PLoS ONE: ZIC1 Promoter Hypermethylation in Plasma-DNA ist ein potentieller Biomarker für Magenkrebs und Intraepitheliale Neoplasia

Abstrakt

Magenkrebs (GC) bleibt eine der häufigsten Krebserkrankungen des Verdauungs weltweit; jedoch stellen die meisten Patienten in einem fortgeschrittenen Stadium bei der Erstdiagnose. ZIC1
ein neuer Kandidat Tumorsuppressor-Gen ist, die epigenetisch in GC zum Schweigen gebracht wird. In dieser Studie untersuchten wir ZIC1
Promotor-Methylierung in Plasma-DNA als neuer molekularer Marker für die Früherkennung und Überwachung von GC. Methylierungsspezifischen Polymerase-Kettenreaktion (MSP) -Assay wurde durchgeführt zum Nachweis ZIC1
Promotor-Methylierung in DNA-Plasma von 20 gesunden Probanden, 50 Magen intraepitheliale Neoplasie Patienten und 104 GC-Patienten. Die ZIC1
Promotor-Methylierung Rate in den Plasmaproben von der gesunden Kontrollgruppe lag bei 0%, aber es erreichte 54,0% in der intraepitheliale Neoplasie-Gruppe und 60,6% in der GC-Gruppe. Die letzteren beiden Werte waren signifikant höher als in der Kontrollgruppe (p < 0,05), mit einer 100% Spezifität für intraepitheliale Neoplasien und GC Diagnose. Der positive prädiktive Wert von Plasma ZIC1
Promotor-Methylierung für die Diagnostik von intraepitheliale Neoplasie und GC betrug 100%. Methylierungsstatus in der GC-Gruppe war nicht signifikant mit der Größe des Tumors, Tumordifferenzierung, Lymphknotenmetastasen, TNM oder Tumorinvasion (p > 0,05) assoziiert. Die Beurteilung der Bedeutung der Erfassung des carcino-embryonale Antigen (CEA) Ebene und ergab ZIC1
Promotor-Methylierung Rate für die GC-Diagnose, dass die Empfindlichkeit von ZIC1
war Promotor-Methylierung signifikant höher als die von die CEA-Ebene als Marker und dass die kombinierte Messung dieser beiden Indizes (parallel-Test) eine verbesserte Empfindlichkeit. Zusammengenommen unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die ZIC1
Promotor-Methylierung Rate im Plasma abgeleiteten DNA ist von großer Bedeutung für die Früherkennung von GC und Überwachung von tumorigenesis. ZIC1
Promotor-Methylierung können als neuartige nicht-invasive Plasma-Biomarker für die Früherkennung von GC und für die Risikobewertung in Hochrisikogruppen dienen. Die kombinierte Messung der ZIC1
Promotor-Methylierung Rate und CEA-Ebene (Parallel-Test) können die aktuellen Richtlinien für die Früherkennung von GC verbessern

Citation:. Chen X, Lin Z, Xue M Ist, Si J, Chen S (2015) ZIC1
Promoter Hypermethylation in Plasma-DNA ein Potential von Biomarkern für Magenkrebs und intraepitheliale Neoplasie. PLoS ONE 10 (7): e0133906. doi: 10.1371 /journal.pone.0133906

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN

Empfangen: 10. April 2015; Akzeptiert: 2. Juli 2015; Veröffentlicht am: 24. Juli 2015

Copyright: © 2015 Chen et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorgesehen sind der ursprüngliche Autor und Quelle genannt

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Finanzierung:. von der National Natural Science Foundation of China (81302070, 81372623) (http://www.nsfc.gov.cn), Zhejiang Diese Arbeit wurde finanziert Provincial Medizin und Gesundheit allgemeine Forschungsplan (2014KYB121) (http://www.zjwst.gov.cn/), Zhejiang Provincial Department of Education Forschungsplan (Y201327398) (http://www.zjedu.gov.cn) und Zhejiang Provinz Schlüssel Wissenschaft und Technologie Innovation Team (2013TD13) (http://www.zjkjt.gov.cn/). Die Funder Shujie Chen konzipiert und entwickelt, um die Experimente für dieses Manuskript

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs (GC) ist einer der häufigsten Todesfälle Verdauungs Krebs und die dritthäufigste Ursache für krebsbedingte weltweit [1]. Die Mehrheit der GC-Patienten, die an einem fortgeschrittenen Stadium bei Erstdiagnose. Weltweit ist GC jährlich fast 952.000 neue Fälle für nach Globocan 2012 [2]. In Japan ist die 5-Jahres-Überlebensrate für die frühe GC (EGC) beträgt 86% verglichen mit 32% für fortgeschrittene GC, wie sie in der US SEER Programm berichtete [3].

Aberrant DNA-Methylierung ist ein wichtiger epigenetischer Änderung und ein frühes Ereignis in der Karzinogenese [4]. Vor kurzem Gene mehrere Tumor-Suppressor (gtS), einschließlich FAM5C
, Mylk
, p16
und E-Cadherin
, berichtet sein in dem Serum /Plasma von Patienten GC methyliert [5-7]. Zusätzlich hypermethylation of TSGs neigt dazu, mit dem Fortschreiten von präkanzerösen Läsionen [8-9] verbessert werden. Daher kann der Nachweis von methylierter DNA in Serum /Plasma ein vielversprechender Ansatz für die Frühdiagnose von GC sein. Intraepitheliale Neoplasie (IN) ist eine potenziell präkanzerösen Läsion, die ein hohes Risiko für GC verleiht; Somit ist die Kontrolle von Patienten entscheidend für die Diagnose und Prognose von GC. Nur wenige Berichte von hypermethylated DNA-Analysen von Blutproben von Magen-intraepitheliale Neoplasie (GIN) Patienten sind bisher verfügbar.

Growing Daten zeigen, dass ZIC1
( Zic
Familienmitglied 1 ungerader gepaart Drosophila Homolog) beteiligt sich an der Progression von verschiedenen Krebsarten [10-13]. Wir haben bereits entdeckt, dass ZIC1
, ein Roman TSG, über Promotor-Hypermethylierung in beiden GC-Zellen und Geweben zum Schweigen gebracht wird [14]. Wir haben auch gezeigt, dass ZIC1
in der Hemmung der GC das Überleben der Zellen und Beeinträchtigung der Zellmigration beteiligt ist [15].

In der vorliegenden Studie haben wir die frühen diagnostischen und prognos Potentiale bestimmt ZIC1
hypermethylation in dem Plasma von Patienten GC. Wir maßen den Promotor Methylierungsstatus von ZIC1
im Plasma von Patienten mit GC oder GIN und die normale Steuerung (NC) Themen. Der Verband der ZIC1
Promotor-Methylierung mit klinischen Parametern wurde auch bewertet. Darüber hinaus klassifiziert wir hochwertigen IN und T1 GC als EGC und legte die GC und GIN Patienten in einer GC-Plus in der Gruppe (GPI). Dann analysierten wir die ZIC1
Hyperraten sowohl in der EGC und GPI-Gruppen. Ferner wird die kombinierte Auswertung des carcino-embryonale Antigen (CEA) Ebene und ZIC1
Promotor-Methylierung für die GC-Diagnose beurteilt wurde Plasma von den GC und GIN Patienten verwenden.

Materialien und Methoden

Klinische Proben

die Plasmaproben wurden erhalten präoperativ bei Sir Run Run Shaw Hospital, Hangzhou, Zhejiang, China, von November 2012 bis April 2015. Alle Patienten in unserer Studie unterzog gastroendoscopy und wurden gruppiert nach Histopathologie Diagnose. Die Plasmaproben wurden von GC und GIN Patienten gesammelt, die zu Heilbehandlungen naiv waren, wie Chemotherapie, Strahlentherapie und chirurgische Resektion. Die Ausschlusskriterien waren Magen-Darm-Erkrankungen, die mit anderen Ursachen und Krankheiten in anderen Organen. Patienten mit Magen-Metastasen von anderen Tumoren ebenfalls ausgeschlossen wurden.

Wir nummeriert die Proben entsprechend der Reihenfolge, in der sie erhoben wurden, und dann durchgeführt methylierungsspezifische Polymerase-Kettenreaktion (MSP), die Proben in numerischer Reihenfolge zu beurteilen. Die Proben wurden weiter gruppiert nach den Pathologie Ergebnisse. Die Plasmaproben wurden von 104 GC Patienten mit einem durchschnittlichen Alter von 59,8 Jahren gesammelt werden, die nach der Weltgesundheitsorganisation Kriterien diagnostiziert wurden [16]. Fünfzig GIN Patienten mit einem durchschnittlichen Alter von 58,0 Jahre waren von Gastroskopie diagnostiziert. Blutproben wurden auch mit einem durchschnittlichen Alter von 38,5 Jahren ab 20 gesunden Probanden in der NC-Gruppe gesammelt.

Ethik-Anweisung

Unser Projekt erhielt die Genehmigung von der Clinical Research Ethics Committee des Instituts für Gastroenterologie der Zhejiang University. Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von jedem Patienten vor der Probenentnahme erhalten. Die Personen, die an dieser Studie teilgenommen gab informierte Zustimmung geschrieben (wie in der PLOS
Zustimmung Form umrissen), um diese Einzelteile zu veröffentlichen.

DNA-Isolierung und Bisulfit-Modifikation

DNA eine QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) unter Verwendung von aus den Plasmaproben extrahiert. DNA-Konzentrationen wurden durch Spektroskopie bei einer Wellenlänge von 260 nm gemessen. DNA war Bisulfit-behandelte DNA mit einem Zymo Modification Kit (Zymo Research, Orange, CA, USA). Die modifizierte DNA wurde bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert.

MSP Assays

ZIC1
Promotor-Methylierung durch Ausführen MSP-Test unter Verwendung der oben genannten Bisulfit-modifizierten frei sucht Plasma-DNA als Matrize. MSP wurde 40 Zyklen bei einer Annealing-Temperatur von 56 ° C, wie zuvor beschrieben durchgeführt [14]. Die methylierungsspezifischen Primer waren ZIC1-MF (5'-GGATTTTTTGTTTCGTAATC) und ZIC1-MR (5'-CCCGTTAACCACGTTAAACG) und die unmethylierte spezifischen Primer waren ZIC1-UF (5'-GGGATTTTTTGTTTTGTAATT) und ZIC1-UR (5 ' CCCATTAACCACATTAAACA). Das PCR-Protokoll enthalten anfängliche Denaturierung bei 95 ° C für 10 min, gefolgt von 40 Zyklen Denaturierung bei 95 ° C für 30 s, Annealing bei 56 ° C für 40 s, Primer-Extension bei 72 ° C für 40 s, und die abschließende Extension bei 72 ° C für 7 min. Die PCR-Produkte wurden auf 1,5% Agarosegelen, gefärbt mit Gel Rot und sichtbar gemacht durch UV-Beleuchtung elektrophoresiert.

Serum CEA Tests

Die Serumproben wurden an das klinische Labor von Sir Run Run geschickt Shaw Krankenhaus für die Prüfung und ein CEA-Konzentration von > 5 ng /ml wurde als abnormal angesehen.

Statistische Analysen

Die Methylierung Frequenzen und CEA Ebenen in den Plasmaproben wurden im Vergleich Fisher-Test. Der Zusammenhang zwischen der klinisch-pathologischen Eigenschaften und DNA-Hypermethylierung wurde mit dem Chi-Quadrat-Test analysiert. Der diagnostische Wert der Kombination von ZIC1
Promotor-Methylierung und das Niveau Plasma CEA ausgewertet wurde nach dem Bereich unter der receiver operating characteristic Kurve (AUC). Die Sensitivität, Spezifität und positive und negative prädiktive Werte für die pathologische Diagnose wurden mit 95% Konfidenzintervall berechnet für ZIC1
Promotor-Methylierung oder ZIC1
Promotor-Methylierung mit dem CEA-Ebene kombiniert. Positive und negative Likelihood-Quotienten wurden berechnet. Für alle Tests, einem Cut-off-Wert von p < 0,05 angewandt wurde eine statistische Signifikanz zu bestimmen. Alle statistischen Analysen wurden mit SPSS 19.0 Software durchgeführt (SPSS Inc., Chicago, IL).

Ergebnisse |

Methylierungsstatus im Plasma

Zur Beurteilung der Veränderungen in ZIC1
Promotor-Methylierung in GC, entdeckten wir zuerst den Methylierungsstatus dieses Promotors in 104 Patienten mit GC, 50 mit GIN, 31 mit EGC und 20 NCs und führte Vergleiche zwischen den Gruppen. Die Methylierung Raten der ZIC1
Promotor in den Plasmaproben wurden 0% in der NC-Gruppe (0%), in der GIN-Gruppe auf 54,0% erhöht und auf 60,6% in der GC-Gruppe (p < 0,001 sowohl für GIN und GC vs. NC), mit 100% Spezifität für GPI Diagnose (20/20) (Bild 1). Die positiven und negativen Vorhersagewerte und positive und negative Wahrscheinlichkeitsverhältnisse für die Diagnose von IN und GC waren 100% (90/90), 23,8% (20/84), unendlich und 0,42, respectively. Repräsentative MSP Assay-Ergebnisse für ZIC1
Promotor-Methylierung sind in Abb 2.

Verband der klinisch-pathologischen Eigenschaften gezeigt mit ZIC1
Promotor-Methylierung im Plasma von GC Patienten

Wir korreliert dann die klinisch-pathologischen Eigenschaften mit der ZIC1
Promotor-Methylierung Rate im Plasma der GC Patienten Assoziationen zu identifizieren. Die Ergebnisse zeigten keine deutliche Assoziationen zwischen den ZIC1
Promotor-Methylierung Rate und die klinischen Parameter, einschließlich der Größe des Tumors, Differenzierungsgrad, Lymphknotenstatus, Tumorinvasion Tiefe und TNM-Stadium (p > 0,05) (Tabelle 1) .

kombinierte Bestimmung von ZIC1
hypermethylation und CEA Ebene

die Bedeutung der kombinierten Bestimmung der für die ZIC1
hypermethylation Rate und die CEA-Ebene Diagnose und frühe Vorhersage von GC analysiert. Wir maßen die CEA-Ebene in 9 NCs, 24 GIN Patienten und 71 GC-Patienten vor der Behandlung. Die Empfindlichkeiten der CEA-Ebene in den GC, IN und EGC Gruppen waren 22,5% (16/71), 16,7% (4/24) und 10,5% (2/19) sind. In allen drei der Gruppen, die Empfindlichkeit von ZIC1
war Promotor-Methylierung signifikant höher als die der CEA-Ebene (p < 0,05).

Kombinierte Bestimmung von ZIC1
Hyper und CEA-Ebene in der GC-Gruppe.

in der GC-Gruppe waren die Sensitivität und Spezifität der kombinierten Bestimmung der ZIC1
Promotor-Methylierung Rate und die CEA-Ebene (Tandemtest) 16.9 % bzw. 90,9%, bzw. (Tabelle 2). Die Empfindlichkeit der kombinierten Analyse dieser beiden Parameter (parallel Test) betrug 69,0% (Tabelle 2), die durch die Prüfung der beiden Parameter allein erreicht höher als die Empfindlichkeit war. ROC-Kurve Analyse wurde durchgeführt, die Bedeutung der DNA-Methylierungsrate und CEA-Ebene für die GC-Diagnose zu bewerten. Die AUC für ZIC1
Promotor-Methylierung Tests allein war 0,610 (S1) Bild und die für die kombinierte Bewertung von ZIC1
Promotor-Methylierung und die CEA-Ebene (Tandem-Test) war 0,539 (S2) Bild . Bemerkenswert ist, wenn ZIC1
Promotor-Methylierung und die CEA Ebene parallel getestet wurden, erhöhte sich die AUC auf 0,633 (Bild 3). Basierend auf den obigen Ergebnissen, die kombinierte Bestimmung der ZIC1
Promotor-Methylierung Rate und CEA-Ebene (Parallel-Test) für die GC-Diagnose gefunden wurde synergistischen zu sein im Vergleich mit der Verwendung jeder allein Methode.

ZIC1
Promotor-Methylierung Rate> kombinierte Bestimmung von Gruppe ZIC1
hypermethylation und CEA-Ebene in GPI.

in der Gruppe GPI, und CEA-Ebene (Tandem-Test) waren 15,8% und 100,0% (Tabelle 3). Die kombinierte Bewertung dieser beiden Parameter (parallel testing) hatte die höchste Empfindlichkeit bei 65,3% mit einem positiven Vorhersagewert 98,4% erreicht (Tabelle 3). ROC-Kurve Analyse wurde durchgeführt, die Bedeutung der DNA-Methylierungsrate und CEA-Ebene für GPI Diagnose zu bewerten. Die AUC für ZIC1
Promotor-Methylierung Tests allein war 0,792 (S3 Bild), und dass für die kombinierte Bewertung der ZIC1
Promotor-Methylierung Rate und die CEA-Ebene (Parallel-Test) betrug 0.771 (Abb 4). Daher könnte der Nachweis von ZIC1
Promotor-Methylierung eine effektivere Alternative für GPI Diagnose sein.

Diskussion

Vor kurzem wurden zahlreiche Gene gefunden worden, in GC Geweben methyliert werden einschließlich E-Cadherin
, RASSF1A
, p16
, GSTP1
, SOCS1
, SFRP1
und PTEN
[17]. Berichtet Methylierung Frequenzen sind von 56% bis 96% lag [17]. DNA-Methylierung auch in Blutproben von Patienten GC beobachtet. Mehrere gtS wurden in Blut methyliert werden Proben von GC Patienten, darunter p16
, E-Cadherin
und RAR
, mit Erkennungsraten von 37% gefunden 48% bzw. [18-21].

ZIC1
aberrantly in bestimmte Arten von Krebs, was auf seine Funktion als TSG downregulated wird. Unsere vorherige Arbeit hat gezeigt, dass die ZIC1
Promotor häufig in primären Magenkarzinom Geweben methyliert ist, mit einer hohen Erkennungsrate von 94,6%, aber nicht in normalem Magengewebe [14]. Unsere Ergebnisse haben gezeigt, dass ZIC1
ein neuer Kandidat ist TSG, die über Promotor-Hypermethylierung in GC downregulated wird. Doch nach bestem Wissen unseren Erkenntnissen wurden keine Studien untersuchten Plasma ZIC1
Promotor-Methylierung in GC oder GIN.

In der vorliegenden Studie haben wir erstmals gezeigt, dass abweichende Methylierung des ZIC1
Promotor konnte im Plasma von GC und GIN Patienten bei Frequenzen von 60,6% und 54,0% festgestellt werden bzw. die als der NCs, die deutlich höher waren. Diese Ergebnisse stimmen mit denen von früheren Studien [14]. Aus diagnostischer Sicht ZIC1
Promotor-Methylierung zeigte eine hohe Spezifität für die NCs aus den GC und GIN Patienten Diskriminierung (100%). Unsere Ergebnisse zeigten auch, dass die Erfassung der ZIC1
Promotor-Methylierung Rate hatte einen hohen positiven prädiktiven Wert und eine positive Likelihood Ratio und AUC für GC und GIN Diagnose, was darauf hindeutet, dass ZIC1
Promotor-Methylierung Beurteilung hat potenziellen Nutzen für die Diagnose und frühe Vorhersage von GC.

Viele frühere Studien auf dem peripheren Blut DNA-Methylierung in GC konzentriert haben, anstatt GIN Patienten, mit nur einer Handvoll Studien auf DNA-Methylierung in GIN konzentriert. Die Entwicklung von endoskopischen Techniken ist für die Verfügbarkeit effektiver und weniger invasive Behandlungen für EGC und GIN Patienten erlaubt. Insgesamt trägt zur Überwachung von GC für GIN Screening und die Reduktion von GC-Todesfälle. Ein interessanter Aspekt der vorliegenden Studie ist, dass wir gezeigt aberrant ZIC1
Promotormethylierung in Plasma von Patienten, GIN, mit einer Erkennungsrate, die deutlich höher als die der NC Probanden (p < 0,001) war. In Zukunft Nachweis von Hypermethylierung des ZIC1
Promotor möglicherweise als frühes Warnzeichen verwendet werden könnten oder für die GC in Hochrisikogruppen zu screenen.

Wir haben auch ausgewertet ZIC1
Promotor-Methylierung im Plasma von GC-Patienten in Verbindung mit verschiedenen klinischen Parametern. Keine statistisch signifikanten Beziehungen wurden beobachtet zwischen ZIC1
Promotor-Methylierung und die verschiedenen klinischen Parametern, einschließlich der Größe des Tumors, Differenzierungsgrad, Lymphknotenstatus, Tumorinvasion Tiefe und TNM-Stadium; jedoch in unserer früheren Studie [15], ZIC1
Methylierungs gefunden wurde in GC Invasivität beteiligt. In der vorliegenden Studie wurden die meisten der GC-Patienten diagnostiziert und in einem frühen Stadium behandelt werden, die die endgültigen Ergebnisse beeinflusst haben könnten. Validierung in einer größeren Population könnte einen Einblick in diese unterschiedlichen Ergebnisse liefern. Ob eine Korrelation zwischen anomalen existiert ZIC1
Promotor-Methylierung und GC klinischen Merkmale bedarf der Klärung durch weitere Analysen.

CEA ist ein klassischer Tumormarker, die häufig in der Klinik beurteilt wird. Dieser Marker gilt als die am häufigsten in späten GC-Patienten zu sein; Jedoch haben viele Studien gezeigt, dass die DNA-Methylierung nachgewiesen werden kann in den frühen Stadien der GC beginnt. In unserer gegenwärtigen Studie wurde eine ROC-Kurve erzeugt, um die Bedeutung der kombinierten Erkennung des ZIC1
Promotor-Methylierung Rate und CEA-Ebene (Parallel-Test) für die Diagnose von GC und enthüllt, dass ihre kombinierten Nachweis zu bewerten produziert mehr signifikante Ergebnisse über den Nachweis von entweder allein Parameter. Deshalb schlagen wir vor, dass die kombinierte Messung des ZIC1
Promotor-Methylierung Rate und CEA-Ebene kann die Diagnose von GC zu verbessern.

Abschließend haben unsere Ergebnisse zeigten, dass die Messung von ZIC1
Promotor-Methylierung in Plasma gewonnenen DNA ist von Bedeutung für die Früherkennung von GC und für die Risikobewertung in Populationen mit hohem Risiko. Die kombinierte Messung der ZIC1
Promotor-Methylierung Rate und CEA-Ebene (Parallel-Test) können die aktuellen Richtlinien für die Früherkennung von GC zu verbessern; jedoch weitere Studien mit größeren Stichprobenumfang und die klinische Validierung erforderlich sind.

Grundinformationen
S1 Abb. Der Nachweis von ZIC1
Promotor-Methylierung bei Magenkrebs (GC) Plasmaproben.
Eine ROC-Kurve für die Bedeutung der ZIC1
Promotor-Methylierung Tests für die GC-Diagnose zu bewerten.
Doi : 10.1371 /journal.pone.0133906.s001
(TIF)
S2 Abb. Kombinierte Erkennung von ZIC1
Promotor-Methylierung und die CEA-Ebene (Tandem-Test) bei Magenkrebs (GC) Plasmaproben.
Eine ROC-Kurve für die Bewertung der Bedeutung der kombinierten Erkennung der beiden Parameter (Tandem-Test . für) GC Diagnose
doi: 10.1371 /journal.pone.0133906.s002
(TIF)
S3 Abb. Der Nachweis von ZIC1
Promotor-Methylierung im Magen-intraepitheliale Neoplasie (GPI) Plasmaproben.
Eine ROC-Kurve für die Bedeutung der Auswertung ZIC1
Promotor-Methylierung Tests für GPI Diagnose.
doi: 10.1371 /journal.pone.0133906.s003
(TIF)

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