterweise waren die inhibitorischen Wirkungen von A2PP-10aa besser als die der A2PP-6aa, aber die Wirkungen beider Peptide waren weniger robust wie die von A2PP (7B und 7C). Thesefore, die zentralen Sequenzen (11 th -20 th) von A2PP könnte das wesentliche Motiv zu hemmen M
. hyorhinis
Infektion.}

Vergleich von A2PP mit anderen Mitteln zur Prävention M
. hyorhinis
Infektion

M
. hyorhinis
war eine der Hauptverschmutzungsquellen der Zellkultur [13,14,15]. Der beste Weg, M
zu beseitigen. hyorhinis
Infektion Zellen zu verwerfen und schnell sterilisieren alle kontaktiert Gefäße, aber einige infizierte Zellen, die nicht in mehreren Fällen ersetzt werden könnte. Infolgedessen ist es zwingend notwendig, spezifische antimikrobielle Ansätze zu verwenden, um zu verhindern oder zu beseitigen M
. hyorhinis
Infektion. Es wurden verschiedene antimikrobielle Mittel gewesen zu verhindern, dass M
. hyorhinis
infizieren. Zum Beispiel könnte Ciprofloxacin (CIP) auszurotten M
. hyorhinis
in einer geeigneten Konzentration [29]. Zwei antimikrobiellen Komponenten genannt als Mykoplasmen I (MYCO I) und Mykoplasmen II (MYCO II) konnte reduzieren M
. hyorhinis
Infektion durch seine Protein- und Nukleinsäuresynthese zu blockieren. Jedoch einige Bedenken wie geringe Empfindlichkeit, starker Widerstand und hohe Toxizität können ihre Anwendungen in der Zellkultur zu begrenzen. Basierend auf diesen Überlegungen, glauben wir, es ist notwendig, um die Effizienz von A2PP, CIP, MYCO I und II MYCO bei der Verhinderung von M
zu vergleichen. hyorhinis
Infektion. Durch Western-Blotting und qPCR-Tests fanden wir, dass A2PP die hemmende Wirkung auf M
. hyorhinis
Infektion war ähnlich der MYCO I, war aber besser als diejenigen von CIP und MYCO II (8A und 8B). Interessanterweise fanden wir, dass A2PP könnte auch effizient die M
beseitigen. hyorhinis
Infektion in stark infizierten Zellen in den Prozess der Durchgänge von P _{1 bis P 3 (8C und 8D). Zusätzlich, verglichen mit MYCO I und II MYCO hatte A2PP weniger hemmende Wirkung auf die Zellen-Proliferation (9A). Um die Mechanismen von A2PP, CIP, MYCO I und MYCO II die Auswirkungen auf die Zellen-Proliferation erforschen, wir Microarray-Analyse durchgeführt und gesiebt, um eine Teilmenge von differentiell exprimierten Genen in A2PP, CIP, MYCO I und II MYCO behandelten Zellen. Quantitative RT-PCR-Analyse zeigte eine erhöhte Expression der Apoptose-verwandten Gene ( ATF5
, DDIT3
, CEBPB
) durch MYCO I und II MYCO Behandlung, aber wenig Veränderungen waren in A2PP und CIP-Gruppen (9B) beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass A2PP hat eine geringere Toxizität und eine bessere präventive Potenzial bei der Blockierung M
. hyorhinis
Infektion in kultivierten Zellen.}

Diskussion

Mycoplasma-Infektion und Kontamination sind auch heute noch weit verbreitet und erhebliche Risiken für die Patienten und die Qualität der Forschung bringen. In den letzten Jahren schlug mehrere Studien, dass Mykoplasmen-Infektion auch mit tumorigenesis [3-8] verbunden war. Mycoplasma-Infektion könnte die DNA-Schäden verursachen, beeinflussen die Genexpression, und stören die Zellzyklus-Kontrollpunkt und apoptotische Reaktion [30]. M
. hyorhinis
wurde in 56% der Magenkarzinome, 55,1% der Darmkrebs und 39,7% auf Brustkrebs Gewebe [20] gefunden. Außerdem zeigte die serologische Untersuchung, dass 36% der benignen Prostatahyperplasie (BPH) und 52% Gewebe Prostatakrebs waren M
. hyorhinis
positiv [4]. Diese Studien weisen auf einen möglichen Zusammenhang zwischen der M
. hyorhinis
Infektion und dem Auftreten von Tumoren [4,20]. Was in den Prozess der Zellkultur mehr ist, sind die häufigste Kontaminationsquellen Mykoplasmen, Bakterien und Schimmel, aber die Kontaminationsrate von Mykoplasmen relativ höher ist [13]. Ergebnisse aus verschiedenen Gruppen aufweisen, die die Rate der Mycoplasmenkontamination 15-80% variiert gezeigt, teilweise sogar 100% erreicht [15,31]. Eine Analyse der DNA-Sequenzen aus 1000-Genome-Projekt angedeutet, dass 7% der Proben durch Mycoplasma kontaminiert waren [32]. Jedoch, Mykoplasmen-Infektion und Kontamination zu verhindern, ist schwierig. Zum einen, weil der polymorphen, Plastizität, Filtrierbarkeit und leichte Löslichkeit, Mycoplasmen leicht durch Mikrofiltrationsmembran passieren könnte, wodurch sie auf der Zelloberfläche vorhanden sind oder von Zellen Endozytose werden [1,13,33]. Zweitens fehlt Mycoplasmen Zellwände, so dass sie unempfindlich gegenüber Antibiotika, die Rendering-Zellwandsynthese, wie Penicillin hemmen. Wirksame antimikrobielle Substanzen existieren, aber ihre kontinuierliche Anwendungen in der Zellkultur wird nicht wegen der Toxizität gegenüber Zellen empfohlen. Schließlich Mykoplasmen ist ein atypischer Bakterien, difficulities in die richtige Diagnose zu verursachen [34].

Zahlreiche Anti-Mycoplasma-Medikamente entwickelt worden, wie Erythromycin, Leucomycin, Roxithromycin, Ofloxacin und Ciprofloxacin. Allerdings sind die negativen Wirkungen, Toxizität und Widerstand immer noch Probleme für die Verschmutzung bringen Minderung [10,11,35-38]. Außerdem könnte eine kontinuierliche Verabreichung dieser Antibiotika nicht vollständig Mykoplasmen für eine oder sogar mehrere Wochen [39,40] zu beseitigen. Daher ist es wichtig, neue Wege zu finden, die die Mycoplasma-Infektion oder Kontamination effektiv und rechtzeitige beseitigen. Die Lösung für dieses Ziel kann wahrscheinlich durch die Charakterisierung von molekularen Mechanismen gefunden werden, Mykoplasmen-Infektion zugrunde liegen.

Unsere früheren Studie, dass die Interaktion von P37 Protein gefunden mit AXNA2 vermittelten M
. hyorhinis
Infektion [17]. In dieser Studie haben wir zunächst das N-terminale Polypeptid von ANXA2 (A2PP) synthetisiert und validierten seiner spezifischen Wechselwirkung mit GST-p37-Protein in der Festphasen-Bindungs ​​und Streptavidin-Pull-down-Assays. Angeregt durch eine solche Interaktion, fragten wir uns, ob A2PP Infektion von M
verärgern könnte. hyorhinis
. Wir fanden, dass A2PP, in einer geeigneten Konzentration (20 uM), verringert M
. hyorhinis
Infektion, gehemmten Infektion geförderte Migration und reduzierte Infektions provozierte die Phosphorylierungen von EGFR und ANXA2 in Magenkrebszellen. Diese Effekte wurden mit einer verringerten Wechselwirkung zwischen p37 und ANXA2 verbunden. Es sollte beachtet werden, dass A2PP allein minimale Wirkungen auf die Proliferation von Zellen und Phosphorylierungen von EGFR und ANXA2 zeigten, was darauf hindeutet, dass A2PP wahrscheinlich ein nützliches Reagenz zur Verringerung M
sein soll. hyorhinis
Infektion. Dieser Begriff wurde durch Vergleiche von A2PP der kommerziellen und Antibiotika "Auswirkungen auf die Zellproliferation und M
unterstützt. hyorhinis
Infektion, die zeigten, dass A2PP tatsächlich eine geringere Toxizität auf Zellen, hatte aber starke Fähigkeit Infektion entgegenzuwirken.

Trotz dieser A2PP, ein 30 aa Polypeptid könnte verringern M
. hyorhinis
Infektion effektiv, müssen wir immer noch zu verstehen, ob verkürzte Formen von A2PP ähnlichen anti- erreichen könnte M
. hyorhinis
Fähigkeit. Durch die Verwendung mehrerer trunkierten Peptiden A2PP, fanden wir, dass die zentralen Sequenzen (11 ^{th -20 th) von A2PP könnte das wesentliche Motiv zu hemmen M
. hyorhinis
Infektion. die hemmende Wirkung von verkürztem Peptide waren jedoch noch nicht so stark wie die von voller Länge A2PP, was darauf hindeutet, daß flankierende Sequenzen sind wesentliche richtige Struktur zu erreichen effiziente Bindung mit p37 zu erhalten. Weitere Studien sind erforderlich, auf die Hemmung der Auswirkungen von Veränderungen oder /und Mutation dieses Motiv zu finden M
. hyorhinis
Infektion}

Acknowledgments

Wir danken und dankbar Lin Meng, Dr. Zhihua Tian (alle von der Peking University Cancer Hospital & Institut) bestätigen. Für die Bereitstellung von kritischen Reagenzien oder technische Hilfe.

• PLoS ONE: Nikotin hemmt die Cisplatin-induzierte Apoptose über Regulierung α5-nAChR /AKT Signal in menschlichen Magenkrebszellen
• PLoS ONE: niedrige Inzidenz von Synchronous oder Metachrone Tumoren nach endoskopischer Submukosa Dissektion für Magenfrühkarzinomen mit Undifferenzierte Histologie