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PLoS ONE: Carnosin hemmt die Proliferation von menschlichen Magenkrebs SGC-7901-Zellen durch Sowohl die mitochondriale Atmung und Glykolyse Pathways

Abstrakt

Carnosin, ein natürlich vorkommendes Dipeptid, wurde vor kurzem zu besitzen Anti-Tumor nachgewiesen Aktivität. Allerdings ist die zugrunde liegende Mechanismus unklar. In dieser Studie untersuchten wir die Wirkung und der Mechanismus von Carnosin auf die Lebensfähigkeit der Zellen und die Proliferation der kultivierten menschlichen Magenkrebs SGC-7901-Zellen. Carnosin Behandlung haben Zell-Apoptose oder Nekrose nicht induzieren, aber die proliferative Kapazität von SGC-7901-Zellen reduziert. Seahorse-Analyse zeigte, SGC-7901-Zellen, die mit Pyruvat haben aktiven Mitochondrien und hängen von der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung mehr als Glykolyse Weg zur Erzeugung von ATP. Carnosin deutlich verringert den Absolutwert der mitochondrialen ATP-linked Atmung und verringert die maximale Sauerstoffaufnahme und Ersatzatmungskapazität, die mit proliferativen Potential korreliert mitochondrialen Funktion reduzieren. Gleichzeitig carnosine reduziert auch die extrazelluläre Ansäuerungsgeschwindigkeit und Glykolyse von SGC-7901-Zellen. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass Carnosin ist ein potentieller Regulator des Energiestoffwechsels von SGC-7901-Zellen sowohl in der anaeroben und aeroben Wege und lieferte einen Hinweis für die präklinische und klinische Bewertung von Carnosin für Magenkrebs-Therapie

Citation:. Shen Y, Yang J, Li J, Shi X, Ouyang L, Tian Y, et al. (2014) Carnosin hemmt die Proliferation von menschlichen Magenkrebs SGC-7901-Zellen durch Sowohl die mitochondriale Atmung und Glykolyse Pathways. PLoS ONE 9 (8): e104632. doi: 10.1371 /journal.pone.0104632

Editor: Salvatore V. Pizzo, der Duke University Medical Center, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 14. Februar 2014; Akzeptiert: 15. Juli 2014; Veröffentlicht: 12. August 2014

Copyright: © 2014 Shen et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Dieses Projekt von der National Natural Science Foundation of China unterstützt wurde (81102427), und zum Teil von der Provinz Zhejiang Scientific Research Foundations (Y2110322), das Programm für Zhejiang Leading Team der S &unterstützt; T Innovation (2010R50048) und Wenzhou City Science and Technology Project (2010S0094 ). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs ist eine der häufigsten malignen Erkrankungen in der Welt. In den wirtschaftlich Entwicklungsländern ist Magenkrebs die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Tod [1], [2]. Trotz der Verbesserung der chirurgischen und multimodale Therapie, die insgesamt 5-Jahres-Überlebensrate ist immer noch gering (15% bis 35%) wegen der hohen Rezidivraten, Invasion und Metastasierung [3]. Daher wird in der Gegenwart wirksamer Antitumor Arzneimittel mit weniger Nebenwirkungen zu entdecken benötigt.

L-Carnosin (β-Alanyl-L-Histidin) ist eine natürlich vorkommende Dipeptid, das durch endogene Carnosin synthetisiert wird Synthetase. Es ist weit verbreitet in Gehirn von Säugetieren, Skelettmuskel, Magen, Nieren, Herz und Haut [4], [5] verteilt. Bisher ist nicht viel bekannt über seine physiologische Funktion, sondern mehrere mutmaßliche Rollen wurden in Betracht gezogen, wie Neurotransmitter, entzündungshemmendes Mittel, Radikalfänger, mobile organische pH-Puffer und Metallchelators [6], [7]. Es wurde berichtet, dass Carnosin ein potentielles therapeutisches Mittel zur Behandlung der Alzheimer-Krankheit, Schlaganfall, Diabetes und anderen Krankheiten der Sinnesorgane [8], [9]. Erst kürzlich wurde gezeigt, dass Carnosin auch eine anti-tumorigenen Wirkungen haben können. Zum Beispiel wurde durch einen Einfluss auf glykolytische Energiestoffwechsel, der am besten charakterisierte metabolischen Phänotyp beobachtet in Tumorzellen, bekannt als Warburg-Effekt die Fähigkeit besitzen, zu malignen Gliomen Wachstum hemmen [10], und dieser Effekt [11 carnosine berichtet vermittelt werden ], [12].

Vor kurzem hat die Bedeutung der Mitochondrien als Sauerstoffsensoren sowie Hersteller von ATP zu einem Brennpunkt der Krebsforschung geworden und Studien ein wichtiges Phänomen, dass die mitochondriale Metabolismus gezeigt haben, besonders Zitronensäure Zyklusaktivität ist für die schnelle Verbreitung von mehreren Krebszelltypen wichtig [13], [14]. Jedoch ist im Fall von menschlichen Magenkrebszellen, wenig Informationen zur Verfügung, in welchem ​​Ausmaß der Glykolyse und der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung (OXPHOS) an die zellulären Energieproduktion und schnelle Proliferation beitragen. Ob Carnosin können auch das Wachstum von menschlichen Magenkrebszellen hemmen, bleibt unbekannt. Und ob die Hemmwirkung von Carnosin auf das Wachstum von Tumorzellen wird auch seine Wirkung auf die mitochondriale Atmung und OXPHOS Zusammenhang bleibt unklar.

Vor kurzem hat die Seahorse Bioscience XF96 Extracellular Flux Analyzer verwendet worden, um gleichzeitig und kontinuierlich zu überwachen sowohl die aerobe und glykolytische Komponenten zellulärer bioenergetics [15]. Daher wird in der vorliegenden Studie untersuchten wir die Wirkung von Carnosin auf das Wachstum von menschlichen Magenkrebszellen und zur weiteren bioenergetischen Profil von kultivierten menschlichen Zellen Magenkrebs SGC-7901 und die Rollen von Carnosin in SGC-7901 Zellen Energiestoffwechsel zu charakterisieren mit die Seahorse Bioscience XF96 Extracellular Flux Analyzer und anderen verwandten Technologien.

Materialien und Methoden

Reagenzien

L-Carnosin, Natriumpyruvat, Rotenon, Carbonyl- Cyanid p-trifluormethoxyphenyl-Hydrazon (FCCP), A Antimycin, 3- [4,5-Dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetra-zolium Bromid (MTT), Methanol, Milchsäure wurden von Sigma (St. Louis, MO, USA). Penicillin, Streptomycin, L-Glutamin, Trypsin, Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), fötales Rinderserum wurden von GIBCO-BRL (Grand Island, NY, USA). Annexin V-FITC /PI Apoptose-Nachweis-Kit, BCA Protein Assay Kit und ATP-Assay-Kits wurden von Beyotime Institut für Biotechnologie gekauft ((Nanjing, China). XF-Assay-Medium und XF Kalibrierlösung von Seahorse Bioscience gekauft wurden.

Zellkultur

menschlichen Magenkrebszelllinie SGC-7901 (SGC-7901), Linie hepatozellulären Karzinoms menschliche Leberzelle (HepG2) und Gliomzelllinie Ratten-C6 (C6) von der Shanghai Institute Zellbank erworben wurden, Chinese Academy of Science (die ursprüngliche Quelle ist American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA, USA). die Zellen wurden in DMEM-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 100 U /ml Penicillin G und 100 &mgr; g /ml Streptomycin, und bei 37 ° C und 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator gehalten. Die Zellen in einem Verhältnis von 1.03 nach Konfluenz unter Verwendung von 0,25% Trypsin mit Trypsin behandelt wurden. subkultiviert Zellen auf 96- ausgesät wurden, 24- oder 6-Well-Platten bei Dichten von 2 x 10 3, 5 x 10 4, 2 × 10 5 oder 1 x 10 6 Zellen /Vertiefung auf.

MTT-Reduktionstest

Zelle wurde die metabolische Aktivität von kolorimetrischen MTT-Test, wie zuvor beschrieben überwacht [16]. Kurz gesagt wurden die Zellen auf Platten mit 96 Vertiefungen kultiviert, und es gab in jeder Gruppe 6 Vertiefungen. Am Ende der Experimente wurden die Zellen bei 37 ° C für 4 h mit 0,5 mg /ml MTT inkubiert. Dann wurde der Überstand Schicht entfernt, und 100 &mgr; l Dimethylsulfoxid wurde in jede Vertiefung gegeben. MTT Stoffwechsel wurde spektrophotometrisch bei 570 nm in einem Biorad Mikroplattenleser quantifiziert. Ergebnisse wurden als Prozentsatz der MTT-Reduktion ausgedrückt als 100% der Extinktion der Kontrollzellen nehmen.

Koloniebildungstest

Die Zellen wurden bei einer Dichte von 100-200 Zellen in Sechs-Well-Platten ausplattiert pro Vertiefung, und wurden dann mit Carnosin (20 mM) behandelt. Klone wurden für 14 Tage in DMEM-Kulturmedium mit 10% FBS, 100 U /ml Penicillin G und 100 &mgr; g /ml Streptomycin ergänzt wachsen gelassen. Zellen wurden anschließend mit 70% Ethanol fixiert und mit Coomassie Brilliant Blue zur Analyse der Koloniebildung gefärbt, wie zuvor beschrieben [17].

Durchflusszytometrie-Assay von Zelltod

Der Zelltod wurde durch Annexin quantifiziert V-FITC-PI (Propidiumiodid) Doppelfärbung, ein Annexin V-FITC Apoptose-Nachweis-Kit unter Verwendung von nach dem Vorschlag des Herstellers. Kurz gesagt wurden in 6-well Platten ausgesät, Zellen in DMEM Medium. Zellen wurden für 48 h mit 20 mM Carnosin behandelt und wurden dann gesammelt und zweimal in eiskaltem PBS gewaschen, bei einer Dichte von 1 × 10 in Bindungspuffer resuspendiert 6 Zellen /ml. Die Zellen wurden gleichzeitig mit Fluorescein-markiertem Annexin V und PI für 20 min und durch Durchflusszytometrie analysiert inkubiert. Annexin V-FITC erzeugten Signale mit einem FITC-Signal-Detektor nachgewiesen wurden (FL1, 525 nm). PI-Signale wurden mit einem Detektor reserviert für Phycoerythrin Emission (FL2, 575 nm) überwacht. Die Daten wurden unter Verwendung von Cell Quest Software von BD analysiert.

Extracellular Flux Technologie Nachrichten

Um die Sauerstoffverbrauchsrate messen (OCR) und extrazelluläre Ansäuerung Rate (ECAR) von Zellen unter verschiedenen Bedingungen, ein Seahorse XF96 Extracellular Flux Analyzer (Seahorse Bioscience, Billerica, MA, USA) verwendet. Dieses Instrument ermöglicht die empfindliche Messung der Glykolyse und mehrere Parameter der mitochondrialen Funktion, einschließlich basal OCR, Ersatzatmungskapazität maximal OCR, ATP-linked Atmung und Protonenleck von anhaftenden intakten kultivierten Zellen. Nach Baseline-Messungen wurden nach der sequentiellen Zugabe gemessen OCR und ECAR in jede Vertiefung 20 ul Oligomycin, Rotenon und FCCP, Arbeitskonzentrationen von 1 &mgr; g /ml zu erreichen, 1 uM und 1 uM, respectively. Alle Assays wurden in einer Zellkultur-Mikrotiterplatte XF96 (Seahorse Bioscience) mit einer Aussaatdichte von 10000 Zellen /Vertiefung in 200 ul DMEM durchgeführt. Die Zellen wurden in DMEM ungepufferte geschaltet mit 2 mM Natriumpyruvat supplementiert und 20 mM Carnosin 1 h vor Beginn des Assays und bei 37 ° C gehalten. OCR wird in der Einheit von Picomol pro Minute und ECAR berichtet wird, in milli-pH-Einheiten (MPH) pro Minute angegeben.

Bestimmung der ATP Produktion

Die ATP-Assay durchgeführt wurde nach dem Hersteller Anweisung. Kurz gesagt, geerntet kultivierten Zellen wurden durch Zentrifugation für 2 min bei 4 ° C bei 10.000 × g mit einem Lysepuffer, anschließend lysiert. Schließlich wird in 6-Well-Platten wurde die ATP-Spiegel um 20 &mgr; l des Überstandes mit 100 ul Luciferase-Reagens Mischen bestimmt, die die Lichterzeugung aus ATP und Luciferin katalysiert. Luminance wurde durch einen Monochromator Mikrotiterplatten-Lesegerät gemessen. Standardkurve wurde erzeugt, und die Proteinkonzentration jeder Gruppe wurde unter Verwendung des BCA-Protein-Assay-Kits bestimmt. Gesamt ATP-Spiegel als nmol /mg Protein ausgedrückt wurden.

HPLC-Analyse von extrazellulären Milchsäure

Die Konzentration von Milchsäure in dem zellfreien Überstand durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie gemessen (HPLC ) mit einem UV-Detektor unter Verwendung der Technik kombiniert, wie zuvor beschrieben. Kurz gesagt, wurden die vorbereiteten analysates getrennt auf Ecosil C-18-Umkehrsäule (3 &mgr; m, 250 mm × 4,6 mm) Lösungsmittel A und Lösungsmittel B mit [0,1 mol /l NH 4H 2PO 4 ( pH 3,4) verdünnt, v /v in Methanol 97:3] mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml /min. Die Temperatur der Säule wurde bei 25 ° C, und die Wellenlänge des UV-Detektion gehalten wurde bei 210 nm eingestellt.

mitochondrialen Membranpotentials Beurteilungs

Die Änderungen der relativen mitochondrialen Membranpotentials (Δ Ψ
m) wurden unter Verwendung des lipophilen kationischen Sonde beurteilt JC-1 5,5 ', 6,6'-Tetrachlor-1,1', 3,3'-Tetra-Ethyl-benzamid azolocarbocyanine Iodid (JC-1; Molecular Probes). Der Farbstoff JC-1 erfährt eine reversible Änderung in der Fluoreszenzemission von grün bis grünlich Orange als Δ Ψ
m erhöht. Zellen mit hoher Δ Ψ
m Form JC-1-Aggregate und fluoreszieren rot; Personen mit niedrigem Δ Ψ
m enthalten monomeren JC-1 und grün fluoreszieren. Nach der Behandlung mit Carnosin für 48 h wurde das Kulturmedium entfernt und die Zellen auf Deckgläsern gezüchtet wurden im Dunkeln mit JC-1 in einer Endkonzentration von 2 uM für 20 min inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit PBS und bei 488 nm angeregt mit einer Olympus BX-51 Fluoreszenzmikroskop gespült.

Die mtDNA-Kopienzahl Messung

Absolute mtDNA-Kopienzahl durch den Vergleich der PCR-Amplifikation eines Mitochondrien gemessen wurde Amplikon [Mensch, NADH-Ubichinon Oxidoreduktase Kette 4 (ND4)] mit einem nuklearen Amplikon (Mensch, β-Aktin) aus DNA eines Qiagen DNA Mini Kit isoliert werden. Die Primersequenzen sind wie folgt: menschliche β-Aktin (vorwärts: 5'-ACCCACACTGTGCC CATCTAC-3 '; umgekehrt: 5'-TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTA-3'); Mensch ND4 (vorwärts: 5'-TCCTCCTATCCCTCAACCCC-3 '; umgekehrt: 5'-CACAATCTGATGTTTT GGTTAAAC-3'). DNA-Matrizen wurden von Regionen überspannt jedes Amplikon durch PCR-Amplifikation hergestellt. Verdünnungen von 1 x 10 8 bis 1 × 10 2 Kopien der isolierten DNA, die eine Standardkurve für die Quantifizierung zu erzeugen, verwendet. Die PCR-Zyklusbedingungen bestanden aus einem Aktivierungsschritt bei 95 ° C für 30 sec, gefolgt von 40 Zyklen für 5 Sekunden bei 95 ° C und 30 sec bei 58 ° C. Alle PCRs wurden auf einem Bio-Rad CFX-Manager Real-Time PCR-System (Applied Biosciences) durchgeführt.

Statistische Analyse

Alle Daten repräsentieren drei oder mehr unabhängigen Experimenten. Die Daten wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Statistische Analysen wurden von SPSS 11.5 für Windows durchgeführt. One-way ANOVA (Varianzanalyse), gefolgt von LSD (geringste signifikante Differenz) oder Dunnetts T3 post-hoc
Test (wo gleiche Varianzen wurden nicht angenommen) wurde für mehrere Vergleiche angewendet, während Student-t-Test war Vergleiche zwischen zwei Gruppen verwendet. P
< 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen

Ergebnisse |

Effekt von Carnosin auf SGC-7901-Zellen Lebensfähigkeit

Um die Wirkung von Carnosin bestimmen auf. menschlichen Magenkrebs SGC-7901-Zellen Lebensfähigkeit, MTT-Reduktionstest verwendet wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass Carnosin Behandlung signifikant die Lebensfähigkeit der Zellen in einer zeit- und konzentrationsabhängigen Art und Weise verringert. Carnosin bei Konzentrationen von 5 und 20 mM deutlich die Lebensfähigkeit der Zellen auf 84,0% und 57,9% der Kontrolle bei 24 h reduziert und auf 73,5% und 45,9% der Kontrolle bei 48 h, bzw. (Fig. 1A). Jedoch Carnosin bei einer Konzentration von 1 mM nicht SGC-7901-Zellen die Lebensfähigkeit bei 24 oder 48 h beeinflussen. Wir Flow weiter Zytometrie verwendet zu testen, ob Carnosin SGC-7901 Zell-Nekrose oder Apoptose führen könnte. Überraschenderweise zeigten die Ergebnisse, dass Carnosin Behandlung für 48 h nicht in SGC-7901 Zellen nekrotischen oder apoptotischen Zelltod induzierte (Fig. 1B). Weil MTT Reduktion wird auch ein Hinweis auf zelluläre metabolische Aktivität zu interpretieren, und die MTT-Wert einer Zellpopulation wird durch sowohl die Anzahl der lebensfähigen Zellen vorhanden und ihre relativen Stoffwechselrate bestimmt, so neben wir die Zellzahl in einem parallelen Experiment berechnen mit gleich behandelt SGC-7901-Zellen unter Verwendung von Zellzählung Platte. Wir fanden heraus, dass die Zellzahl in carnosine 48 h behandelten Gruppe war ähnlich zu der in der Kontrollgruppe (Abb. 1C), was darauf hinweist, dass die reduzierte die Lebensfähigkeit der Zellen für 48 h durch carnosine Behandlung induziert in SGC-7901-Zellen wurde durch metabolische Veränderungen aber nicht wegen Zelltod oder Zellproliferation.

um zu überprüfen, ob diese Aktionen von Carnosin existieren auch in anderen Krebszellen, HepG2 und C6-Zellen verwendet wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass 20 mM Carnosin Behandlung für 48 Stunden nicht den Zelltod induzieren hat (Tabelle. S1) oder die Proliferation, aber deutlich reduziert MTT reduzierende Aktivität sowohl in HepG2 und C6-Zellen (Abb. S1).

choronic Behandlung mit carnosine

SGC-7901-Zellen Kolonien Bildung gehemmt um zu untersuchen, ob choronic Exposition gegenüber carnosine die proliferative Kapazität von SGC-7901-Zellen beeinflussen könnten, wurden die Zellen bei einer niedrigen Dichte (100-200 Zellen /Vertiefung) ausgesät und 14 Tage erlaubt Kolonien in DMEM mit 20 mM Carnosin ergänzt zu bilden. Wie in gezeigt. 2, choronic Exposition gegen carnosine reduziert Kolonien Bildung auf 39,9% der Kontrolle.

Bioenergetische Charakterisierung von kultivierten SGC-7901-Zellen

Wir haben die OCRs und ECAR in kultivierten SGC-7901-Zellen untersucht eine Seahorse mit XF-96 extrazellulärem Flußmittel analyzer, wie zuvor beschrieben [18]. Basal zelluläre OCR und ECAR wurden zu 161,02 ± 29,58 pmol /min gefunden pro 10 x 10 3-Zellen (Anfangszellzahl) und 39,31 ± 4,29 mpH /min pro 10 x 10 3-Zellen bzw. (Abb. 3A). Die ATP-verknüpft Atmung (die Gesamt Basalrate minus die Rate mit Oligomycin, wo Oligomycin ein Inhibitor der ATP-Synthese ist) war 96,15 ± 18,34 pmol /min pro 10 x 10 3-Zellen, was darauf hinweist, dass ungefähr 60% der zellulären Sauerstoff Verbrauch wurde auf die ATP-Synthese zusammen. Gleichzeitig wurde ECAR in Gegenwart von maximal wirksamen Dosis von Oligomycin (1 ug /ml) auf ~ 250% des Ausgangsraten erhöht, was darauf hinweist, dass die Zellen die mitochondriale Atmung zu Glykolyse verschoben. Rotenon (1 uM) reduziert OCR auf 55,78 ± 8,86 pmol /min pro 10 x 10 3-Zellen (~ 35% der Basissätze). Die Rotenon-resistente Rate spiegelt die nicht-mitochondriale Atmungsrate, die Substratoxidation und Zelloberflächensauerstoffverbrauch enthält [19]. Somit nicht mitochondriale Atmung entfielen ~ 35%, während die mitochondriale Atmung für ~ 65% des gesamten Zellatmung ausmachten. So wird in kultivierten SGC-7901 Zellen ~92% (60% /65%) der mitochondrialen Atmung wurde die ATP-Synthese gekoppelt ist, und ~ 8% der mitochondrialen Atmung wurde durch Protonen-Leck berücksichtigt (Fig. 3B). In Gegenwart von maximal wirksamen Dosis von FCCP (1 uM, ein Entkopplungsmittel, die maximalen Elektronentransport ermöglicht) wurde eine gleichzeitige Zunahme in OCR beobachtet, und es wurde erhöht auf 204 ± 30,24 pmol /min pro 10 x 10 3-Zellen.

Wir untersuchten auch den relativen Beitrag der Glykolyse und OXPHOS in ATP Produktionsrate in SGC-7901-Zellen. Absolute Quantifizierungen sowohl der Glykolyse-Rate und Oligomycin empfindlichen Sauerstoffverbrauchsrate wurden in SGC-7901-Zellen gemessen. Die extrazelluläre Ansäuerung Rate ist vor allem auf Lactat und Bicarbonat Produktion und, wenn als Protonenproduktionsrate kalibriert, glykolytischen Rate gibt [15]. So verwendeten wir oxamat Lactatdehydrogenase zu hemmen, die Pyruvat umwandelt im letzten Schritt der Glykolyse zu Lactat, die Protonenproduktionsrate zu berechnen (Fig. 3C). Es gibt eine Eins-zu-Eins-Beziehung zwischen der Laktatproduktionsrate und der ATP-Produktionsrate von Glykolyse. Die Oligomycin empfindlichen Sauerstoffverbrauch wurde in die ATP-Produktion Kurs umgerechnet mit einem P /O-Verhältnis von 2,3 [20]. Die Ergebnisse zeigten, dass SGC-7901-Zellen, die in DMEM (hohe Glukose) aus mindestens 93% ihres ATP mit OXPHOS (Abb. 3D) mit 2 mM Pyruvat ergänzt.

Carnosin die bioenergetische Charakterisierung von SGC- geändert 7901 Zellen

Wir untersuchten die Wirkung von Carnosin auf den Sauerstoffverbrauch und die extrazelluläre Ansäuerung Rate in kultivierten SGC-7901-Zellen. Die Ergebnisse in Fig. 4 zeigte, dass die Behandlung mit 20 mM Carnosin für 48 h die basale OCR und ECAR bis 141,13 ± 27,06 pmol /min pro 10 x 10 3 Zellen (~87% der Kontrolle), und 11,32 ± 2,49 mpH /min pro 10 reduziert × 10 3 Zellen (~27% der Kontrolle) bzw. (Fig. 4A, B). Der ATP-linked Atmung, Protonenleck, und nicht-mitochondrialen Atmungsrate waren 81,03 ± 17,97 7,15 ± 3,6 und 52,96 ± 8,40 pmol /min pro 10 x 10 3-Zellen, bzw. (Fig. 4C, D, E ). Somit in Carnosin SGC-7901 behandelten Zellen entfielen mitochondriale Atmung für ~62% der gesamten Zellatmung und ~92% (57% /62%) der mitochondrialen Atmung zur ATP-Synthese gekoppelt wurde, und ~ 8% der mitochondrialen Atmung war entfielen durch Protonen-Leck. Daher verringerte carnosine Behandlung den Absolutwert-ATP verbunden Atmung, aber es hat nicht die relative Beitragssatz von beeinflussen ATP-linked Atmung, Protonenleck, und nicht die mitochondriale Atmung auf die Gesamtzellatmung. Darüber hinaus haben wir auch festgestellt, dass Carnosin Behandlung deutlich die maximale OCR und Ersatzatmungskapazität 161,60 ± 28,46 pmol /min pro 10 x 10 3 Zellen (~79% der Kontrolle) reduziert und 20,47 ± 6,92 pmol /min pro 10 × 10 3-Zellen (~47% der Kontrolle) (Abb. 4F, G).

HepG2 und C6-Zellen auch die Auswirkungen von Carnosin auf Krebszellen den Energiestoffwechsel weiter zu überprüfen, wurden verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass 20 mM Carnosin Behandlung für 48 h deutlich die basale OCR und ECAR der HepG2 und C6-Zellen verringert, respectively. Carnosin hinaus auch ATP-linked Atmung in C6 Zellen reduziert, aber nicht in HepG2-Zellen (Fig. S2). Jedoch 20 mM Carnosin reduziert deutlich den zellulären ATP-Gehalt sowohl in HepG2 und C6-Zellen, was darauf hinweist, daß die Glykolyse Hemmung in Carnosin Wirkung beteiligt war, zumindest in HepG2-Zellen (Fig. S2J).

Carnosin verringert extrazellulärem Milchsäure Ebene in kultivierten SGC-7901-Zellen

Da Carnosin ein mobiles organische pH-Puffer ist, die extrazelluläre Ansäuerung Rate in der vorliegenden Carnosinspiegel getestet mit dem Seahorse XF96 Extracellular Flux Analyzer nicht die reale Glykolyse Rate reflektieren kann. So auch wir HPLC-Assay für die extrazelluläre Milchsäurespiegel verwendet, um die Wirkung von Carnosin auf die Glykolyse in SGC-7901-Zellen zu überprüfen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Carnosin Behandlung deutlich die extrazelluläre Milchsäureniveau auf 84% der Kontrolle (Fig. 5) reduziert wird, was anzeigt, dass Carnosin eine potentielle inhibierende Wirkung auf die Glykolyse in kultivierten SGC-7901 Zellen hat.

Carnosin änderte relativen Beitrag der Glykolyse und OXPHOS ATP-Ladung in SGC-7901-Zellen, die in DMEM Mangel an Pyruvat

Wir charakterisiert auch die Wirkung von Carnosin auf den Veränderungen der ATP-Gehalt und der relative Beitrag der Glykolyse und OXPHOS ATP-Ladung in SGC-7901-Zellen, die in DMEM Mangel an Pyruvat. Wir maßen zelluläre ATP-Konzentration in 45 min bis sechs Bedingungen ausgesetzt Zellen: Fahrzeug, das Glykolyse-Inhibitor 2-DG, FCCP, Rotenon, FCCP und Rotenon und 2-DG und FCCP und Rotenon. Wir fanden, dass Carnosin Behandlung für 48 Stunden signifikant reduziert ATP-Gehalt auf 62% der Kontrolle. 2-DG-Behandlung deutlich reduziert ATP-Gehalt von 48% und 34% in carnosine abwesend und Carnosinmenge Gruppen, wenn sie mit ihrem eigenen Fahrzeug Gruppen verglichen sind. FCCP und FCCP und Rotenon auch jeweils deutlich um 15% und 18% ATP-Gehalt in carnosine abwesend Gruppe reduziert. Allerdings haben diese Medikamente ATP-Gehalt in Carnosinmenge Gruppe beeinflussen nicht. Rotenon hatte keinen Einfluss auf ATP-Gehalt sowohl in carnosine fehlt oder Gruppen. 2-DG in Kombination mit FCCP und Rotenon im Wesentlichen die ATP-Produktion sowohl in diesen beiden Gruppen (Abb. 6) eliminiert. So 2-DG verringert ATP mehr als FCCP oder Rotenon aufladen tat beide in carnosine abwesend und anwesend Gruppen. Diese Daten zeigen, dass ATP Generation verschiebt sich von OXPHOS Glykolyse, wenn die Funktion der Mitochondrien beeinträchtigt wird. ATP Ladung nicht vollständig beibehalten, nachdem die Hemmung der entweder Glykolyse oder die Funktion der Mitochondrien in carnosine abwesend Gruppe, während ATP Ladung nach Hemmung der Funktion der Mitochondrien in Carnosinmenge Gruppe gehalten wird. So verändert carnosine Behandlung der relative Beitrag von OXPHOS und Glykolyse in ATP Produktionsrate in SGC-7901-Zellen.

Wirkung von Pyruvat auf der hemmenden Wirkung von Carnosin auf SGC-7901-Zellen die Funktion der Mitochondrien

um zu untersuchen, ob die Höhe der Pyruvat Erhöhen der inhibierende Effekt von Carnosin auf die mitochondriale Atmung von SGC-7901-Zellen umzukehren, wurden die Zellen in verschiedenen Konzentrationen von Pyruvat ausgesetzt. Wie in der Tabelle gezeigt. 1 konnte das Niveau von Pyruvat zu erhöhen, nicht gegen die Hemmwirkung von Carnosin auf SGC-7901-Zellen die mitochondriale Atmung. Darüber hinaus zeigte die MTT-Test auch, dass das Niveau der Pyruvat-Erhöhung nicht die carnosine Wirkung auf SGC-7901-Zellen Mitochondrien-Stoffwechsel (Abb. 7) umkehren könnte.

Effekte von Carnosin auf die mitochondriale DNA-Gehalt und die mitochondriale Membranpotential in SGC-7901 Zellen

mitochondrialen Membranpotentials (Δ Ψ
m) der Mehrheit der protonenmotorische Kraft zum Antreiben ATP-Synthese verwendet und daher eine wichtige Rolle bei der maximalen ATP entfallen -erzeugendes Kapazität [21]. Deshalb nutzen wir auch die lipophilen kationischen Sonde JC-1 zu untersuchen, ob Carnosin OXPHOS über Unterdrückung des mitochondrialen Membranpotentials (Δ Ψ
m) unterdrückt. Die Ergebnisse zeigten, dass Carnosin Behandlung für 48 Stunden keine deutliche Veränderung von Δ induzieren könnte Ψ
m in kultivierten SGC-7901-Zellen (Abb. 8A).

die anscheinend die mitochondriale Atmung verringert zu adressieren induziert durch Carnosin, quantifiziert wir auch die absolute mitochondriale DNA (mtDNA) Zahl, die für die Aufrechterhaltung der zellulären Energiebedarf streng reguliert wird [22]. Zu unserer Überraschung zeigten die Ergebnisse, dass im Vergleich zu Kontrollzellen, die absoluten mtDNA-Kopienzahlen von Carnosin behandelte 7901-Zellen wurden deutlich erhöht, und die durchschnittlichen absoluten mtDNA-Kopienzahlen in den Kontrollzellen und 360,0 ± 59,84 in der Carnosin 141,49 ± 7,42 waren -behandelten Zellen (Abb. 8B).

Diskussion

Nach unserem Wissen ist dies der erste Bericht des bioenergetischen Profil von kultivierten SGC-7901-Zellen behandelt mit und ohne carnosine. Unsere wichtigsten Ergebnisse sind wie folgt. Erstens reduziert carnosine die proliferative Kapazität von SGC-7901-Zellen. Zweitens kultivierten die Zellen in DMEM (hohe Glucose), ergänzt mit 2 mM Pyruvat gemacht ~93% ihres ATP OXPHOS verwenden. Drittens ausgeübt carnosine seine Hemmwirkung auf SGC-7901-Zellen-Proliferation durch Glykolyse, OXPHOS und die mitochondriale Atmung der Zellen hemmen und diese Aktionen von Carnosin wurden auch in HepG2 und C6-Zellen gefunden. Somit sollte carnosine zusammen mit der wachsenden Bewaffnung von Verbindungen in verschiedenen Stadien der Entwicklung von Medikamenten in Betracht gezogen werden, dass Tumormetabolismus Ziel, eines der wichtigsten Merkmale des Tumors [23].

Aufgrund seines breiten Wirkungsspektrum, carnosine kann als therapeutische Faktor bei der Behandlung vieler Krankheiten considerded werden. Zum Beispiel wurde für Magen Gesundheit und für gut repair [24] Zinc Carnosin verwendet. Kürzlich zeigten Studien transformierten Zellen wuchsen nicht in MEM hohen Konzentrationen von Carnosin enthält und Carnosin als Medikament in vivo verabreicht werden, um das Wachstum von bösartigen Zellen [25] zu hemmen. Jedoch hatte sich die Frage, ob Carnosin das Wachstum von menschlichen Magentumorzellen neben den malignen Zellen verhindern kann, die zuvor berichtet wurden. In der vorliegenden Studie fanden wir, dass Carnosin auch in der Lage ist, das Wachstum von kultivierten SGC-7901-Zellen in einer zeit- und konzentrationsabhängigen Weise zu inhibieren, und diese Wirkung wurde nicht durch Apoptose oder Nekrose begleitet, sondern werden eher durch reduzierte Proliferation. Allerdings sind die detaillierten Mechanismen der hemmenden Wirkung von Carnosin auf SGC-7901-Zellen-Proliferation zugrunde liegen noch unklar.

Es ist weithin anerkannt, dass metabolische Veränderungen eines der Markenzeichen von Krebs sind. Otto Warburg beschrieb als erster die verstärkte Nutzung des anaeroben Stoffwechsels in Gegenwart von ausreichend Sauerstoff durch Krebszellen im Vergleich zu ihren normalen Pendants: bezeichnet die "Warburg-Effekt" [26]. Jedoch kürzlich wurde es darauf hingewiesen, dass die molekulare Ausrichtung der OXPHOS Wirksamkeit bei fortgeschrittenem Melanom haben können, deren Gehalt an OXPHOS erhöht haben [14]. So können verschiedene Arten von Tumoren auf ihren verschiedenen Entwicklungsstadien haben ihre eigenen Stoffwechseleigenschaften. Daher sind die therapeutischen Strategien und Mechanismen der verschiedenen Behandlungs Tumoren anhand von energetischen Metabolismus unterschiedlich. In der vorliegenden Studie verwendeten wir zunächst eine neue extrazelluläre Flusstechnik mehrere Parameter der Funktion der Mitochondrien und der extrazellulären Ansäuerungsgeschwindigkeit parallel ATP Konzentrationsbestimmung zur Beurteilung der bioenergetischen Charakterisierung des menschlichen Magenkrebs SGC-7901-Zellen zu erforschen. Unsere Seahorse Analyse zeigte SGC-7901-Zellen haben aktive Mitochondrien, und hängen von mitochondrialen OXPHOS mehr als Glykolyse Wege zur Erzeugung von ATP in der Kulturbedingungen mit hoher Glukose und Pyruvat, was darauf hindeutet, dass die mitochondriale Atmung ein potenzielles therapeutisches Ziel in der menschlichen Magenkrebs sein kann.

jedoch, wenn die Zellen in DMEM Mangel an Pyruvat kultiviert wurden, sie hängen von Glykolyse mehr als das in DMEM mit 2 mM Pyruvat zugeführt, weil die Hemmung der Glycolyse von 2-DG zu einem Rückgang von ~48 führenden % zellulären ATP-Gehalt. Darüber hinaus zeigen diese Daten auch, dass SGC-7901-Zellen wahrscheinlich Plastizität fehlt in der Glykolyse auf die mitochondriale Atmung umzuschalten, wenn glykolytischen ATP-Produktion in der Kulturbedingungen Mangel an Energie Substanzen abgeschafft wird. Auf der anderen Seite, Wu et al
. haben berichtet, dass es eine wirksame Ausgleichs Aufregulation der Glykolyse nach der Verabreichung von Oligomycin Phosphorylierung zu blockieren oxidative war, und diese Antwort konnte ATP Ebene in den menschlichen nicht-kleinzelligen Karzinomzelllinien H460 und A549 [15] zu erhalten. Unsere Ergebnisse zeigten auch, dass SGC-7901-Zellen haben die Fähigkeit, die Glykolyse zu erhöhen, wenn die Funktion der Mitochondrien durch Oligomycin blockiert wird. Darüber hinaus, wenn der mitochondrialen Funktion durch Rotenon, eine wirksame Ausgleichs Aufregulation der Glykolyse unterdrückt wurde accurred, und diese Antwort konnte ATP Ebene in SGC-7901-Zellen zu erhalten. Allerdings könnten die Zellen nicht genug Glykolyse Kapazität upregulate ATP Niveau aufrechtzuerhalten, wenn die mitochondriale Atmung von ATP-Synthese Abkoppeln von FCCP induziert (Abb. 6). Daher besitzen SGC-7901-Zellen erhebliche Glykolyse und mitochondriale respartion Kapazität, und es macht die Zellen unter verschiedenen Bedingungen wachsen.

Erst vor kurzem wurde gezeigt, dass Carnosin auf glycolytic Proliferation von malignen Gliomen durch einen Einfluss reduziert und ATP Synthese [27]. In unserer gegenwärtigen Studie fanden wir auch, dass die Behandlung mit Carnosin die extrazelluläre Ansäuerungsgeschwindigkeit und Milchsäureniveau abnimmt fähig war, was darauf hinweist, dass Carnosin einen hemmenden Effekt auf die Glykolyse in SGC-7901-Zellen hat. Allerdings hat Carnosin nicht vollständig, sondern teilweise gehemmt Glykolyse Kapazität der Zellen, weil pharmakologische Hemmung der mitochondrialen Atmung durch Rotenon oder den mitochondrialen Protonengradienten aus ATP-Produktion durch FCCP abgekoppelt oder mit Rotenon behandelt und FCCP gleichzeitig waren die Zellen noch in der Lage Glykolyse hochzuregulieren für ATP Verarmungs (Fig. 6) zu kompensieren. Interessanterweise fanden wir, dass Carnosin auch eine neue Rolle als Regulator der mitochondrialen Atmung besitzt. Carnosin unterdrückt basale Niveaus der mitochondrialen Atmung, und dies war hauptsächlich aufgrund der verringerten ATP-linked Atmung, was darauf hinweist, dass die mitochondriale ATP Ausgangs Abnahmen in der Carnosin-behandelten SGC-7901-Zellen.

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