PLoS ONE: MicroRNA 135a Unterdrückt Lymphknotenmetastase durch Down-Regulation von ROCK1 in Magenfrüh Cancer

Abstrakt

MicroRNAs (miRNAs) eine entscheidende Rolle bei Magenkrebs Progression und Metastasierung spielen. Diese Studie untersuchte die Rolle der miRNA-135a in Magenfrühkarzinomen (EGC), einschließlich Lymphknoten (LN) Metastasierung. Wir untersuchten den Zusammenhang zwischen miRNA-135a-Expression und klinischen Ergebnisse bei 59 Patienten, die Operation für EGC unterzog. Magenkrebs Zelllinien, führten wir funktionale und Zielgen analysiert. miRNA-135a-Expression wurde in 33,9% der Patienten nach unten reguliert. Diese Patienten zeigten eine signifikant fortgeschritteneren Stadium (TNM stage≥IB, 35,0% vs. 12,8%; p = 0,045) und eine höhere Rate der LN Metastasierung (30,0% vs. 5,1%, p = 0,014) als die mit Hochregulierung von miRNA-135a-Expression. In einer multivariaten Analyse, die Herunterregulierung von miRNA-135a war ein unabhängiger Risikofaktor für LN Metastasierung (adjustierte Odds Ratio 8,04; 95% Konfidenzintervall 1,08 bis 59,81; p = 0,042). Funktionelle Analysen Magenkrebs-Zelllinien zeigte, dass miRNA-135a unterdrückt die Lebensfähigkeit der Zellen, epitheliale-mesenchymale Transition, Zellinvasion und Migration. ROCK1 war ein Ziel von miRNA-135a und seine Expression wurde umgekehrt zu der miRNA-135a korreliert. ROCK1 Expression wurde in EGC Patienten mit LN Metastasierung signifikant erhöht als bei Patienten ohne Metastasierung LN. Unsere Ergebnisse bestätigen die tumorunterdrückende Rolle der miRNA-135a, und seine Rolle bei der EGC in LN Metastasierung zeigen. miRNA-135a und sein Zielgen ROCK1
können neue therapeutische und prognostische Ziele für die EGC sein

Citation. Shin JY, Kim YI, Cho SJ, Lee MK, Kook MC, Lee JH, et al. (2014) MicroRNA 135a Unterdrückt Lymphknotenmetastase durch Down-Regulation von ROCK1 in Magenfrühkarzinomen. PLoS ONE 9 (1): e85205. doi: 10.1371 /journal.pone.0085205

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

Empfangen: 28. Oktober 2013; Akzeptiert: 23. November 2013 beginnen; Veröffentlicht: 21. Januar 2014

Copyright: © 2014 Shin et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Studie durch Zuschuss wurde 1110532-3 vom National Cancer Center, Korea finanziert. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:. HA ist ein PLoS ONE Redaktionsmitglied und dies ändert nichts an der Einhaltung der Autoren zu allen Politiken PLoS ONE auf den Austausch von Daten und Materialien.

Einführung

Magenkrebs bleibt immer noch die zweithäufigste Ursache der Krebssterblichkeit weltweit, obwohl sie in den entwickelten Ländern Inzidenz und Sterblichkeit abnimmt [1 ].

In den Bereichen, einschließlich Korea und Japan, wo Screening für Magenkrebs weit durchgeführt wird, ist die Früherkennung oft möglich. Da eine erhöhte Rate der Früherkennung von Magenkrebs zu einer verbesserten Prognose führen kann, Anteile an Patienten Verbesserung der Lebensqualität und die Verwendung minimal-invasive Behandlungen haben zugenommen. Bei Patienten mit Magenkrebs, Lymphknoten (LN) Metastasierung ist eine der wichtigsten prognostischen Faktoren, und die Gesamthäufigkeit eines LN Metastasierung in frühen Magenkrebs (EGC) im Bereich von 5 bis 20% [2] - [4].

Gastrectomy mit LN Dissektion wird als die Standard-Behandlung für Magenkrebs angesehen; jedoch 80 bis 95% der Patienten mit EGC keine LN Dissektion erforderlich, wenn das Magenkrebs vollständig durch weniger invasive Behandlungen, wie beispielsweise endoskopische Resektion exzidiert wird [5] - [7] oder minimal invasive Chirurgie ( zB
, einfache Keilresektion oder Sentinel LN Navigationschirurgie) [8] - [10]. Obwohl Studien der biologischen prognostische und prädiktive Marker für LN Metastasierung in EGC durchgeführt wurden, gibt es keine prädiktive Werkzeuge für Lymphknotenmetastasen von EGC tatsächlich.

Mehrere Studien zeigen, dass die Tiefe der Invasion berichtet haben, die Tumorgröße und lymphatische Invasion sind im Zusammenhang mit LN Metastasierung in EGC [4], [11]. Jedoch wurden nach der endgültigen pathologische Untersuchung von Gewebe reseziert bestimmt meisten dieser Faktoren, die bei der Bestimmung Behandlungsstrategie nicht sinnvoll ist.

MicroRNAs (miRNAs) sind kleine, nicht-Protein-codierenden RNAs. Studien haben gezeigt, dass Veränderungen in der Expression von miRNAs an der Pathogenese von Krebs beiträgt denen von gastrointestinalen Ursprungs, einschließlich [12] - [15].

miRNAs wurden auch bei der Differenzierung von Krebs und normalen Geweben als nützlich gezeigt worden [ ,,,0],16], [17]. Zusätzlich miRNAs werden differentiell in jeder Stufe von Magenkrebs Karzinogenese exprimiert [18]. miRNA-27 [19] und die ZEB1-regulierte miRNA-200-Familie [20] haben gezeigt, auf Stufe der epithelial-mesenchymale Transition (EMT) bei Magenkrebs verbunden zu sein. Daher kann miRNAs mit dem Prozess der LN Metastasierung in EGC zugeordnet sein. Unter miRNAs wurde miRNA-135a gezeigt, dass ein Tumorsuppressor-miRNA zu sein, und seine Expression herunterreguliert in verschiedenen Krebsarten einschließlich Nierenzellkarzinom [21] und Lymphom [22]. Wiederum eine Überexpression oder Wiederherstellung der miRNA-135a fördert Apoptose und unterdrückt die Proliferation von Tumorzellen durch ihre Zielgene c-Myc [21] und JAK2 [22], respectively. In einer In-vitro-
Studie, unterdrückt miRNA-135a wandernde und invasive Aktivitäten von Magenkrebszellen [23]. Allerdings ist die tumorsuppressive Rolle der miRNA-135a bei Magenkrebs unklar.

Das Ziel dieser Studie war die Korrelation zwischen miRNA-135a-Expression und klinischen Ergebnisse bei Patienten EGC einschließlich LN Metastasierung zu untersuchen.

Materialien und Methoden

Humangewebeproben und klinischen Daten

Neunundfünfzig erwachsenen Patienten mit EGC am National Cancer Center diagnostiziert, Korea, von Januar 2011 bis April 2013 wurden prospektiv eingeschlossen in diese Studie. Diese Patienten wurden mit einem offenen oder Laparoskopie-assistierte Gastrektomie mit D1 + oder mehr LN Dissektion behandelt. Das Ausmaß der LN Dissektion folgte den Empfehlungen des japanischen Gastric Cancer Association [24]. Die Bühne nach der Operation wurde nach dem 7 ausgewertet ^{th Ausgabe des American Joint Committee on Cancer TNM [25]. Menschliche Gewebe sowohl Magenkrebs und abgestimmt normalen Geweben von jedem Patienten einschließlich wurden sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C gelagert. Aus der Überprüfung der medizinischen Charts, klinisch-pathologische Merkmale wie Alter, Geschlecht, Helicobacter pylori
Status, Tumor-Eigenschaften, Stufe, und den Status von LN Metastasierung wurden erhalten und analysiert. Schriftliche Einwilligung nach Aufklärung wurde von allen Patienten erhalten, und die Studie wurde von der Institutional Review Board des National Cancer Center, Korea (NCCNCS-11-445) zugelassen.}

Zellkultur und Transfektion

normalen menschlichen Magen-epithelialen Zell-Linie HFE145 [26], [27] war ein Geschenk von Dr. Hassan Ashktorab und Duane T. Smoot (Howard University, Washington, USA) und im Handel erhältlich AGS Magenkrebszelllinien, YCC2, MKN28, KatoIII, SNU1 , SNU5, SNU16, SNU216, SNU601, SNU638, SNU668 und SNU719 wurden aus dem Korea-Zelllinie Bank (KCLB, Seoul, Korea) erhalten. Alle Zelllinien wurden in RPMI 1640-Medium, das 10% fötales Rinderserum (FBS) und 1% Antibiotika (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) gehalten. Unter den Magenkrebszelllinien, MKN28 und SNU668 wurden Zelllinien ausgewählt, da sie selten miRNA-135a exprimieren und YCC und KatoIII Zelllinien wurden ausgewählt, weil sie eine erhebliche Grundlinien Expression von miRNA-135a (1A) aufweisen. Transfektionen mit miRNA-135a-Mimetika (Mirvana ™ miRNA imitiert, Ambion, Austin, TX, USA), einem miRNA-135a-Inhibitor (Mirvana ™ miRNA-Inhibitor, Ambion, Austin, TX, USA), und ROCK1 siRNA (5'-UGAUGCAAAGAUUGUACUC- 3 '; UGBioneer, Seoul, Korea) in SNU668, YCC2, MKN28 und KatoIII Zelllinien wurden unter Verwendung von Lipofectamin RNAiMAX und Lipofectamine 2000 Reagenzien (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. MKN28, SNU668, YCC2 und KatoIII Zelllinien wurden zwei Tage nach der Transfektion geerntet, und verschiedene Untersuchungen wurden durchgeführt.

RNA Extraktion und Quantifizierung miRNAs

Gesamt-RNA wurde aus 13-Zelllinien isoliert und 59 Magenkrebs-Patienten 'Gewebe bzw. unter Verwendung von TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers. Die TaqMan Universal-PCR-Master-Mix Reagenzien-Kit (Applied Biosystems, Tokyo, Japan) verwendet. Amplifikation und Detektion wurden bei 95 ° C (15 Sekunden) und Annealing /Extension bei 60 ° C (60 Sekunden) unter Verwendung eines 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, Tokyo, Japan) mit 40 Zyklen von Denaturierung durchgeführt. Dies wurde für 10 Minuten für 30 Minuten und Denaturierung bei 95 ° C bei 50 ° C durch reverse Transkription voraus. Zum Quantifizieren reifen miRNAs, TaqMan MicroRNA-Assays Kits (Applied Biosystems, Tokyo, Japan) wurden verwendet Nachweis von miRNA-135a und einer Steuer miRNA (RNU6B).

Western-Blot-Analyse

Protein war "Gewebeproben unter Verwendung von RIPA-Puffer (Biosesang, Seoul, Korea), der eine Proteaseinhibitorcocktail (Sigma, St. Louis, MO, USA) nach dem Protokoll des Herstellers aus 13 Zelllinien und 59 EGC Patienten extrahiert. Als nächstes wurde Western-Blotting-anti-ROCK1 und anti-β-Actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) unter Verwendung von Antikörpern durchgeführt. Die Signale wurden mit einem ECL-Prime-Kit (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) nachgewiesen, wie pro Anweisungen des Herstellers.

Zellproliferationsassays

Die Zellproliferation gemessen wurde ein MTT-Test verwendet wird. Die Zellen wurden in 96-Well-Kulturplatten (3 x 10 ^{3 Zellen pro Vertiefung) und transfiziert mit miRNA-135a ahmt nach zwei Tagen Inkubation überzogen. Anschließend wurden 200 &mgr; l MTT (0,5 mg /ml, Sigma, St. Louis, MO, USA) wurden in jede Vertiefung gegeben. Nach vier Stunden zusätzlicher Inkubation wurden die MTT-Lösungen verworfen, 200 &mgr; l DMSO (Amresco, Solon, OH, USA) wurden in jede Vertiefung gegeben, und die Platte wurde vorsichtig geschüttelt. Die Extinktion wurde auf einem ELISA-Lesegerät (Moecular Devices, Sunnyvale CA, USA) bei einer Testwellenlänge von 570 nm gemessen.}

Zellzyklusanalyse

Die Zellen wurden in 60π Kulturplatten ausplattiert und transfiziert mit miRNA -135a nachahmt oder eine negative Kontrolle miRNA imitiert (Mimics-NC). Diese Zellen wurden durch Trypsinisierung und fixiert in 70% Ethanol für mindestens zwei Stunden bei -20 ° C geerntet. Zellpellets wurden mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und für 30 Minuten bei Raumtemperatur in PI /RNase Färbepuffer (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) inkubiert. Nach dem Färben mit einem FACScan Flow Proben wurden Zytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) analysiert und 10.000 Ereignisse pro Probe gesammelt wurden. Die Daten aus der Durchflusszytometrie wurden unter Verwendung von Cell Quest Software (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) analysiert.

Trans-Filter Migration und Invasion Assays

Die Zellen wurden mit miRNA-135a ahmt transfiziert miRNA-135a-Inhibitoren, ROCK1 siRNA, und ROCK1 siRNA Negativkontrolle (scRNA) für einen Tag und dann in die obere Kammer des Transwell-Platte übertragen, beschichtet mit 0,5 mg /ml Kollagen Typ I (BD Bioscience, Bedford, MA, USA) und eine 01.15 Verdünnung von Matrigel (BD Bioscience, Bedford, MA, USA). RPMI 1640 mit 10% FBS und 1% Antibiotika (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) wurde in die untere Kammer gegeben und die Platte wurde einer Inkubation für 20 Stunden. Migration und eindringenden Zellen wurden mit Hämatoxylin und Eosin-Färbung quantifiziert.

Die Luciferasereporterplasmid Konstruktionen

Die Wildtyp-3'-UTR von ROCK1 enthält Bindungsstellen für miRNA-135a verstärkt wurde unter Verwendung von gDNA aus SNU668 Zellen als Vorlage. Die korrelierten mutierten Konstrukte wurden durch Mutieren der Seed-Regionen der miRNA-135-Bindungsstellen geschaffen. Sowohl Wildtyp und Mutante 3 'UTR wurden in stromabwärts des Luciferase-Gens in einem pGL3 Steuervektor kloniert. Die Konstrukte wurden durch Sequenzierung verifiziert.

Luciferaseassay

Luciferase-Assays wurden in SNU668 und YCC2 Zellen durchgeführt. SNU668 und YCC2 Zellen wurden mit jedem der Plasmide (leerer Vektor [MOCK], ROCK1 3 'UTR Wildtyp [WT] und ROCK1 3' UTR-Mutante [MUT], als miRNA-135a-Bindungsstelle) transfiziert zusammen mit miRNA 135a nachahmt, miRNA-135a-Inhibitoren und negativen Kontroll-RNA in 24-Well-Platten. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet und lysiert. Luciferase-Assays wurden an den Lysaten durchgeführt, indem ein Luciferase-Assay-Kit (Promega, Madison, WI, USA). Die Luciferase-Aktivität wurde normalisiert zu ß-Galactosidase.

Immunhistochemische Färbung

immunhistochemischen (IHC) Färbung für repräsentative 20 Fälle von ROCK1 niedrigen und hohen Expressions Gruppen durchgeführt wurde. Antigen Retrieval wurde für 30 min bei pH mit Wärmebehandlung durchgeführt 8,0 Tris-EDTA-Puffer (CC1, Ventana Medical System, Tucson, AZ, USA) bei 95 ° C. Gewebeobjektträger wurden für 30 Minuten mit Anti-ROCK1 mAb (; Abcam, Cambridge, MA, USA ab134181, clone EPR638Y, Kaninchen monoklonale, 1:5,000) bei 42 ° C inkubiert. Negative Kontrollen wurden identisch mit nicht-immunisierten Kaninchen-IgG verwendet. Die Ergebnisse wurden von einem erfahrenen Pathologen (MC Kook) interpretiert.

Die statistische Analyse

Scale-Daten angegeben werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD). Chi-Quadrat oder exakte Tests Fisher und der Mann-Whitney-U-Test wurden verwendet, kategoriale Variablen und kontinuierlichen Variablen zu vergleichen sind. Der Pearson-Korrelationskoeffizient wurde zum Vergleich der Genexpressionsmuster zwischen miRNA-135a und ROCK1 verwendet. unabhängige Faktoren wurde eine multivariate logistische Regressionsmodell verwendet, mit LN Metastasierung zu bestimmen. Kovariaten, die bedeutende Verwendung von Chi-Quadrat oder Fisher-Tests waren ( P
< 0,05) wurden in das logistische Regressionsmodell eingegeben. Alle Daten wurden mit Stata 12.1 (Stata Corp, College Station, TX, USA) analysiert. A P
Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

miRNA-135a-Expressionsniveaus mit Progression und LN Metastasierung in EGC verbunden sind

Eine frühere Studie zeigte, dass miRNA-135a-Expression-heruntergeregelt wird bei Magenkrebs-Zelllinien [23]. Durch die Verwendung von qRT-PCR, fanden wir auch, dass miRNA-135a-Expression herunterreguliert in verschiedenen Linien Magenkrebszellen im Vergleich zu dem in einer normalen Magen-epithelialen Zelllinie (Abbildung 1A).

Allerdings ist die Korrelation zwischen miRNA-135a-Expression und die klinischen Ergebnisse bei Magenkrebs wurde nicht untersucht. Daher messen wir die miRNA-135a-Expressionsniveaus in primären Magenkrebs und ihre entsprechenden Ebenen in normalem Gewebe von 59 Patienten mit EGC. Down- und Hochregulation von Genen in Tumorgeweben in Bezug auf normales Gewebe als das Verhältnis von Tumor zu normalem Gewebe Genexpressionsniveaus von <definiert wurden; 1,0 und >. 1,0 jeweils

Im Gegensatz zu dem Ergebnis, von in-vitro-
Experiment, nur 20 (33,9%) der 59 Patienten mit EGC ausgestellt Herunterregulation der miRNA-135a-Expression. Allerdings zeigten diese Patienten deutlich weiter fortgeschritten (TNM stage≥IB, 35,0% vs. 12,8%, p = 0,045; rohe ungerade Ratio [OR] 2,11; 95% Konfidenzintervall [CI], 1,08 bis 4,10) und ein höhere Rate von LN Metastasen (30,0% vs. 5,1%, p = 0,014; rohe OR, 2,73; 95% CI, 1,50-4,98) als diejenigen mit Hochregulation der miRNA-135a-Expression (Tabelle S1). Die Sensitivität und Spezifität der Expressionsstatus miRNA-135a für die Vorhersage von LN Metastasen waren 75,0% und 72,5%, respectively. Außerdem können Patienten mit fortgeschrittenen Stadium (1B) oder LN Metastasierung (1C) zeigten eine signifikant niedrigeres Verhältnis von Tumor zu normalen miRNA-135a-Expressionsniveaus als solche mit Stadium IA oder ohne LN Metastasierung. Eine multivariate logistische Regressionsanalyse zeigte auch, dass miRNA-135a Herunterregulierung unabhängig mit LN Metastasierung (adjustierte OR 8,04; 95% CI, 1,08-59,81; p = 0,042; Tabelle 1) verbunden war. Zusammengefasst legen diese Ergebnisse nahe, dass die Herunterregulierung von miRNA-135a-Expression kann mit Magenkrebs Progression einschließlich LN Metastasen in Verbindung gebracht werden.

miRNA-135a Magenkrebs die Lebensfähigkeit der Zellen unterdrückt, EMT, Migration und Invasion

Um die Verbindung zwischen miRNA-135a und die klinischen Ergebnisse zu untersuchen, führten wir funktionelle Assays für die Lebensfähigkeit der Zellen, Zellzyklus, EMT, Migration und Invasion in Magenkrebs-Zelllinien. Die Überexpression von miRNA-135a von miRNA-135a ahmt signifikant unterdrückt die Lebensfähigkeit der Zellen (2A) und erhöhte die subdiploid Anteil an SNU668-Zellen, eine Zelllinie, die nur selten miRNA-135a (2B) zum Ausdruck bringt, die erhöhte Apoptose von Magenkrebszellen hindeutet. Allerdings Unterdrückung von miRNA-135a von miRNA-135a-Inhibitoren induziert weder eine Erhöhung der Lebensfähigkeit der Zellen noch eine subdiploid Fraktion Abnahme der YCC2-Zellen, eine Zelllinie, die wesentliche miRNA-135a (2A und 2B) zum Ausdruck bringt. Wir untersuchten auch die Assoziation zwischen miRNA-135a-Expression und EMT in Magenkrebszellen, weil miRNA-135a Herunterregulierung ein unabhängiger Risikofaktor für LN Metastasierung in EGC Patienten (Tabelle 1) war. Erhöhte Expression von miRNA-135a wurde mit Unterdrückung von EMT assoziiert und zeigte eine Zunahme in der Expression von E-Cadherin und die Unterdrückung von sowohl N-Cadherin und Slug in SNU688 Zellen. Im Gegensatz dazu ist die Hemmung der Expression miRNA-135a führte zu einer Aktivierung von EMT einschließlich der Unterdrückung der E-Cadherin-Expression und die Hochregulation der beiden N-Cadherin und Slug-Expression in YCC2 Zellen (2C). Bei der Beurteilung der funktionellen Konsequenzen, die Überexpression von miRNA-135a von miRNA-135a-Mimetika unterdrückt signifikant die Migration und Invasion Fähigkeiten von SNU668 Magenkrebszellen (2D). Umgekehrt Blockade von miRNA-135a von miRNA-135a-Inhibitoren Migration und Invasion von YCC2 Magenkrebszellen (Abbildung 2E) signifikant erhöht. Insgesamt schlug unsere Ergebnisse, dass miRNA-135a ein Tumorsuppressor-Regulator für Magenkrebs Proliferation und Metastasierung ist.

ROCK1 ist ein Zielgen von miRNA-135a bei Magenkrebs

Zur Aufklärung der zugrunde liegenden Mechanismen die Auswirkungen der miRNA-135a auf die klinischen Ergebnisse, suchten wir mutmaßliche Ziele durch die TargetScan 6.2-Datenbank. Von 718 Ziele erhalten, wählten wir Ziele mit der höchsten Punktzahl, deren Herunterregulierung könnte zu einer erhöhten Krebszellproliferation, Migration und Invasion zur Folge haben. Wir fanden, dass ROCK1 könnte ein Zielgen des miRNA-135a sein, weil die Hemmung oder Unterdrückung von ROCK1 wurde berichtet Apoptose fördern und Migration, Invasion zu unterdrücken, und die Proliferation von Krebszellen, einschließlich derjenigen, von Magenkrebs [28] - [30]. TargetScan Analyse ergab, dass die 3'UTR-Sequenz des ROCK1 hat eine mögliche Bindungsstelle für miRNA-135a (3A). Um zu bestätigen, ob ROCK1 ein Ziel von miRNA-135a ist, wurde ein Luciferase-Assay durchgeführt. Die Luciferase 3'UTR Konstrukte in Abschnitt Verfahren beschrieben, wurden kotransfiziert in SNU688 Zellen mit miRNA-135a imitiert und in YCC2 Zellen mit miRNA-135a-Inhibitoren. Wir bauten auch ROCK1 3'UTR MUT durch Punktmutation C → G in der möglichen Bindungsstelle (3A). Die relativen Luciferase-Aktivität des ROCK1 3'UTR WT wurde in Gegenwart von miRNA-135a-Inhibitoren (3B) signifikant erhöht. Umgekehrt wurde diese Aktivität signifikant in Gegenwart von miRNA-135a-Mimetika (3C) verringert. In Magenkrebszelllinien, miRNA-135a und ROCK1 zeigte einen gegnerischen Expressionsmuster. Western-Blot-Analyse zeigte, dass ROCK1 Expression herunterreguliert in Gegenwart von miRNA-135a-Mimetika und hochreguliert in Gegenwart von miRNA-135a-Inhibitoren (3D und 3E). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass miRNA-135a unterdrückt ROCK1 Ausdruck durch direkte Eingabe der 3'UTR Targeting.

Die Expression von ROCK1 invers korreliert, dass der miRNA-135a bei Patienten mit EGC

Analyse von 59 Patienten mit EGC zeigte, dass die Expressionsniveaus von ROCK1 mit denen der miRNA-135a eine signifikant negative Korrelation hatte (r = -0,697, p < 0,001; 4A). Darüber hinaus mit Patienten Hochregulation der Expression miRNA-135a hatten signifikant niedrigere Niveaus von ROCK1 Proteinexpression als solche mit Down-Regulation der miRNA-135a (mittlere Tumor zu normalen Verhältnis, 0,81 vs. 1,55, p < 0,001; 4B) .

ROCK1 mit LN Metastasierung in EGC zugeordnet ist und in Magenkrebs Zellmigration und Invasion unterdrückt von miRNA-135a

Zur weiteren Bewertung der Assoziation zwischen ROCK1 Ausdruck und die klinischen Ergebnisse in EGC beteiligt, wir analysierten die Muster der ROCK1 Expression in Bezug auf das LN Metastasierung Status enthalten Patienten. Patienten mit LN Metastasen hatten eine signifikant höhere Expression von ROCK1 Protein als solche ohne LN Metastasierung (mittlere Tumor zu normalen Verhältnis, 1,86 vs. 0,93, p = 0,007; 5A). Darüber hinaus Ebenen der ROCK1 IHC-Färbung waren ähnlich denen von ROCK1 Ausdruck in Western-Blot-Analyse ( dh
, Patienten ohne LN Metastasierung hatte schwache Färbung Muster IHC [5B], aber solche mit LN Metastasen hatten starke positive IHC-Färbung [5C]).

Schließlich untersuchen, ob die unterdrückt Migration und Invasion durch die miRNA-135a verliehenen Fähigkeiten hoch~~POS=TRUNC bei Magenkrebs-Zelllinien beobachtet das Ergebnis ROCK1 hoch~~POS=TRUNC waren, haben wir die Migration durchgeführt und Invasionsassays Magenkrebs-Zelllinien, transfiziert mit spezifischen ROCK1 siRNA verwenden. ROCK1 siRNA unterdrückt wandernde und invasive Aktivitäten in SNU668-Zellen (5D). In YCC2 Zellen cotransfiziert mit miRNA-135a-Inhibitoren und ROCK1 siRNA (5E), Migration und Invasion Assays gezeigt, dass die Hemmung der ROCK1 durch siRNA deutlich die Verbesserung der Migrations- und invasive Effekte der miRNA-135a abgeschwächt Herunterregulation von miRNA-135a-Inhibitoren (5F).

Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass ROCK1 mit LN Metastasierung in EGC Patienten zugeordnet ist, und dass diese ergibt sich aus erhöhten ROCK1 Expression im Rahmen der miRNA-135a Herunterregulierung. Daher ROCK1 kann in miRNA-135a-unterdrückt Magenkrebs Metastasen beteiligt werden.

Diskussion

In der vorliegenden Studie haben wir festgestellt, dass miRNA-135a bei Magenkrebs tumorsuppressive Rollen hatte. Bei Patienten mit EGC, Herunterregulation der miRNA-135a war ein unabhängiger Risikofaktor für LN Metastasierung. In Magenkrebszellen hochreguliert miRNA-135a unterdrückt Magen-Krebsentstehung durch die Unterdrückung der Zellproliferation, EMT und Metastasierung. Darüber hinaus haben wir auch ein neues Zielgen von miRNA-135a identifiziert, ROCK1, die mit LN Metastasierung bei Magenkrebs assoziiert.

Bei Patienten mit EGC, Auswertung von LN Metastasierung vor der Behandlung ist ein wichtiger Schritt bei der Bestimmung Behandlungsstrategien. Weniger invasive Behandlungen wie endoskopische Resektion [5] - [7] oder Sentinel LN Navigation Chirurgie [9], [10] ohne LN Metastasierung in EGC Patienten möglich sein kann. Diese Behandlungsansätze haben Patienten die Lebensqualität der in Bezug auf die Spätkomplikationen verbessert in Verbindung mit Standard-chirurgische Behandlungen einschließlich Dumping-Syndrom, Gewichtsverlust, und Reflux-Symptomen [31]. Daher sind spezifische und sensible Biomarker erforderlich, um den Status von LN Metastasen bei Patienten mit EGC zu prognostizieren. In der vorliegenden Studie, miRNA-135a Herunterregulierung war ein unabhängiger Faktor für LN Metastasierung und Vorhersagewert von miRNA-135a-Expression Status war relativ hoch mit einer Sensitivität 75% und einer Spezifität 73%. Obwohl weitere Validierungsstudien erforderlich sind, zeigten diese Ergebnisse, dass die Messung von miRNA-135a Niveau vor den Behandlungsplan für EGC Patienten Bestimmung ein nützlicher Test zur Vorhersage von LN-Status sein könnte.

Interessanterweise miRNA-135a wurde gemeldet tumorsuppressive und onkogene zu sein. Die Überexpression von miRNA-135a hat mit der Unterdrückung der Tumorproliferation und das Wachstum in Nierenzellkarzinom [21] und mit einer erhöhten Apoptose und eine bessere krankheitsfreie Überleben in Lymphom [22] in Verbindung gebracht worden. Im Gegensatz dazu wurde miRNA-135a in kolorektalen Krebsprogression beteiligt [32] und zu einer erhöhten Brustzellmigration und Invasion [33]. In der vorliegenden Studie wurde miRNA-135a gezeigt, dass ein Tumorsuppressor-miRNA zu sein, die mit dem Ergebnis einer früheren Studie in Übereinstimmung ist [23]. Speziell unterdrückte die höhere Expression von miRNA-135a in mehreren Schritten von Magen-Krebsentstehung darunter Proliferation, Migration und Invasion. Darüber hinaus haben wir auch gefunden, dass miRNA-135a EMT unterdrücken kann, die mit der Einleitung des mehrstufiger Prozess der Karzinogenese und zur Förderung der Metastasierung [34], [35] in Verbindung gebracht werden gemeldet hat. Vor der vorliegenden Studie wurde der Zusammenhang zwischen der miRNA-135a und EMT wurde nicht untersucht, obwohl frühere Studien, dass miRNAs gezeigt haben, wie miRNA-27 [19], die miRNA-200-Familie [20], miRNA-7 [36] und miRNA-1228 [37] Unterdrückungs EMT durch ihre eigene Zielgene in Magenkrebs. Zusammengenommen miRNA-135a ist ein Tumorsuppressor-miRNA bei Magenkrebs.

Eine frühere Studie 353 menschlichen Magenkrebsgewebe Analyse zeigte, dass Expressionsmuster von miRNAs sind vielfältig und dass einige miRNAs wurden mit Progression und Prognose im Magen-assoziierten Krebs [14]. In der Studie wurde miRNA-135a als ein onkogenen miRNA bei Magenkrebs auf die Ergebnisse von DNA-Microarray-Analysen basiert klassifiziert. Doch in einer aktuellen [23] und unsere Studie, miRNA-135a fungierte als Tumorsuppressor trotz der hohen Rate von Patienten mit miRNA-135a Hochregulierung. Obwohl viele Patienten (66%) hatten eine Hochregulation der miRNA-135a ähnlich dem Ergebnis einer früheren Studie [14] zeigten diese Patienten eine signifikant weniger fortgeschrittenen Stadium und eine niedrigere Rate von LN Metastasierung. Darüber hinaus können zusätzliche In-vitro-
Studien zeigten auch, dass eine höhere Expression von miRNA-135a mit der Unterdrückung der Magen-Krebsentstehung verbunden war. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Expressionsmuster von miRNAs könnte aus den klinischen Ergebnissen abweichen, und daher die genauen Rollen von spezifischen miRNAs zu bestätigen, sind weitere Studien erforderlich.

ROCK1 ist ein Mitglied der Rho-assoziierte Serin /Threonin Kinase-Familie, die als zentraler Regulator der Aktin-Zytoskelett Organisation Funktion und Dynamik [23], [38]. ROCK1 hat eine breite Palette von Funktionen in tumorigenesis einschließlich Migration, Invasion und Metastasierung [28]. ROCK1 ist ein Ziel von mehreren miRNAs in verschiedenen Tumoren einschließlich miRNA-584 in Nierenzellkarzinom [39], miRNA-335 in Neuroblastom [40], und miRNA-146a bei Prostatakrebs [41]. In Magenkrebs hat ROCK1 wurde mit LN Metastasierung und TNM-Stadium [42] positiv korreliert und in miRNA-148a-induzierte Unterdrückung von Magenkrebs Zellmigration und Invasion [30] beteiligt. Ferner ROCK1 Inhibitor der Apoptose in Magenkrebszellen gefördert [29]. In der vorliegenden Studie haben wir festgestellt, dass ROCK1 ein Ziel von miRNA-135a bei Magenkrebs und seine Expression positiv mit LN Metastasen bei EGC Patienten. In-vitro-
Experimente zeigten auch, dass ROCK1 bei Magenkrebs Zellbeweglichkeit und Invasion beteiligt ist. Diese Ergebnisse legen nahe, dass ROCK1 ein neues therapeutisches Ziel mit der Fähigkeit sein kann Magenkrebs Metastasen zu hemmen.

Abschließend haben wir miRNA-135a als neuer prognostischer Biomarker für LN Metastasen bei Patienten mit EGC identifiziert und gezeigt, dass miRNA-135a Magen Karzinogenese unterdrückt ( dh
, Proliferation, EMT und Metastasierung in Linien Magenkrebszellen) durch ROCK1 Targeting. Obwohl diese Ergebnisse in anderen unabhängigen Patientengruppen validiert werden müssen, schlagen sie vor, dass miRNA-135a und sein Zielgen ROCK1 ein neuer Biomarker und therapeutische Ziel für Magenkrebs mit LN Metastasierung sein kann.

Hintergrundinformationen
Tabelle S1 .
Clinicopathologic Merkmale von Patienten mit Magenfrühkarzinomen nach miRNA-135a-Expression Status
doi:. 10.1371 /journal.pone.0085205.s001
(DOC)

• PLoS ONE: Assoziation zwischen Polymorphismen in XRCC1 Gene und Behandlungsergebnisse von Patienten mit fortgeschrittenem Magenkarzinom: eine systematische Überprüfung und Meta-Analyse
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