PLoS ONE: Deregulation zwischen miR-29b /c und Dnmt3a mit epigenetische Silencing des CDH1 Gen assoziiert, Affecting Zellmigration und Invasion in Gastric Cancer

Abstrakt

Die de-Regelung der miR-29 Familie und DNA-Methyltransferase-3A (Dnmt3a) mit Magenkrebs (GC) in Verbindung gebracht. Während Beweise dann steigenden miR-29b /c konnte die DNA-Methylierung durch gezielte Dnmt3a regulieren, ist es derzeit nicht bekannt, ob epigenetische Silencing von miR-29b /c über Promotor-Hypermethylierung in GC durch abnormale Expression Dnmt3a verursacht wird. So wollten wir zu beurteilen, ob ein Übersprechen Regelung besteht zwischen miR-29b /c und Dnmt3a und ob sie mit einem bösartigen Phänotyp in GC verbunden ist. Zunächst ergab die Wundheilung und die Transwell-Assays, dass miR-29b /c Tumormetastasierung in GC unterdrückt. Ein Luciferase-Reportertest zeigte, dass Dnmt3a ein direktes Ziel von miR-29b /c ist. Wir verwendeten Bisulfit genomische Sequenzierung der DNA-Methylierungsstatus von miR-29b /c zu analysieren. Der Prozentsatz der methylierten CpG wurde signifikant verringert in DNMT3a abgereicherten Zellen im Vergleich zu den Kontrollen. Darüber hinaus wurde die Beteiligung von DNMT3a bei der Förderung der Zellmigration GC mit dem Promotor-Methylierung vermittelte Repression der CDH1 verbunden. In 50 gepaart klinischen Proben GC Gewebe, verringert miR-29b /c signifikant mit dem Grad der Differenzierung und der Invasion der Zellen korreliert und negativ mit Dnmt3a Ausdruck korreliert. Gemeinsam schlagen unsere vorläufigen Ergebnisse, dass der folgende Prozess in GC tumorigenesis beteiligt sein können. miR-29b /c unterdrückt die nachgeschalteten Gens DNMT3a und wiederum miR-29b /c wird durch DNMT3a in einem DNA-Methylierungsabhängiger Weise unterdrückt. Die de-Regelung beider miR-29b /c und DNMT3a führt zur epigenetischen Silencing CDH1 und trägt zur Metastasierung Phänotyp in GC. Dieser Befund zeigt, dass die DNA-Methylierung-assoziierten Silencing von miR-29b /c für die GC-Entwicklung kritisch ist und somit ein therapeutisches Ziel sein kann

Citation:. Cui H, Wang L, Gong P, Zhao C, Zhang S , Zhang K, et al. (2015) Deregulation zwischen miR-29b /c und Dnmt3a mit epigenetische Silencing des CDH1 Gen assoziiert, Affecting Zellmigration und Invasion in Magenkrebs. PLoS ONE 10 (4): e0123926. doi: 10.1371 /journal.pone.0123926

Academic Editor: Rajeev Samant, University of Alabama in Birmingham, Vereinigte Staaten

Empfangen: 4. September 2014; Akzeptiert: 9. März 2015; Veröffentlicht: 15. April 2015

Copyright: © 2015 Cui et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorgesehen sind der ursprüngliche Autor und Quelle genannt

Datenverfügbarkeit: Alle relevanten Daten sind innerhalb des Papiers und seiner Hintergrundinformationen Dateien

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Erteilungsnummer 81171915, Nr 91229107 und Nr 81472548), http unterstützt wurde: //www .nsfc.gov.cn /. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs (GC) ist die zweithäufigste tödliche weltweit Malignität. Auf sie entfallen insgesamt rund 1 Million neue Fälle und 0,7 Millionen Todesfälle jährlich, über 70% davon in Entwicklungsländern auftreten, vor allem in den ostasiatischen Ländern [1]. Obwohl heilbar, wenn sie früh erkannt, sind die meisten GC Patienten mit späten Stadium der Erkrankung diagnostiziert. Bei Patienten mit operablen Krankheit sind herkömmliche Chirurgie und Kombination Chemotherapien angegeben. Jedoch ist die gesamte 5-Jahres-Überlebensrate von Patienten GC weniger als 30% [1, 2]. Bemerkenswert ist, wird GC häufig durch peritoneale Verbreitung und Metastasierung in die regionalen Lymphknoten und andere Organe durch lymphatischen und venösen Gefäße [3] begleitet. Somit können molekulare Aberrationen in GC Identifizierung verbessern unser Verständnis von Magen-Krebsentstehung und uns helfen, Patienten in biologisch und klinisch relevante Untergruppen unterteilen, sowie neue therapeutische Strategien zu entwickeln.

MicroRNAs (miRNAs) sind eine Klasse von endogenen, Hemmung der Übersetzung oder zur Induktion von mRNA-Abbau durch Basenpaarung mit der untranslatierten Region (3'UTR) von Ziel Boten-RNAs (mRNAs) [4] "3 kleine, nicht-kodierenden regulatorischen RNAs von etwa 20 bis 25 Nukleotiden, die sich negativ durch die Genexpression regulieren. Veränderte Expression von miRNAs wurden in vielen Krebsarten und führen in aberranten Expression von Zielgenen berichtet, dass bösartige Verhalten beeinflussen, wie Proliferation, Resistenz gegen Apoptose und Metastasierung [5-7]. Zunehmende Beweise zeigen, dass deregulierte miRNAs (zB miR-17, miR-129, miR-148a und miR-378) zu Magen-Krebsentstehung beitragen [8-10], die darauf hindeuten, dass miRNAs als diagnostische und prognostische Biomarker in GC verwendet werden könnten, .

Die eine konservierte Familie von miRNAs ist miR-29 Familie (miR-29), die miR-29a /b /c enthält. Verminderte Expression von miR-29s hat in mehreren Krebsarten beschrieben, einschließlich GC [11-14]. Frühere Studien zeigen, dass miR-29s eine dominierende Rolle in der GC-Zellproliferation spielen, Zellzyklus, Apoptose und Zellbeweglichkeit [14, 15]. Mögliche Ziele von miR-29s zum malignen GC-Phänotyp beitragen, umfassen Cdc42, CCND2 und MMP2 [14, 15]. Darüber hinaus haben einige Studien miR-29s als Mitwirkende an der Regulation der DNA-Methylierung identifiziert durch DNMT3s bei Lungenkrebs [13] Targeting. Weiterhin mehrere Zielgene, wie TCL-1, CDK6, Laminin-1, und MCL-1, wurden auch in anderen Krebs [16] berichtet. Bemerkenswert ist, trotz des Beweises miRNA-29s demonstrieren können als Tumor-Suppressor-Gene funktionieren, eine Schlüsselfrage im Zusammenhang mit miRNA-29s Ausdruck bleiben teilweise noch ungelöst. Was sind die Mechanismen der Kontrolle von miRNA-29s-Expression in GC-Zellen? Es wurde berichtet, dass c-Myc in miR-29a /b Repression beteiligt ist [17]. Identifizieren von Mechanismen zusätzliche Unterdrückung von Interesse ist.

Es ist bekannt, dass die Transkriptions Silencing von Tumor-Suppressor-Gene (gtS) durch CpG-Insel-Hyper ein gemeinsames Markenzeichen der Karzinogenese ist. Interessanterweise ähnlich der Protein-kodierenden TSGs werden eine beträchtliche Anzahl von miRNAs durch Promotor-Methylierung reguliert [18-20]. Tatsächlich hat es zeigt eine wachsende Zahl von Studien, die Tumorsuppressor-miRNAs wie miR-34b, miR-129 und miR-124, werden häufig durch DNA-Methylierung in GC stumm [21-23]. Basierend auf der CpG-Insel Searcher Programmanalyse zeigten unsere Vorhersage, dass miRNA-29b /c enthält CpG-Inseln in ihren mutmaßlichen Promotorregionen. Es ist jedoch noch nicht klar, ob anomale DNA-Hypermethylierung für die Dysregulation von miR-29b /c-Konten. Darüber hinaus ist es nicht bekannt, ob eine Rückkopplungsregelung besteht zwischen miR-29b /c und DNMT3s. In der Tat hat keine frühere Studie der Methylierungsstatus von miR-29b /c in GC-Zellen untersucht, und keiner haben die Beziehung zwischen der Methylierung von miR-29b /c und die Höhe der Expression von DNMT3s sucht. In dieser Studie haben wir festgestellt, dass miR-29b /c die Expression von Dnmt3a, indem sie auf ihre 3'UTR unterdrückt, was die Hemmung GC Zellmigration und Invasion beigetragen. Auf der anderen Seite, Dnmt3a herunterreguliert miR-29b /c über anomale Hypermethylierung des Promotors. Somit besteht ein Potentialrückkopplungsschleife zwischen miR-29b /c und DNMT3a, in dem die Herunterregulierung von miR-29b /c die Unterdrückung von DNMT3a abschafft. Inzwischen wirkt sich auf die Hochregulation der Dnmt3a die Expression von miR-29b /c durch Promotor-Methylierung. Diese Ergebnisse legen nahe, ein Übersprechen zwischen miR-29b /c und Dnmt3a. Ihre Ungleichgewicht und Deregulierung ist Ursache durch einen epigenetischen Mechanismus, der in GC Zellmigration und Invasion Eigenschaften beteiligt sein können.

Materialien und Methoden

Zellkultur

GC-Zelllinien, einschließlich AGS und BGC-823 wurden von der Zellbank der chinesischen Akademie der Wissenschaften und gehalten in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (Invitrogen, Carlsbad, CA), 100 U /ml Penicillin und 100 mg /ml Streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA) in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO _{2 -Atmosphäre bei 37 ° C.}

Gewebeproben

50 Paare von GC Geweben und ihren benachbarten nicht-Krebsgewebeproben wurden zwischen 2011 und 2013 aus dem Jiangning Krankenhaus von Nanjing gesammelt. Die klinische Information der Patienten mit GC wird in S1 Tabelle gezeigt. Die Studie wurde vom Ausschuss für ethische Überprüfung der Forschung an der Jiangning Krankenhaus von Nanjing in China genehmigt, und die Patienten Einverständniserklärungen unterzeichnet. Alle Gewebeproben wurden von Patienten mit GC erhalten. Sie wurden während der Operation gesammelt und sofort in flüssigem Stickstoff bis zur RNA und Proteinextraktion schockgefroren.

Reverse-Transkriptase-Reaktion und quantitative real-time PCR (qPCR)

Gesamt-RNA wurde aus den Zellen extrahiert und Gewebe geerntet unter Verwendung von Trizol-Reagenz (Invitrogen, Carlsbad, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers.

um miRNA-Expression, eine Stem-Loop-RT-PCR wurde durchgeführt, erkennen, wie vorher [24] beschrieben, und U6 kleinen RNAs waren als interne Kontrolle verwendet. qPCR wurde mit SYBR Premix Ex Taq (Takara, Dalian, China) erfolgt nach dem Protokoll des Herstellers. Die relative Expression wurde durch das Vergleichs CT-Methode bewertet. Die Primersequenzen jedes Gens sind in S2 Tabelle gezeigt.

Western blot

Western-Blots wurden unter Verwendung von anti-DNMT3a (Abcam, Cambridge, UK) durchgeführt, anti-CDH1 (Abcam, Cambridge, UK), Anti-Vimentin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) und anti- β
Actin-Antikörper (Sigma, Ronkonkoma, NY, USA), und der Nachweis wurde mit super-Signal Chemolumineszenzsubstrats durchgeführt (Pierce, Rockford, IL, USA).

Transfection

miR-29b /c ahmt /Inhibitoren und negative Kontrollmoleküle (Scramble-Steuer Mimik und Inhibitor) wurden synthetisiert und gereinigt durch die Firma Genepharma (Shanghai, China). Die Sequenzen werden in S2 Tabelle gezeigt. Sie wurden bei einer Endkonzentration von 50 nM in die Zellen transfiziert unter Verwendung von Lipofectamin 2000 Transfektionsreagens (Invitrogen, Carlsbad, USA) nach dem Protokoll des Herstellers. Das Medium wurde nach 6 Stunden verändert. Die Zellen wurden 48 Stunden lang kultiviert und für die Analyse geerntet. Die prozentuale Transfektionseffizienz wurde durch eine Auswertung des Ausmaßes der miR-29b /c-Expression oder Knockdown folgenden Transfektionen (S1A und S1B Abb) ermittelt. Das Protokoll für die Gründung der Dnmt3a stabilen Knockdown Zellen wurde in unserer früheren Arbeit [25] beschrieben. Die Expression von Dnmt3a verringerte sich in den BGC-shDNTM3A und AGS-shDNTM3A Zellen (S1C Abb) im Vergleich zu den Kontrollzellen.

Die Wundheilung, Migration und Invasion Assays

Zell Mobilität unterworfen wurde der Wundheilungsassayanalyse, wie zuvor beschrieben [26]. Ein Kratzer Wunde wurde eine 200 ul Pipettenspitze auf die konfluenten Zellmonolayern in Platten mit sechs Vertiefungen erzeugt. Die Zellen wurden dann mit frischem Medium gewaschen schwimmenden Zellen zu entfernen, und die Ausbreitung der Wundverschluss wurde nach 48 Stunden und fotografiert unter einem Mikroskop beobachtet. Das Potenzial für die Migration und Invasion der transfizierten Zellen wurden durch eine Transwell-Assay ausgewertet. Die Zellen wurden mit den miR-29b /c nachahmt oder Kontrolle imitiert, und miR-29b /c-Inhibitor oder Kontrolle Inhibitor für 24 Stunden auf 70% Konfluenz und transfiziert gewachsen. Im Migrationsassay wurden die Zellen in 200 ml Medium mit 1% fötalem Rinderserum in der oberen Kammer eines nicht beschichteten Transwell-Einsatzes. In der unteren Kammer, 600 ml Medium mit 10% fötalem Rinderserum wurde als chemische Lockstoffe verwendet Zellmigration zu fördern. In der Invasion Test wurden die obere Kammer der Transwell-Einsätze mit 50 ml 1,0 mg /ml Matrigel beschichtet, und die Zellen wurden in der oberen Kammer des Matrigel-beschichteten Transwell-Einsatz (Millipore, USA) plattiert. Nach 24 Stunden Inkubation wurden die nicht-migrierenden oder nicht-eindringenden Zellen vorsichtig mit einem Wattestäbchen entfernt. Alle Zellen wurden in 5 Felder unter einem umgekehrten Mikroskop unter Verwendung von 0,1% Kristallviolett-Färbung und gezählt gefärbt. Die unabhängigen Experimente wurden dreimal wiederholt.

Bisulfite genomische Sequenzierung (BGS)

Genomische DNA wurde aus den Zellen extrahiert, um das Phenol-Chloroform-Methode. Bisulfit-Behandlung wurde durch die CpGenome Universal-DNA Modification Kit (Millipore, USA) nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. PCR-Produkte für Bisulfit-Sequenzierung wurden gelgereinigt und subkloniert in einen pMD19-T-Vektor-System (Takara, Dalian, China). Mindestens zehn Kolonien wurden sequenziert, um den Grad der Methylierung an jeder CpG-zu beurteilen. Die Primer werden in S2 Tabelle aufgeführt.

Luziferase-Reporter-Assay

Das Protokoll für die Luciferase-Reporterassay zuvor beschrieben worden ist [14]. Die 3'-UTR des menschlichen DNMT3a wurde PCR-amplifiziert und zwischen die Not I und Xba I-Stellen von pGL-3 (Promega, USA) einkloniert. Die BGC-823-Zellen wurden in einer 12-Well-Platte pro Vertiefung in einer Dichte von 5 x 10 ^{5 überzogen vor den Transfektionen. Die Zellen wurden mit pGL-3-Glühwürmchen-Luciferase-Reporter transfiziert (1 ug pro Vertiefung), pRL-TK (50 ng pro Vertiefung) und miR-29 nachahmt /Inhibitor (50 nM) oder negative Kontrolle nachahmt /Inhibitoren (50 nM) unter Verwendung Lipofectamine- 2000 Transfektionsreagenz (Invitrogen, Carlsbad, USA) nach dem Protokoll des Herstellers. Luciferase-Aktivität wurde 48 Stunden nach der Transfektion unter Verwendung des Dual-Luciferase-Aktivitäts-Assay-System (Promega, USA) getestet. Alle Versuche wurden drei unabhängige Bestimmungen durchgeführt.}

Die statistische Analyse

Die unabhängige Student t
-Test verwendet wurde, um die Ergebnisse zu vergleichen, die als Mittelwert ± ausgedrückt werden sd zwischen zwei vorgewählten Gruppen. Um zu bestimmen, Korrelationen zwischen den Variablen, Pearson
's Korrelationskoeffizient berechnet. A P
-Wert von weniger als 0,05 galt als statistisch signifikant.

Ergebnisse |

miR-29b /c ist erforderlich und ausreichend für die GC-Zellmigration

Frühere Studien implizieren, dass miR-29b /c für die GC-Zellinvasion kritisch ist. Um zu bewerten, ob miR-29b /c für die GC-Zellmigration verantwortlich ist, wurden eine In-vitro-
Kratzwundheilungs Assay und Transwell-Test durchgeführt. Nach dem übergangsweise die miR-29b /c nachahmt oder Negativkontrolle in die BGC-823 Zellen transfizieren, der Wundheilungs Test zeigte, dass die Zellen mit dem erzwungenen Expression von miR-29b /c eine deutlich langsamere Erholung im Vergleich zu den Kontrollzellen angezeigt (Abb 1A). In ähnlicher Weise zeigte die Transwell-Migrationstest, dass die Überexpression von miR-29b /c mit deutlich weniger Migration als die Kontrollen verbunden war ( P
< 0,05, 1B). Darüber hinaus im Einklang mit anderen Daten in HGC-207 und MGC-803 GC-Zellen [14], die miR-29b /c Überexpression Zellen zeigten auch eine deutliche Reduzierung der invasiven Fähigkeit, in der Matrigel Invasion Assays ( P
< 0,05, 1C). Diese Ergebnisse legen nahe, dass miR-29b /c ist nicht nur wichtig für die GC-Zellinvasion, sondern auch für die Zellmigration. Um die unterdrückende Wirkung von miR-29b /c auf GC Zellmigration und Invasion zu bestätigen, wurden die BGC-823-Zellen mit den miR-29b /c-Inhibitoren oder eine negative Kontrolle transient. Die Streichung von miR-29b /c deutlich stärker auf die Migrations-und invasive Fähigkeiten der GC-Zellen, die durch die Wundheilung (1D) und einem Transwell-Assay ( beurteilt P
< 0,05, 1E und Fig 1F). Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass miR-29b /C effektiv GC Zellmigration und Invasion aufgehoben, die daher zu den frühen Stadien der malignen Progression von GC bei.

DNMT3a eine direkte Transkriptions Ziel von miR-29b /c in GC

, um den Mechanismus zu verstehen, die Wirkung von miR-29b /c auf die Zellmigration und Invasion zugrunde liegen, können wir die Ziele von miR-29b /c untersucht. Dnmt3a 3'UTR ist komplementär zu miR-29b /c und ist ein direktes Zielgen von miR-29b /c, so haben wir eine Reporter-Assay in BGC-823-Zellen aus. Die DNMT3a mRNA 3'UTR wurde in den stromabwärtigen Bereich eines Luciferase-Reporter-Gen aus dem pGL-3-Vektor (nämlich DNMT3a 3'UTR-Luc) eingesetzt ist. Die Konstrukte wurden dann mit pRL-TK und die miR-29b /c nachahmt oder die negative Kontrolle ahmt in die BGC-823-Zellen cotransfiziert. Wie in 2A gezeigt, wurde die relative Luciferase-Aktivität signifikant in den pGL-3-Vektoren mit der DNMT3a 3'UTR reduziert werden ( P
< 0,05). Allerdings wirken sich die Konstrukte mit der miR-29b /c-Inhibitor cotransfiziert nicht die Luciferase-Aktivität der pGL-3-Vektoren mit der DNMT3a 3'UTR Vergleich zu den Konstrukten mit dem negativen Kontroll Inhibitor (2B) cotransfiziert. Um diese miRNA-Target-Wechselwirkung zu validieren, quantitative RT-PCR (qRT-PCR) und Western-Blots wurden durchgeführt, die Regulierung der Dnmt3a von miR-29b /c zu bestätigen. Wir transient transfizierten die miR-29b /c nachahmt oder negative Kontrolle ahmt in die BGC-823-Zellen. Die erhöhte miR-29b /c reduzierte die Dnmt3a-Expression auf der mRNA (2C) und Protein-Ebene (Abb 2E, lane1-3). Im Gegensatz dazu stieg die miR-29b /c Herunterregulierung durch sein Inhibitor der Dnmt3a-Expression auf der mRNA (Abb 2D) und Protein-Ebene (Abb 2E, lane4-6). Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass Dnmt3a eine direkte Transkriptionsziel von miR-29b /c ist und negativ mit miR-29b /c-Expression in GC-Zellen.

miR-29b /c durch Dnmt3a unterdrückt in einem verbunden ist DNA-Methylierung abhängig

Da die anomale Hyper kritisch ist für miRNA Down-Regulation, folgerten wir, dass negative Rückkopplung besteht zwischen miR-29b /c und Dnmt3a. Um diese Hypothese zu testen, die Anwesenheit von CpG-Insel-Methylierung in der miR-29b /c-Promotorregion wurde durch eine BGS-Analyse in den DNMT3a-Knockdown-Zellen bewertet. Wie in 3A gezeigt, 7 einzelne CpG-Stellen innerhalb der Inselregionen CpG (5 kb stromaufwärts von miR-29b /c) wurden methylierte Cytosin-Reste zu identifizieren, sequenziert. Die Häufigkeit der miR-29b /c-Promotor-Methylierung in Dnmt3a-Zellen betrug 34,2 Knockdown%, was deutlich niedriger als die Kontrollzellen war (58,6%; 3B). Dieses Ergebnis zeigt, dass die transkriptionelle Silencing von miR-29b /c in GC-Zellen mit der Anwesenheit von CpG island hypermethylation zugeordnet ist, die durch Messung mature miR-29b /c durch qRT-PCR bestätigt wurde. Es wurde deutlich miR-29b /c-Expression in den AGS-shDNMT3A und BGC-shDNMT3A Zellen erhöhte sich im Vergleich mit ihren Kontrollen (3C). Diese Ergebnisse zeigen eine wichtige molekulare Grundlage für miR29-b /c Herunterregulierung und unterstützen die Hypothese, dass es ein Übersprechen zwischen miR-29b /c und Dnmt3a.

Dnmt3a fördert GC Zellmigration

die molekulare Verbindung zwischen miR-29b /c und Dnmt3a die Frage aufgeworfen, Dnmt3a Beteiligung an GC Zellmigration. Wir weiter angewendet In-vitro-Assays
die funktionellen Veränderungen im Zellverhalten folgende veränderte Expression von Dnmt3a zu bestimmen. Der Wundheilungs Test zeigte eine deutlich langsamere Erholung der BGC-shDNMT3A Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen (4A, oben), aber nur eine bescheidene Erholung in den AGS-shDNMT3A Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen (4A, unten). Diese Ergebnisse zeigen, dass Dnmt3a für Zellmobilität wichtig ist. Da Zelladhäsionsmoleküle sind wichtig für die Zellbeweglichkeit, die Expression von CDH1 und Vimentin wurden von qRT-PCR und Western-Blot untersucht. Knockdown von DNMT3a Expression signifikant erhöht die CDH1 Expression an den beiden mRNA und Protein-Ebene, aber keinen bemerkenswerten Effekt auf die Expression von Vimentin (4B und 4C) haben, was darauf hindeutet, dass CDH1 ein Ziel von DNMT3a vermittelte Dysregulation der Zelle sein kann, Beweglichkeit zu verbessern. Darüber hinaus führten wir in den Dnmt3a-Zellen, die einen Knockdown BGS-Test auf dem CDH1 Gen aus. Wie in 4D gezeigt, war der Prozentsatz der methylierten CpGs innerhalb CDH1 niedriger angeordnet in der DNMT3a abgereicherten Zellen als in den Kontrollzellen (35,8% vs. 94,1%). Diese Ergebnisse zeigen, dass die abnormale Expression Dnmt3a führt zu einer epigenetische Silencing CDH1.

miR-29b /c ist bei der Unterdrückung der CDH1
beteiligt

weiter Um die Wirkung der veränderten Mir- untersuchen 29b /c Ausdruck auf CDH1, transfizierten wir transient die miR-29b /c nachahmt oder negative Kontrolle nachahmen in BGC-823-Zellen. Verglichen mit den Kontrollen, die erzwungene Expression von miR-29b /C erhöht signifikant die Expression von CDH1 sowohl auf der mRNA- und Proteinebene (4E und 4F). Anschließend wurde der Methylierungsstatus der Promotorregion von CDH1 untersucht unter Verwendung eines BGS-Test in der miR-29b /c nachahmt oder negative Kontrolle nachahmen BGC-823-Zellen transient. Die Ergebnisse zeigten, dass die Häufigkeit von CDH1-Promotor-Methylierung in der miR-29b /c Überexpression Zellen betrug 5,2% bzw. 12,9%, was gemessen in den Kontrollzellen signifikant niedriger ist als das Niveau war (88,2%; Abb 4G). Diese Daten waren konsistent mit dem Ergebnis, dass DNMT3a Zuschlags die Hochregulierung von CDH1 vermittelt und zeigt, daß die de-Regulation von miR-29b /c und DNMT3a sind in GC Zellmigration und Invasion beteiligt.

Verminderte Expression von miR-29b und miR-29c in GC Gewebe

Die Expression von miR-29b /c in 50 GC Tumoren und gepaart nicht-Tumorgewebe durch qRT-PCR untersucht. Im Vergleich zu den nicht-Tumorgeweben zusammengepaßt, die Häufigkeit von miR-29b, miR-29c und Herunterregulierung (definiert als mehr als zweifache Abnahme) betrug 66% (33/50) und 60% (30/50), jeweils (5A und 5B). Die durchschnittliche fache Änderung von miR-29b und miR-29c war signifikant niedriger in den Tumorgeweben als in den Nicht-Tumorgewebe ( P
< 0,01, 5C und 5D). Um die klinisch-pathologischen Bedeutung der miR-29b und miR-29c-Expressionsmuster in GC tumorigenesis, die klinischen Merkmale der GC-Patienten wurden erforschen analysiert. Alle 43 Patienten untersucht wurden in zwei Gruppen kategorisiert nach miR-29b, miR-29c und die Expressionsniveaus. Verminderte miR-29b stark mit dem Grad der Tumorzelldifferenzierung und Invasion korreliert, während miR-29c verringert nur mit der Tumor-Invasion (Tabelle 1) korreliert. Ferner wurde die Beziehung zwischen miR-29b /c-Expression und DNMT3a Expression in 33 Fällen GC getestet. Eine Assoziationsstudie zeigte, dass Dnmt3a Ausdruck negativ mit miR-29b ( R
= -0,640, P
< 0,01, 5E) korreliert und miR-29c ( R
= -0,349, P
< 0,05, 5F). Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass miR-29b /c könnte eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der Magen-Krebsentstehung spielen.

Diskussion

Die konservierte miR-29-Familie, einschließlich miR-29a, Mir- 29b und miR-29c, wird in mehreren Keller Prozesse wie Proliferation, Differenzierung, Apoptose und Metastasierung, so dass sie eine gut analysiert Familie von miRNAs in tumorigenesis machen [16]. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Expression von miR-29a erhöht wird mit einer besseren Gesamtüberlebensrate im Stadium II Darmkrebspatienten [27] und den unteren Ebenen der miR-29b verbunden sind, könnten durch die Regelung epithelial-mesenchymale Transition Signalwege [28] Prostatakrebs Metastasierung fördern . Darüber hinaus miR-29c fungiert als Metastasierung Suppressor, die Lungenkrebs Zelladhäsion an die extrazelluläre Matrix und Migration In-vitro-
und in vivo
[29] hemmt. Im GC deutlich Niveaus von miR-29b reduziert und miR-29c, insbesondere, haben im Vergleich zu miR-29a beobachtet worden [14], was darauf hindeutet, dass miR-29b /c eine wichtigere Rolle spielen. So miR-29b /c wurde zur Analyse in dieser Studie ausgewählt. In der vorliegenden Studie haben wir gezeigt, eine erhöhte miR-29b /c, um die Migration und Invasion von BGC-823-Zellen unter Verwendung eines Wundheilungstest und einen Test Transwell unterdrückt. Diese Ergebnisse sind konsistent mit anderen berichteten Daten, erhalten von SGC-7901, HGC-27 und MGC-803 GC Zellen [14, 15]. Da die miR-29b /c auch Rollen in Proliferation und Apoptose in GC spielen, untersuchten wir die Fähigkeit des Zellwachstums und die Höhe der Zell-Apoptose in BGC-823-Zellen. Die Ergebnisse zeigten, dass es keinen Unterschied in der Proliferation bei 48 Stunden für miR-29b /c-Mimetika oder Inhibitoren-transfizierten Zellen im Vergleich zu den negativen Kontrollzellen ( P
> 0,05, S2A und S2B Bild). Darüber hinaus zeigte Annexin-V-Färbung keine dramatischen Anstieg in der Höhe von Apoptose in den miR-29b /c-Mimetika-transfizierten Zellen nach 48 Stunden Inkubation (S2C) Abb. Darüber hinaus zeigte die Zellzyklus-Analyse keine signifikanten Unterschiede in G1, S, G2 /M-Phase nach der Behandlung mit den miR-29b /c nachahmt oder negative Kontrolle ahmt 48 Stunden ( P
> 0,05, S2D Feige). Diese Daten legen nahe, dass miR-29b /c-Bereich Erholung nach 48 Stunden gewickelt verlangsamt vor allem wegen der verringerten Zellmotilität Fähigkeiten.

miRNAs ihre Funktionen ausüben, vor allem durch die 3'UTRs verschiedener Gene Targeting. Allerdings sind die detaillierten molekularen Mechanismen der miR-29b /c im Zusammenhang mit malignen GC Entwicklung kaum verstanden. Bemerkenswert ist, miR-29b /c teilt die gleiche Komplementarität zu Standorten in der 3'UTR von Dnmt3a, die durch Ziel Prädiktionsprogrammen einschließlich TargetScan, Miranda und miRBase vorhergesagt wurde. Es ist noch nicht bekannt, ob miR-29b /c die abnormale Methylierung von Genen im Zusammenhang mit Metastasierung reguliert, indem sie mit DNMT3a während der Entwicklung von GC interagiert. Daher führten wir eine Luciferase-Reporter-Assay und gefunden, dass ein hoher DNMT3a Ausdruck mit geringer miR-29b /c-Expression in GC-Zellen assoziiert war, was anzeigt, DNMT3a ist eine direkte Transkriptions Ziel von miR-29b /c. die molekulare Basis jedoch, dass das Ungleichgewicht von miR-29b führt /c in GC bleibt unbekannt. miR-29 proximalen Promotoren haben Bindungsstellen für verschiedene Transkriptionsfaktoren, wie c-Myc und CEBPA, die auf die Deregulierung der miR-29s beitragen [30, 31]. Die Forschung an der epigenetischen Regulation von miRNA-29s wurde nicht berichtet.

In eukaryotischen Zellen gibt es drei enzymatisch aktive DNA-Methyltransferasen (DNMTs), DNMT1, Dnmt3a und DNMT3B. Die Expression von DNMT3a in GC ist deutlich höher als die von DNMT3B [32, 33]. Außerdem wird nur erhöht Dnmt3a Expression signifikant mit einem kürzeren krankheitsfreien Überlebenszeit in der GC [34] zugeordnet, die Dnmt3a spielt mehr eine wichtige Rolle in der Karzinogenese des Magens zeigt. So wollten wir untersuchen, ob die negative Feedback-Regelungen bestehen zwischen miR-29b /c und Dnmt3a. In dieser Studie verwendeten wir eine BGS-Test der DNA-Methylierungsstatus von miR-29b /c in Dnmt3a RNAi GC-Zellen zu analysieren. Tatsächlich war die verringerte miR-29b /c teilweise aufgrund DNMT3a vermittelten hypermethylation. Darüber hinaus konnten wir bestätigen, dass Dnmt3a bei der Förderung der GC Zellmigration über abregelnd CDH1 beteiligt ist. Inzwischen haben wir auch gezeigt, dass miR-29b /c in der Unterdrückung von CDH1 beteiligt ist. Ein Kennzeichen von Krebsmetastasen ist der Verlust der CDH1 expression [35] und hypermethylation innerhalb des CDH1 Promotorregion wird ebenfalls in GC beobachtet [36]. Somit zeigen unsere Ergebnisse, dass sowohl miR-29b /c und Dnmt3a sind mit CDH1 assoziiert Down-Regulation durch Dnmt3a-vermittelten Promotor-Hypermethylierung. Die Rolle der anderen DMNTs, beispielsweise DNMT3B, bei der Regulierung der miR-29b /c muss in zukünftigen Studien untersucht werden.

GC In Proben, wir die Expressionsmuster von miR-29b /c untersucht in 50 Paare von GC Gewebe. Verminderte miR-29b /c (zerlegbare Änderung Cutoff: 2,0) wurde signifikant mit der Differenzierung und Invasion Grad in GC, korreliert was darauf schließen lässt, dass miR-29b /c eine kritische Rolle bei GC maligne Wartung spielt und zeigt direkt die klinische Bedeutung von miR -29b /c in GC Progression. Zusammenfassend zeigt unsere Studie, dass es ein Übersprechen zwischen miR-29b /c und Dnmt3a kann. Ein Ungleichgewicht dieser Faktoren kann in GC Migration und Invasion Phänotypen beteiligt. Dieses Ungleichgewicht kann Low-Level-Expression von miR-29b /c konnte Unterdrückung von Dnmt3a und ein hohes Maß an Dnmt3a weiter wirkt sich auf die Expression von miR-29b /c durch einen epigenetischen Mechanismus abschaffen. Diese Erkenntnisse können für die Entwicklung neuer Behandlungsmöglichkeiten für GC, das Ziel miR-29b /c und seine nachgelagerten Gen Dnmt3a von Vorteil sein.

Hintergrundinformationen
S1 Abb. Der Prozentsatz Transfektionseffizienz wurde durch Auswertung der Niveaus der miR-29b /c oder DNMT3a vorgesehen.
(A und B) qRT-PCR wurde durchgeführt, um die relative Expression von miR-29b /c in BGC-823 Zellen mit Mimetika zu erfassen (A) oder Inhibitoren (B) nach 48 Stunden der Transfektion. (C) RT-PCR und Western-Blots wurden durchgeführt, um die Effizienz von DNMT3a Zuschlags in BGC und AGS-Zellen zu detektieren. β
Actin wurde als Ladekontrolle verwendet
doi:. 10.1371 /journal.pone.0123926.s001
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S2 Abb. Die Rolle von miR-29b /c in der BGC-823 Zellen, Proliferation, Apoptose und Zellzyklus.
(A) die Zellwachstumsraten von miR-29b /c-Überexpression wurden durch CCK-8 Proliferationstest nachgewiesen. miR-29b /c Überexpression zeigten keine bemerkenswerten Unterschied bei 48 Stunden im Vergleich zu negativen Kontrollzellen ( P
> 0,05). (B) die Zellwachstumsraten von miR-29b /c-Hemmung wurden durch CCK-8 Proliferationstest nachgewiesen. Die Unterdrückung von miR-29b /c zeigten sich keine signifikanten Änderungen bei 48 Stunden im Vergleich zu negativen Kontrollzellen ( P
> 0,05). (C) Apoptosis Assay keine dramatische Induktion der Apoptose von miR-29b /c-Überexpression bei 48 Stunden im Vergleich zu negativen Kontrollzellen zeigt. Die bi-parametrischen Histogramm zeigt Zelle in der frühen (unten rechts Quadrant) und die späten apoptotischen Staaten (oberen rechten Quadranten). (D) Der Zellzyklus-Test wurde mittels Durchflusszytometrie auf BGC-823-Zellen nach der miR-29b /c nachahmt oder negative Kontrolle ahmt die Behandlung über 48 Stunden durchgeführt. Der prozentuale Anteil der miR-29b /c Überexpression oder Kontrollzellen in der G1, S und G2 /M sind im Balkendiagramm als Mittelwert ± S.D gezeigt. von drei unabhängigen Experimenten. Verglichen mit Kontrollzellen gab es keine signifikante Wirkung auf den Zellzyklus nach der miR-29b /c-Überexpression
doi:. 10.1371 /journal.pone.0123926.s002
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S1 Methode. Das Zellwachstum und Apoptose-Assay
doi:. 10.1371 /journal.pone.0123926.s003
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S2 Methode. . Zellzyklus-Test
doi: 10.1371 /journal.pone.0123926.s004
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S1 Tabelle. Klinische Merkmale von Patienten mit Magenkrebs
doi:. 10.1371 /journal.pone.0123926.s005
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S2 Tabelle. . MiRNA Mimik und Inhibitor-Sequenzen und in dieser Studie verwendeten Primer
doi: 10.1371 /journal.pone.0123926.s006
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Acknowledgments

Wir danken Dr. Gang Chen von der Nanjing Jiangning Krankenhaus für die Proben zu sammeln. Wir danken Prof. Sheng Zhong von Capital Medical Universität zu helfen, das Manuskript zu ändern.

• PLoS ONE: Chrysin Hemmt Tumor-Promotor-induzierte MMP-9-Expression durch Blockieren von AP-1 über Unterdrückung von ERK und JNK Pathways in Magenkarzinomzellen
• PLoS ONE: Wirkung der Eradikation von Helicobacter pylori auf Expression von FHIT, IL-8 und P73 in der Magenschleimhaut von Verwandten ersten Grades von Patienten mit Magenkrebs