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PLoS ONE: exosomalen miRNAs aus Peritoneum Lavage als potentielle prognostische Biomarker von Peritoneal Metastasierung in Magenkrebs


Abstrakt

Peritonealdialyse Metastasen ist die häufigste Art von Rückfällen bei Patienten mit Magenkrebs (GC) und ist mit einer schlechten Prognose verbunden. Peritonealspülung Zytologie, verwendet, um das Risiko von Peritoneal-Metastasen zu bewerten, hat eine geringe Empfindlichkeit. Hier untersuchten wir das diagnostische Potential der exosomalen miRNA Profile in Peritonealflüssigkeit zur Vorhersage von peritonealen Verbreitung in GC. Gesamt-RNA wurde aus Exosomen isoliert aus sechs Magen malignem Aszites (MA) Proben, 24 peritoneale Lavage (PLF) -Proben und die Kulturüberstände (CM) von zwei menschlichen Magenkarzinomzelllinien extrahiert, die für die peritoneale Metastasierung in ihrem Potential abweichen. Expression von exosomalen miRNAs wurde mit Agilent Menschliche miRNA-Microarrays und quantitative reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) untersucht. Der Mikroarray-Analyse zeigte eine geringe Variabilität in der Anzahl und der Signalstärke von miRNAs unter den Proben festgestellt. In den sechs MA Flüssigkeiten, miR-21 zeigte die höchste Signalintensität. Wir identifizierten fünf miRNAs (miR-1225-5p, miR-320c, miR-1202, miR-1207-5p und miR-4270) mit einer hohen Expression in MA-Proben, die PLF von Serosa-invasive GC und die CM von einer hochmetastatisch GC-Zelllinie; erscheinen diese Kandidaten miRNA Spezies peritoneal Verbreitung zusammenzuhängen. Differentielle Expression von miR-21, miR-320c und miR-1225-5p in der PLF validiert wurde von Serosa-invasive und nicht-invasive GC durch qRT-PCR und miR-21 und miR-1225-5p wurden bestätigt in Verbindung gebracht werden mit serösen Invasion in GC. PLF kann die Expression von exosomalen miRNAs zum Profil verwendet werden. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass miR-21 und miR-1225-5p können als Biomarker der Peritonealdialyse Rezidiv nach kurativer Resektion GC dienen, damit einen neuen Ansatz zur Früherkennung von Peritonealdialyse Verbreitung von GC providing

Citation. Tokuhisa M, Ichikawa Y, Kosaka N, Ochiya T, Yashiro M, Hirakawa K, et al. (2015) exosomalen miRNAs aus Peritoneum Lavage als potentielle prognostische Biomarker von Peritoneal Metastasierung in Magenkrebs. PLoS ONE 10 (7): e0130472. doi: 10.1371 /journal.pone.0130472

Editor: Soheil S. Dadras, University of Connecticut Health Center, UNITED STATES

Empfangen: 1. Februar 2015; Akzeptiert: 20. Mai 2015; Veröffentlicht am: 24. Juli 2015

Copyright: © 2015 Tokuhisa et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorgesehen sind der ursprüngliche Autor und Quelle genannt

Datenverfügbarkeit: Alle relevanten Daten innerhalb des Papiers sind

Finanzierung:.. die Autoren haben keine Unterstützung oder Finanzierung zu berichten

konkurrierende Interessen:. die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einleitung

MicroRNAs (miRNAs) sind kleine (19-23 Nukleotide) nicht-kodierenden RNAs, die funktionieren als post-Transkriptionsregulatoren der Genexpression und eine wichtige Rolle bei der Kontrolle von vielen biologischen Prozessen, einschließlich der Zelldifferenzierung, Proliferation und Apoptose [1]. MiRNAs wurden onkogene oder Tumor-unterdrückenden Aktivität gezeigt, und deregulierte Expression vieler miRNA Spezies in verschiedenen Krebsarten festgestellt worden, potentielle Anwendung von miRNAs als Biomarker der Tumorprogression und Metastasierung [2-5] hindeutet.

miRNAs sind in sekretorischen microvesicles (zB Exosomen, apoptotischen Körpern, und vergießen microvesicles), die Abschirmung miRNAs aus dem Abbau von RNAse und dienen als Vehikel für die miRNA-Sekretion in extrazellulären Raum und Körperflüssigkeiten gewickelt. Exosomen sind kleine membranöse Vesikel, die in zelluläre Immunreaktionen beteiligt sind; aber vor kurzem hat sich gezeigt, dass Exosomen erhebliche Mengen an RNA enthalten und können in immun unabhängige Regulierungsmechanismen einbezogen werden. Es wurde nun festgestellt, dass Exosomen interzellulären Transfer von miRNAs ausführen können, also in miRNA-basierte Signalmechanismen beteiligt [6]. Höhere miRNA enthaltenden Exosomen sind auch im Plasma von Krebspatienten, als in dem von gesunden Personen [7] festgestellt worden, was darauf hindeutet, dass Exosom-basierte miRNA Sekretion in der Entwicklung von Krebs beteiligt ist. Analyse von anomalen miRNA-Expression im Serum, Speichel, Kot und Urin zur Früherkennung von B-Zell-Lymphom, und oral, Darm- und Blasenkrebs [8-11].

Magenkrebs eingesetzt worden (GC) ist die zweithäufigste Ursache für Krebs-Todesfälle weltweit [12]. Das Peritoneum ist die häufigste Stelle der Metastase und Wiederauftreten von GC und maligne Aszites (MA), durch peritoneale Verbreitung von Krebszellen verursacht werden, haben mit einer schlechten Prognose in Verbindung gebracht worden. Derzeit gibt es keine zuverlässigen Prädiktoren für die Entwicklung von bösartigen peritonealen Aszites bei GC-Patienten. MiRNA-haltigen Exosomen stellen einen neuen Mechanismus der interzellulären Signalübertragung und kann Einblicke in die Umwelt ergeben, die Krebs Verbreitung im Peritoneum ermöglicht [13].

In dieser Studie wurden Exosomen von MA isoliert und die intraoperative Flüssigkeit Peritonealspülung (PLF) Proben von GC Patienten erhalten werden, und das Kulturmedium (CM) von hoch invasive peritonealen Zelllinien und miRNAs wurden dann aus diesen Proben extrahiert. Die Qualität der extrahierten exosomalen miRNAs und die Konsistenz der miRNA-Expressionsmuster wurden überprüft. MiRNA-Expressionsprofile in MA, PLF und Proben CM wurden verglichen und Kandidaten miRNAs Peritonealdialyse Verbreitung von GC verwandt wurden identifiziert.

Materialien und Methoden

Patienten

Alle Patienten oder ihre Erziehungsberechtigten eine schriftliche Einverständniserklärung zur Verfügung gestellt. Die Studie wurde von der Ethikkommission der Yokohama City University Hospital (Zulassung Nr A110127001) zugelassen.

MA und intraoperative PLF-Proben wurden von GC Patienten mit der klinisch-pathologischen Eigenschaften in Tabelle 1 gesammelt Alle Patienten, die zuvor gewesen war mit GC durch histopathologische Analyse von Biopsie-Proben aus den primären Läsionen entnommen diagnostiziert und sechs MA Patienten wurden auf das Vorhandensein von Aszites durch abdominale Computertomographie (CT) -Scan diagnostiziert. Aszites wurden ebenfalls von zytologischen analysiert und alle wurden als positiv für Bösartigkeit von Pathologen bestätigt; die restlichen MA Proben wurden für miRNA-Isolierung verwendet. PLF wurde intraoperativ von 24 GC-Patienten (Tabelle 1) gesammelt. Nach der Laparotomie wurden 100 ml normaler Kochsalzlösung wurde in den Beutel von Douglas gegossen und Wasser peritoneale Lavage wurde vor der chirurgischen Resektion des Tumors gesammelt. PLF wurde von Zytologie und für miRNA Isolation analysiert. Unter den 24 PLF Proben wurden sechs getestet unter Verwendung von miRNA-Microarray und 18 wurden durch qPCR analysiert.

Zellkultur

Die OCUM-2M-Zelllinie aus einem Primärtumor von szirrhösen Magenkarzinom etabliert wurde und die OCUM-2MD3 Zelllinie wurde von OCUM-2M-Zellen mit einem hohen Potenzial für die Peritonealdialyse Verbreitung in Nacktmäusen [14] abgeleitet. Die Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM; Life Technologies, Grand Island, NY), ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) und Antibiotika-Antimykotika bei 37 ° C in einer 5% CO 2 Inkubator. Zu erhalten Zelle CM, OCUM-2M und OCUM-2MD3 Zellen wurden dreimal mit serumfreiem DMEM mit Antibiotikum-Antimykotikum und inkubiert in dem gleichen Medium für 48 h ergänzt gewaschen.

Isolierung der Exosomen
< p> Die Proben für die exosome Isolierung wurden wie zuvor beschrieben hergestellt [15]. Zu entfernen große Zellpartikel und die Zelltrümmer, MA, PLF und CM wurden bei 2000 × zentrifugiert g
für 15 min bei 4 ° C und filtriert durch ein 0,22-um-Filter (Millipore, Billerica, MA). Der Überstand wurde bei -80 ° C gelagert, bis sie für die miRNA-Extraktion erforderlich.

Exosomen auszufällen, Proben bei 110.000 × zentrifugiert g
für 70 min bei 4 ° C. Die exosome Pellet wurde mit 11 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und zentrifugiert erneut gewaschen, wie beschrieben. Das Pellet wurde für die RNA-Extraktion verwendet.

Gesamt-RNA-Extraktion und Analyse

Gesamt-RNA aus Exosomen extrahiert wurde ein miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) unter Verwendung nach den Anweisungen des Herstellers und war dann, bis sie benötigt eine weitere Analyse bei -80 ° C gelagert.

Die Qualität, Konzentration und Größe der gesamten exosomalen RNA beurteilt wurden ein Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Foster City, CA) verwendet wird. Vor der Analyse wurde Gesamt-RNA hergestellt, ein Agilent RNA 6000 Pico Kit (Agilent Technologies) gemß dem Protokoll des Herstellers.

miRNA Microarray

extrahiert MiRNAs aus den sechs MA, sechs PLF, und zwei CM-Proben wurden unter Verwendung von Agilent Menschen miRNA Microarrays (Agilent Technologies) analysiert, die enthalten 1.226 menschlichen miRNAs und 146 menschlichen viralen miRNAs. Für miRNA-Nachweis wurden 100 ng RNA markiert und hybridisiert die menschliche miRNA Microarray-Kit (Rel 16,0; Agilent Technologies) nach dem Protokoll des Herstellers (miRNA komplette Beschriftung und Hyb-Kit für miRNA Microarray-System). Hybridisierungssignale wurden mit einem DNA-Microarray-Scanner G2505C (Agilent Technologies) und die gescannten Bilder erfasst wurden unter Verwendung des Agilent Feature Extraction Software analysiert (v. 10.7.3.1). Die Datenanalyse wurde unter Verwendung von Agilent Genespring GX Software v durchgeführt. 11.0.2. (Log 2-Transformation). Baseline-Transformation wurde nicht durchgeführt.

Die Qualität der miRNA-Extraktion analysiert wurde nach der Variabilität in der Anzahl der Mikroarray-detektierten miRNA Spezies, die Signalintensität und die Korrelation von miRNA-Expression unter den Proben nach ± ​​SD bedeuten, Variationskoeffizient (CV) und Korrelationskoeffizient (CC).

Die Auswahl der Peritonealdialyse Metastasierung spezifischen miRNAs

Die Expressionsprofile von exosomalen miRNAs analysiert wurden miRNAs zu wählen, die für die GC-Peritonealdialyse spezifisch sind Verbreitung mit dem folgenden schrittweisen Ansatz. Schritt 1: miRNA-Profile in der CM der hochmetastatisch Peritonealdialyse OCUM-2MD3 Zellen wurden mit denen der elterlichen nicht metastasiertem OCUM-2M-Zellen verglichen und differentiell exprimierte miRNAs (mittlere fold change, & gt; 2) wurden ausgewählt <. br>

Schritt 2: sechs PLF Proben in zwei Gruppen eingeteilt wurden: T4 (n = 4) und T1-T3 (n = 2), nach Krebs Stadium von Tumorgröße und Erweiterung (UICC-AJCC, 7 Zur Ausgabe). Stufe T4 GC wird durch die höchste Frequenz von Peritonealmetastasen gekennzeichnet, im Vergleich zu anderen Stufen [16]. Der Ausdruck miRNA-Profile von T4-Gruppe wurden mit denen der T1-T3-Gruppe verglichen und ausgedrückt miRNAs differentiell (mittlere fold change, & gt; 2) ausgewählt wurden

Schritt 3:. Die ausgewählten miRNAs, die gemeinsam waren beide Schritte und wurden in MA wurden weiter gefiltert nach Signalstärke ausgedrückt. Diejenigen mit Intensitätswerten von mehr als log 2 10 in MA und PLF wurden als Kandidat miRNAs im Zusammenhang mit Peritonealmetastasen ausgewählt; miR-21 zeigte die höchste durchschnittliche Signalintensität bei MA-Proben. Die differentielle Expression von miRNA ausgewählten Arten in Schritt 3 wurde in den restlichen 18 PLF Proben durch qRT-PCR validiert.

Die quantitative Analyse von peritonealen Metastasierung spezifische miRNA-Expression durch qRT-PCR

TaqMan MicroRNA Assays (Life Technologies) wurden die relativen Expressionsniveaus von miR-21 (Assay-ID. 000.397), miR-320c (Assay-ID. 241053_mat), miR-1225-5p (Assay-ID. 002.764) und miR-16 zu quantifizieren (Test-ID. 000391). Reverse Transkription wurde unter Verwendung des TaqMan RT miRNA Kit (Life Technologies) unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 30 min bei 16 ° C, 30 min bei 42 ° C und 5 min bei 85 ° C. Die PCR wurde in 96-Well-Platten mit der 7500 Real Time PCR-System (Life Technologies) durchgeführt wird; Alle Reaktionen wurden dreifach durchgeführt. Die Expressionsniveaus von Ziel miRNAs wurden zu der von miR-16 normiert, die als stabil exprimierten Kontrolle verwendet wurde [17]. Wenn unsere Microarray-Daten von exosomalen miRNA in malignem Aszites Analyse von Proben, präsentiert miR-16 den niedrigsten Variationskoeffizienten (CV = 4%) unter den internen Standards Kandidaten, einschließlich miR-638 (CV = 8%), let-7a (CV = 8%) und 142-3p (CV = 23%).


Statistische Analyse

Kontinuierliche Variablen wurden verglichen mit Student t
-test. Wenn nötig, die t
-Test wurde modifiziert, um ungleiche Varianzen vergleichen. Der Unterschied zwischen kategorischen Variablen wurde unter Verwendung des exakten Fisher-Test bewertet. Korrelation zwischen zwei Variablen wurde unter Verwendung von Pearson-Korrelationskoeffizienten untersucht. Unterschiede waren statistisch signifikant bei P & lt betrachtet; 0,05. Statistische Analysen wurden mit SPSS 21.0 Software für Windows (IBM, Armonk, NY) durchgeführt.

Ergebnisse

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