PLoS ONE: Expression Profilieren von Stem Cell bezogener Gene, in Neoadjuvant-behandelten Magenkrebs: Eine NOTCH2, GSK3B und Gene Signature β-Catenin Predicts Survival

Abstrakt

Krebsstammzellen (CSC) basierte Genexpressionssignaturen in verschiedenen Tumortypen sind mit der Prognose assoziiert und KSZ vorgeschlagen besonders Medikament resistent. Das Ziel unserer Studie war es zunächst, die prognostische Bedeutung von CSC-verbundene Genexpression in Resttumorzellen von neoadjuvant behandelten Magenkrebs (GC) der Patienten zu bestimmen. Zweitens wollten wir untersuchen, ob die Expression Veränderungen zwischen prä- und posttherapeutischen Tumorproben vorhanden sind, im Einklang mit einer Anreicherung von arzneimittelresistenten Tumorzellen. Die Expression von 44 Genen, wurde in 63 Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten Tumorproben mit teilweisem Tumorregression (10-50% Resttumor) nach neoadjuvanter Chemotherapie durch quantitative Echtzeit-PCR mit niedriger Dichte Arrays analysiert. Eine Unterschrift des kombinierten GSK3B
^{hoch, β-Catenin (CTNNB1)
hoch und NOTCH2
geringe Expression war stark mit besser korreliert das Überleben der Patienten (p < 0,001). Eine prognostische Relevanz dieser Gene auch öffentlich verfügbaren Genexpressionsdaten gefunden wurde, zu analysieren. Die Expression von 9 Genen wurde zwischen prätherapeutische Biopsien und posttherapeutischen reseziert Proben verglichen. Eine signifikante posttherapeutischen Anstieg in NOTCH
2, LGR5
und Pou5f1
Expression in Tumoren mit verschiedenen Tumorregression Typen gefunden wurde. Keine wesentlichen Änderungen wurden für GSK3B
beobachtet und CTNNB1
. Immunohistochemische Analyse zeigte eine chemotherapie damit verbundenen Erhöhung der Intensität der Färbung NOTCH2, aber nicht in dem Prozentsatz der NOTCH2. Zusammengenommen die GSK3B, CTNNB1
und NOTCH2
Ausdruck Signatur ist ein Roman, für die GC-prognostische Parameter viel versprechend. Die Ergebnisse der Differential-Expressionsanalyse zeigen eine herausragende Rolle für NOTCH2 und Chemotherapie Widerstand in GC, was einer Wirkung der Medikamente auf NOTCH2 Ausdruck anstatt zu einer Anreicherung von NOTCH2 exprimierenden Tumorzellen verbunden zu sein scheint.}

Citation: Bauer L, Langer R, Becker K, Hapfelmeier A, Ott K, Novotny A, et al. (2012) Expression Profiling von Stem Cell bezogener Gene, in Neoadjuvant-behandelten Magenkrebs: A NOTCH2
, GSK3B
und β-Catenin
Gene Signature Überleben vorhersagt. PLoS ONE 7 (9): e44566. doi: 10.1371 /journal.pone.0044566

Editor: Ju-Seog Lee, University of Texas MD Anderson Cancer Center, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 16. Mai 2012; Akzeptiert: 8. August 2012; Veröffentlicht am: 10. September 2012

Copyright: © Bauer et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Die Studie von der Deutschen Krebshilfe Mildred Scheel Stiftung gewähren Nummer 108524 auf GK und KB unterstützt wurde. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Erweiterte Magenkarzinomen (GC), indem sie häufig behandelt werden, platin /5-Fluorouracil (5FU) - basierte neoadjuvante Chemotherapie [1]. Das Ziel dieser Therapie ist es unter anderem, den Tumor vor der Operation verkleinern die Wahrscheinlichkeit einer vollständigen Resektion zu erhöhen und somit das Überleben der Patienten zu verbessern. Allerdings Antwortraten sind niedrig, und eine vollständige oder subtotale Tumorregression ist in nur 20 bis 40% der Patienten [1], [2] beobachtet. Somit ist Chemotherapie-Resistenz ein großes Hindernis für eine erfolgreiche Behandlung

Nach der Krebsstammzellhypothese, Tumorzellen heterogen sind und eine erhöhte Arzneimittelresistenz ist ein bestimmter Phänotyp einer Minderheit von Tumorzellen -. Die so genannt Krebs-initiierenden Zellen oder Krebsstammzellen (KSZ) [3] - [5]. Eine Erhöhung der CSC Population nach Chemotherapie nachgewiesen wurde [6], [7] und Unterschriften wurden mit einer schlechten Prognose in Magenkarzinomen, einschließlich verschiedener Tumoren Expression zellbasierten Gen stammen [8] - [11]. Die CSC Hypothese ist noch kontrovers diskutiert, aber es gibt Beweise für die Existenz des CSCS in verschiedenen Tumorarten und molekulare Marker wurden identifiziert, die auf diesen Zellen bevorzugt gefunden werden [4], [5]. Die Aktivierung von embryonalen Signalwege, wie beispielsweise die Wnt, Notch und Hedgehog Wege, ist als eine Antriebskraft für die Bildung von KSZ [4], [12] vorgeschlagen. Daten in Bezug auf die Quelle und das Vorhandensein von Magen-CSCs bleiben ergebnislos [13] - [17]. Bei Mäusen Knochenmark abgeleiteten Zellen oder eine spezifische Zellpopulation in dem Antrum das Wnt Zielmolekül LGR5 exprimieren, wurden mit CSCs im Magen [17], [18] verbunden. Darüber hinaus haben CD44 und CD24 als spezifische Zelloberflächenmarker vorgeschlagen worden, aber die Daten sind widersprüchlich [19], [20].

Die neoadjuvante Behandlungsprotokoll für GC bietet eine hervorragende Gelegenheit, Tumorzellen zu untersuchen, bevor und nach Chemotherapie bei Patienten. In dieser Studie haben wir versucht werden differentiell zwischen prätherapeutische Biopsien und der posttherapeutischen Tumorproben ausgedrückt erstens, ob die Expression des putativen CSC-Genen in der post-therapeutischen Resttumor prognostiziert das Überleben des Patienten und die zweite, ob bestimmte Gene zu erhellen in Übereinstimmung mit einer Anreicherung von Chemotherapie-resistente Tumorzellen, wie durch die CSC Konzept vorhergesagt. Die Gruppe der Patienten, die nach neoadjuvanter Chemotherapie erhebliche Schrumpfung des Tumors zeigte, hatte aber immer noch eine ausreichende Resttumorzellen zur Analyse zur Verfügung (10-50% Resttumor) als die am besten geeignete Gruppe betrachtet wurden mit einer Screening-Analyse für prognostische relevanten Gene zu starten und um dann zwischen den prä- und posttherapeutischen Tumorproben relevanten Unterschiede in der Genexpression zu identifizieren. Die Analyse dieser Resttumorzellen wir ein Genexpressionsmuster identifiziert umfasst GSK3B, CTNNB1
und NOTCH2
, die stark Prognose der Patienten vorhersagt. Wir zeigen, dass die Auswirkungen von GSK3B
und CTNNB1
auf diese Unterschrift nicht abhängig von Chemotherapie und spiegelt wahrscheinlich eine Eigenschaft des Primärtumors und unsere Daten weiter deuten darauf hin, dass insbesondere NOTCH2
eine Rolle für die Chemotherapie-Resistenz in GC spielen könnte.

Materialien und Methoden

Patienten

insgesamt 480 Patienten mit lokal fortgeschrittenem GC (cT3 /4 ) wurden durch neoadjuvante, platin /5FU-basierten Chemotherapie bei der Abteilung für Chirurgie an der Technischen Universität München zwischen 1991 und 2007 behandelt und für die Antwort auf der Grundlage eines standardisierten histopathologischen Protokoll [2] ausgewertet - [22]. Tumorregression wurde in 3 Kategorien eingeteilt: Tumorregression Grad (TRG) 1, die aus TRG1a besteht (Gesamttumorregression) und TRG1b (Wert Ihrer Tumorregression: < 10% Resttumorzellen /Tumorbett), TRG2 (partielle Tumorregression: 10-50% Resttumorzellen /Tumorbett) und TRG3 (minimale oder gar keine Tumorregression: > 50% Resttumor /Tumorbett). Von den 480 Patienten zeigte 121 Patienten TRG2 und 63 davon wurden in dieser Studie untersucht. Die Einschlusskriterium war die Verfügbarkeit ausreichender Tumorgewebe für die Analyse von Patienten, die mindestens 50% der projizierten Dosis der Chemotherapie behandelt mit. Die Patientencharakteristika und Behandlungsprotokolle sind in Tabelle 1. Um die Repräsentativität der 63 analysierten Patienten zu bestätigen, wurde die Verteilung ihrer klinisch-pathologischen Parameter an die 121-Patientenkohorte verglichen und zeigten keine statistisch signifikanten Unterschiede.

Folgen -up wurde vom ersten Tag der Behandlung bis zum Zeitpunkt der letzten Kontakt mit den Patienten berechnet. Die mediane Nachbeobachtungszeit betrug 77,1 Monate (Bereich: 28,5 bis 108,5). Die klinische Endpunkt der Studie war das Gesamtüberleben (OS), die als die Zeit zwischen dem ersten Tag der Chemotherapie und Tod durch irgendeine Ursache definiert wurde. Die mediane OS betrug 50,9 Monate (Bereich: 4,5 bis 108,5, 95% CI: 25,6-76,3) und 37 der 63 Patienten starben während der Follow-up. Diese Stichprobengröße und Anzahl der Veranstaltungen sind für eine einheitliche Bewertung aller Effektgrößen ausreichend groß in dieser explorativen Studie untersucht [23], [24].

Der Vergleich der Genexpression zwischen entsprechenden prä- und posttherapeutischen Tumorproben wurde für Patienten mit TRG2 und TRG3 (jeweils n = 22) durchgeführt.

für die immunhistochemische Analyse, prä- und posttherapeutischen Tumorproben von 21 Patienten mit TRG1b, 21 Patienten mit TRG2, 22 Patienten mit TRG3 und 16 durch eine Operation allein behandelten Patienten wurden eingeschlossen. Das Auswahlkriterium für diese Analysen war die Verfügbarkeit von prätherapeutische Biopsien und posttherapeutischen Tumoren entspricht.

Ethik Statement

Die Studie und die Verwendung von menschlichen Geweben wurde von der lokalen Institutional Review genehmigt Vorstand an der Technischen Universität München (Referenz: 2158/08), und informierte Zustimmung wurde nach institutionellen Regelungen erhalten

RNA-Extraktion und Reverse Transkription

die Gesamt-RNA aus Formalin fixierten extrahiert wurde. Paraffin eingebettetem (FFPE) Gewebe nach der manuellen Mikrodissektion von Tumorbereichen mindestens 50% Tumorzellen zusammengesetzt ist. Die RNA wurde durch Phenol und Chloroform-Extraktion gereinigt und umgekehrt, wie beschrieben transkribiert [25].

Genexpressionsanalyse

Die 44 Gene, die für die Analyse auf der Grundlage ihrer möglichen Rolle in der CSC Biologie ausgewählt wurden sind in Tabelle 2 Genexpression einbezogen wurde durch quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) auf maßgeschneiderte TaqMan ® niedriger Dichte Arrays (Applied Biosystems Inc., Foster City, USA) analysiert. Geeignete Referenz Gene wurden durch eine Analyse von zehn Kandidatenreferenzgenen in 8 Magenkarzinomen bestimmt unter Verwendung des geNorm-Algorithmus [26]. IPO8
, POLR2A Karten und UBC
bestimmt die geeignetsten Referenzgenen und Normalisierung auf den geometrischen Mittelwert dieser drei Gene basiert sein wurde wie beschrieben durchgeführt [26] . Reagenzien, Zyklusbedingungen und Software sind in den Hintergrundinformationen enthalten. Relative Genexpression wurde mit der vergleichenden ΔΔCt Methode quantifiziert [27].

Immunhistochemie

Der monoklonale Antikörper NOTCH2 (C651.6DbHN) wurde aus der Entwicklungsstudien Hybridoma Bank (DSHB erhalten, der University of Iowa, Fachbereich Biologie, Iowa City, USA). Das Färbeverfahren und Prüfung der Antikörper-Spezifität durch Western Blot werden in den Hintergrundinformationen und Abbildung S1A beschrieben.

Die immunhistochemische Färbung wurde in verblindet durch zwei unabhängige Forscher (L. B. und R. L) erzielt. Und zytoplasmatische Färbung wurde separat bewertet. Negative, schwach, mittel oder stark Färbeintensitäten wurden als 0, 1, 2 bzw. 3 erzielt. Der Anteil der Tumorzellen mit gefärbten Cytoplasma /Kern wurde als 0 (negativ) erzielte, 1 (< 10%), 2 (10 bis < 50%), 3 (50 bis < 80%) und 4 (≥80 %).

Statistische Analyse

Conditional wurden Inferenz-Tests verwendet, um die optimale Cut-off-Werte der Genexpression für die Assoziation mit dem Überleben der Patienten zu bestimmen, und die p-Werte geeignet für maximal um zu bestimmen, ausgewählte Statistiken [28]. Die Genexpression Werte über oder gleich dem optimalen Cut-off-Wert wurden definiert als Hochexpression und Genexpression Werte unterhalb des Cut-off-Wert wurden als niedrig Ausdruck definiert. Die Überlebensraten wurden nach Kaplan-Meier-Kurven geschätzt und wurden von Log-Rank-Tests verglichen. Relative Risiken wurden durch Bestimmung Hazard Ratio (HRS) von Cox Proportional Hazard Modelle geschätzt. In der multivariaten Analyse wurde schrittweise vorwärts variable Auswahl durchgeführt basierend auf einem Verhältnis Tests Wahrscheinlichkeit. Das Verhältnis der Anzahl der Variablen im Modell auf die Anzahl der Ereignisse wurde bis 1:10 [24] begrenzt.

Vergleiche von clinicopathological Variablen zwischen den Gruppen von Mann-Whitney-U-Tests durchgeführt wurden. Die χ ^{2-Test und der exakte Test nach Fisher gegebenenfalls für den Vergleich der relativen Häufigkeiten verwendet. Statistische Unterschiede von Genexpressionen zwischen gepaarte Stichproben wurden unter Verwendung analysiert der Wilcoxon-Rank-Test unterzeichnet.}

Unüberwachte hierarchische Clusteranalyse wurde mit Cluster 3.0-Software durchgeführt [29] und Java TreeView-Software (Version 1.1.5r2) [30]. Relative mRNA-Expression Daten wurden log-transformiert, Median-zentriert und normalisiert, bevor sie mit einer Distanzmatrix komplette Verknüpfung Clustering Anwendung basierend auf Pearsons Korrelation (unharmonische).

Ein Risiko-Score wurde berechnet, indem die Produkte der Multiplikation einer Zusammenfassung von der Cox-Regressionskoeffizienten jedes Gens in das Modell mit den normalisierten Genexpression Werte für jeden Patienten im wesentlichen wie beschrieben [31] (Details in Materialien und Methoden S1 und Tabellen S4 und S6).

Alle statistischen Tests wurden zwei -sided und in einer explorativen Weise mit einem Signifikanzniveau von 0,05 mit der SPSS 18.0 Software (SPSS Inc., Chicago, IL 11.5) und R (R-Stiftung für Statistical Computing, Wien, Österreich) durchgeführt.

die Studie richtet sich nach den Empfehlungen für die Tumormarker Prognosestudien (REMARK Kriterien) [32].

die Analyse der öffentlichen Microarray-Daten

öffentlich verfügbaren Genexpression Array-Daten von Magenkarzinomen mit Beschreibungen der klinischen Merkmale und das Überleben des Patienten [33] wurden aus der BRB-Array-tools Datenarchiv erhalten (http://linus.nci.nih.gov/~brb/DataArchive_New.html) und analysiert unter Verwendung von BRB-Array-tools [34] (Hintergrundinformationen) . Nur erweiterte Magenkarzinomen (T3 /4) (n = 58) wurden in die Analyse einbezogen. Die optimalen Cut-off-Werte von GSK3B
, CTNNB1
und NOTCH2
Ausdruck für eine Assoziation mit dem Überleben der Patienten durch den bedingten Inferenz-Tests für maximal ausgewählte Statistiken ermittelt wurden beschrieben.

Ergebnisse |

Gene Expression und
das Überleben des Patienten

Die Genexpressionsprofile der 63 Tumoren von Patienten mit TRG2 zeigte, dass hohe Expressionsniveaus von GSK3B
, DNMT1
und CTNNB1
signifikant besseres Überleben (bedingte Inferenz-Test: p = 0,006, 0,041 und 0,043, jeweils) verbunden waren. Eine moderate Assoziation mit besseren Überleben wurde für eine hohe Expression von ABCG2
und OLFM4
(p = 0,051, p = 0,055) und für niedrige Expression von NOTCH2
(p beobachtet = 0,071) (Tabelle 3). Univariate Cox-Regressionsanalyse etwa concordant Ergebnisse zeigten (Tabelle 4).

Eine multivariate Cox-Regressionsanalyse einschließlich GSK3B
, CTNNB1
, DNMT1
die Standard-prognostischen Variablen in GC, nämlich YPT, YPN, yd und Resektion Kategorie enthüllt GSK3B
als zweitwichtigste unabhängiger prognostischer Faktor (HR: 0,128, 95% CI: 0,033 bis 0,492, p = 0,003) nach Fernmetastasen (Tabelle S1).

eine Clusteranalyse allen analysierten Gene umfasst ergab keine Patientengruppen, die eine Verbindung mit OS ausgestellt. Eine Clusteranalyse von Wnt- und Notch-Signalweg-assoziierten Gene produziert die bedeutendste Verbindung mit OS, wenn GSK3B
, CTNNB1
und NOTCH2
enthalten waren (p = 0,002) (1A und B). Nach den Ergebnissen der Clusteranalyse, gruppiert wir die Patienten in drei Gruppen mit unterschiedlichen Kombinationen von hoher oder niedriger Expression von GSK3B
, CTNNB1
und NOTCH2
, die durch die optimale cut-off-Werte für die Genexpression in Zusammenhang mit dem Überleben der Patienten festgelegt wurde. Die Gruppe mit GSK3B
^{hoch, CTNNB1
hoch und NOTCH2
niedrige Expression das beste Überleben zeigten, während die Gruppe mit GSK3B
niedrig, CTNNB1
niedrig und NOTCH2
hohe Expression das schlechteste Gesamtergebnis hatte (p < 0,001, 1C).}

die Berechnung einer Risiko-Score basiert auf einer multivariaten hazard Regressionsmodell dieser drei Gene und Dichotomisierung der Patienten nach proportional Cox zum optimalen Cut-off-Wert für OS in eine hohe (n = 37) und niedriger (n = 26) Risikogruppe zeigte sich ein statistisch signifikanter Unterschied für OS (mediane Überlebenszeit von niedrigen und hohen Risikopatienten: nicht erreicht und 37 Monate festgesetzt; p < 0,001). Darüber hinaus waren die Unterschiede in den jeweiligen Überlebensraten bei 1, 2, 3 und 5 Jahre zwischen der niedrigen und hohen Risikogruppe statistisch signifikant (Tabelle S5).

Differentialgenexpressionsanalyse zwischen entsprechenden Pre- und Post -therapeutic Tumorproben

Wir als nächstes bestimmt, ob die Expression von Genen, die einen signifikanten oder moderate Assoziation mit OS zeigte (p < 0,1, Tabelle 3 und 4) unterscheiden zwischen prätherapeutische Biopsien und ihren entsprechenden Beitrag -therapeutic Tumorprobe. Zusätzlich Pou5f1
, LGR5
und CCND1
analysiert wurden, und Tumorproben von Patienten mit TRG2 oder TRG3 (jeweils n = 22) wurden untersucht.

bei Patienten mit TRG2 die Expression von NOTCH2
, Pou5f1
und LGR5
deutlich zwischen der Vor- und der posttherapeutischen Proben (p = 0,002 erhöht, 0,028 und 0,017, respectively) und die Expression von DNMT1
verringert (p = 0,009). In der Gruppe mit TRG3, Pou5f1
einen signifikanten Anstieg zeigten (p = 0,002), während die DNMT1
und CCND1
signifikant verringert (p = 0,002 und 0,007, respectively) .

die Expression der prognostischen relevanter Gene In Bezug auf GSK3B
und CTNNB1,
keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen der Vor- und der posttherapeutischen Tumorproben beobachtet wurden ( Tabelle 5 und Tabellen S2 und S3).

die Analyse der öffentlich verfügbaren Array Daten

Um den allgemeinen prognostischen Wert der Evaluierung GSK3B
^{hoch, CTNNB1
hoch und NOTCH2
niedrige Expressionsmuster verwendeten wir ein öffentlich verfügbaren Daten Expression Array von Magenkarzinomen festgelegt [33]. Der Datensatz enthalten die Gene von Interesse und die relevanten klinischen Informationen (OS, Tumorstadium) notwendig, um eine analoge Analyse durchzuführen. Die Bestimmung der optimalen Cut-off-Werte der Genexpression für die Korrelation mit dem Überleben und Beurteilung des kombinierten Ausdruck Signatur von GSK3B
hoch, CTNNB1
hoch und NOTCH2
niedrige eine Gruppe von 10 Patienten identifiziert, die eine deutlich längere OS (p = 0,017, Median OS: nicht erreicht) hatte mit den 47 verbleibenden Patienten (Median OS im Vergleich: 14,0 Mo, 95% CI: 8,7 -19,4) (Abbildung 1D).}

die Berechnung der Risiko-Score für diese Patientengruppe und Dichotomisierung der Patienten auf die optimale Cut-off-Wert für OS nach eine wesentlich längere Betriebssystem für die Gruppe mit niedrigem Risiko zeigte (n = 27) im Vergleich zu der Hochrisikogruppe (n = 30), obwohl der Unterschied statistisch nicht signifikant (mediane Überlebenszeit 21 im Vergleich zu 13 Monaten, p = 0,110). Unter Berücksichtigung der Unterschiede in den jeweiligen Überlebensraten bei 1, 2 und 3 Jahren unter Beweis gestellt analoge Ergebnisse mit der offensichtlichste Unterschied zu 2 Jahren mit einer Überlebensrate von 45% der Patienten mit geringem Risiko und 21% der Patienten mit hohem Risiko (p = 0,071 ) (Tabelle S7).

immunhistochemischen Analyse von NOTCH2

Um die Unterschiede in der Genexpression zwischen den paarigen prä- und posttherapeutischen Tumoren auf Proteinebene zu bewerten, führten wir Immunhistochemie und konzentrierte sich auf NOTCH2 (Abbildung S1B und C). Wir analysierten die gleichen Patientengruppen, die auf der mRNA-Ebene untersucht worden war. Zudem 21 Patienten mit TRG1b und einer Kontrollgruppe von 16 durch eine Operation behandelten Patienten allein wurden eingeschlossen.

Ein Vergleich der zytoplasmatischen Färbungsintensitäten zwischen prätherapeutische Biopsien und ihre entsprechenden posttherapeutischen Tumoren einen statistisch signifikanten Anstieg ergab in Färbeintensität in den post-therapeutischen Proben von Patienten mit TRG1b, 2 und 3 (p = 0,016, 0,001 und 0,017, respectively). Im Gegensatz dazu wurden keine Unterschiede in Patienten durch eine Operation allein (p = 0,438) (Figur 2) behandelt wurden, beobachtet. Der Prozentsatz der gefärbten Zellen wurde nicht wesentlich verändert. Kernfärbung Bezug, eine signifikante Abnahme der Färbeintensität in den posttherapeutischen Tumorprobe wurde in der Gruppe mit TRG2 gefunden (p = 0,007), TRG3 (p = 0,015) und in der Kontrollgruppe nicht behandelt durch Chemotherapie (p = 0,016) . , TRG3 (p = 0,003) als auch in der Kontrollgruppe (p = 0,001), eine deutliche Abnahme des Anteils der Zellen mit gefärbte Kerne wurde in der Gruppe mit TRG1b (p = 0,005), TRG2 (0.001 p <) beobachtet.

Diskussion

Unsere Studie die Expression von CSC verwandte Gene in Restmagenkrebszellen Analyse nach neoadjuvanter Chemotherapie eine Gen-Signatur mit einem hohen prognostische Bedeutung identifiziert, bestehend aus GSK3B
, die β-Catenin
Gen CTNNB1 und NOTCH2
. Interessanterweise hohe Expressionsniveaus von CTNNB1
und GSK3B
wurden mit einem erhöhten Überleben verbunden. Β-Catenin ist ein Schlüsselmolekül bei der Übertragung von Wnt-Signalisierung an den Kern und treibt mehrere zellulärer Prozesse [35]. Aberrant Wnt-Signal wurde bis zu 46% von GCs, und beide Wnt / β-Catenin
und Proliferation /Stammzellexpressionssignaturen, welche die jeweiligen Stoffwechselwegaktivierung wurden mit einer verminderten das Überleben des Patienten [36] zeigten in. CTNNB1
mRNA-Spiegel kann Wnt-Signal [37] modulieren, und Wnt-Aktivität hat Krebs stemness im Kolon [38] in Verbindung gebracht worden. Vor dem Hintergrund dieser Daten eine negative Assoziation von CTNNB1
Ausdruck in Resttumorzellen nach einer Chemotherapie und das Überleben der Patienten zu erwarten sind. Jedoch β
Catenin ist auch Teil der E-Cadherin-Catenin-Komplexes und Veränderungen in dieser Zelladhäsion Komplex haben mit einer schlechteren Prognose in verschiedenen Tumoren [39] in Verbindung gebracht worden. Im GC, widersprüchliche Ergebnisse in Bezug auf den Zusammenhang zwischen β-Catenin
Ausdruck und die Prognose eines Patienten existieren [40], [41].

Es ist wichtig zu beachten, dass GSK3B ist auch ein multifunktionales Protein in verschiedenen Signalisierungsnetze beteiligt und antagonisiert Wnt-Signal durch den Abbau von vermittelnde β-Catenin
, obwohl ein Wnt-Aktivierung Funktion auch [42] beschrieben wurde - [44]. Eine erhöhte Expression von GSK3B
wurde mit einer günstigen Prognose in unserer Studie verbunden, die mit einem Bericht der höheren konsistent ist GSK3B
mRNA-Expression mit einer besseren Überleben in ovarian hochwertigen serösen Karzinomen assoziiert [45 ].

Höhere NOTCH2
Expressionsniveaus in unserer GC-Patienten mit schlechter Überleben korreliert. Der Notch-Rezeptor-Familie umfasst vier Mitglieder und NOTCH1 und NOTCH2 gebracht wurden Magenkrebs Progression [46], [47] zu verbessern. Darüber hinaus hat eine Vereinigung von NOTCH1 Ausdruck mit einer schlechten Prognose berichtet [48], die nicht im Einklang mit unseren Ergebnissen ist; jedoch aufgrund der Unterschiede in den Studienpopulationen, sind diese Ergebnisse nicht direkt vergleichbar.

die hoch signifikante Assoziation der Gen-Signatur Da umfassenden CTNNB1
, GSK3B
NOTCH2
mit dem Überleben der Patienten und dem signifikanten Risiko-Score-basierte Klassifizierung der Patienten in einem hohen und niedrigen Risikogruppe waren wir besonders daran interessiert, wenn diese auf eine Chemotherapie verbunden waren. Der Vergleich von GSK3B
und CTNNB1
Expressionsniveaus zwischen prä- und posttherapeutische Tumorproben zeigten keine deutliche Unterschiede, während eine deutliche Steigerung in der Expression von NOTCH2
wurde gefunden. Dieser Befund legt nahe, dass CTNNB1
und GSK3B
Ausdruck kann eine Eigenschaft des primären Tumors widerspiegeln, die nicht durch eine Chemotherapie verändert wird und dass NOTCH2
Ausdruck in den Resttumorzellen zumindest teilweise auf diese Behandlung.

eine Analyse der prognostische Bedeutung der drei Gene in öffentlich zugänglichen genomweite Expressionsdaten von fortgeschrittenen GC eine signifikante Assoziation für den spezifischen Genexpressionsmuster von demonstriert GSK3B
^{hoch, CTNNB1
hoch und NOTCH2
niedrige Expression und erhöhte das Überleben der Patienten und eine ähnliche Tendenz, die Risiko-Score-basierte Klassifizierung berücksichtigen.}

Dieses Ergebnis unterstützt die Interpretation, dass die prognostische Wirkung in unserer Studie beobachteten vor allem eine Eigenschaft des primären Magentumor reflektiert, eine entscheidende Rolle für diese Gene in die Biologie dieser Tumoren hindeutet. Darüber hinaus beobachtet die prognostische Effekt könnte durch eine Steigerung in der Expression von NOTCH2
in dem Resttumor nach Chemotherapie verbessert werden. So wird in einer prospektiven Studie, wenn validiert, diese drei Gen-Signatur könnte zur Risikostratifizierung von GC Patienten nützlich sein, und zusätzlich der postoperativen Behandlung nach neoadjuvanter Chemotherapie führen kann.

Unsere Ergebnisse erinnern an eine kürzlich durchgeführte Studie eine Analyse von CSC abgeleitete Gen-Signatur, die ein Tumorrezidiv im Kolon prognostiziert und zeigt, dass die erhöhte Expression von Wnt Zielgenen ist ein Anzeichen für eine günstige Prognose [48]. Die Autoren belegen, dass diese Assoziation eher die Differenzierungsstatus des bösartigen Gewebes anstatt die Anzahl der CSCs widerspiegelt [49].

, um die Veränderungen der Unter Berücksichtigung NOTCH2
Ausdruck zwischen den entsprechenden Vor- und posttherapeutischen Tumoren, ist es wichtig, den Vergleich der Genexpression auf mRNA-Ebene zu beachten, nicht unterscheiden kann, ob diese Veränderungen eine relative Anreicherung der Zellen, die dieses Gen zu reflektieren, ob sie auf die chemotherapeutische Mittel zurückzuführen sind, zu beeinflussen Gentranskription in der Zellen per se
, oder ob die Veränderungen nur Probenahme Unterschiede widerspiegeln. Um dieses Problem zu klären, analysierten wir NOTCH2 Protein-Expression mittels Immunhistochemie und enthalten Tumoren durch eine Operation behandelten Patienten allein. Basierend auf der zytoplasmatischen Färbungs, bestätigen unsere Ergebnisse eine Steigerung in NOTCH2 Expression auf Proteinebene in den post-therapeutischen Tumoren und sie zeigen, dass die beobachteten Unterschiede sind wahrscheinlich für die Patienten durch Chemotherapie behandelt beschränkt werden. Bemerkenswert war die Zunahme der Expression NOTCH2 zu einer Erhöhung in der zytoplasmatischen Färbungsintensität bezogen und nicht auf eine Erhöhung der Anzahl von Zellen, die NOTCH2. Dieses Ergebnis spricht gegen eine Anreicherung einer Subpopulation von NOTCH2-exprimierenden Tumorzellen und legt nahe, wahrscheinlich eine Chemotherapie-induzierte Erhöhung der Genexpression in Tumorzellen, die den Tumor biologische Eigenschaften nach neoadjuvanter Behandlung zusammenhängen. Es kann jedoch eine klare Unterscheidung zwischen diesen Möglichkeiten durch die semi-quantitative Auswertung der immunhistochemischen Färbung begrenzt werden. Wie ähnliche Veränderungen der Kernfärbung wurden in allen Tumorgruppen, einschließlich der Kontrolle beobachteten wir diese Veränderungen als nicht im Zusammenhang mit einer Chemotherapie in Betracht gezogen.

Unabhängig von der Mechanismus und die wahre Natur der restlichen Tumorzellen exprimieren NOTCH2
können unsere Ergebnisse therapeutische Implikationen haben. Notch-Signal wurde als potentielles neues therapeutisches Ziel taucht und gamma-Sekretase-Inhibitoren, die die Verarbeitung der Notch-Rezeptoren inhibieren, werden derzeit in klinischen Studien untersucht [50]. Unsere Studie legt nahe, dass Notch-Signal Targeting auch eine neue Strategie GC zur Behandlung von Patienten darstellen kann. Als prognostisch ungünstigen Effekt nur mit verbunden war NOTCH2
und nicht NOTCH1
zeigen unsere Daten auch, dass eine detaillierte Charakterisierung der einzelnen Notch-Rezeptoren und eine gründliche funktionelle Untersuchung sind obligatorisch und weiter stark begünstigen die Entwicklung von Notch paralog-spezifischen Hemmstoffe.

Ein signifikanter Anstieg der Pou5f1
Expression nach einer Chemotherapie in den reseziert Proben in unserer Studie beobachtet wurde. Der Pou5f1 Transkriptionsfaktor ist wesentlich für die Aufrechterhaltung der Selbsterneuerung und ihre hohe Expression in verbleibende Krebszellen nach der Radiochemotherapie ist mit einer schlechten Prognose bei Darmkrebs [51] korreliert. Interessanterweise beobachteten wir auch eine erhöhte Expression von LGR5
, einem vielversprechenden Darm-CSC Marker, nach einer Chemotherapie bei Tumoren mit TRG2 [18]. Diese Ergebnisse sind kompatibel mit dem Potential Anreicherung von arzneimittelresistenten Tumorzellen exprimieren Pou5f1 in oder LGR5
, aber die zugrunde liegenden Mechanismus für diese Änderungen und die besonderen Eigenschaften der Zellen, die diese Gene exprimieren, bleiben bestimmt werden

in unserer Studie für die Zelloberflächenmoleküle CD44 oder CD133 keine Assoziation mit dem Überleben beobachtet wurden, von denen beide weit verbreitet wurden mutmaßliche CSCs in verschiedenen Tumoren [4] zu identifizieren -. [11]. Dieses Ergebnis unterstützt die jüngsten Ergebnisse zeigen, dass diese Zelloberflächenmoleküle nicht identifizieren CSCs in primären Tumoren des Magens [20].

Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, dass der Ausdruck Signatur von GSK3B
^{hoch, CTNNB1
hoch und NOTCH2
niedrig in der Chemotherapie-resistente Tumorzellen GC Rest ist ein starker Prädiktor für eine günstige Prognose für den Patienten. Diese prognostische Bedeutung wurde auch für die GC-Patienten zeigten öffentlich verfügbaren Genexpressionsdaten verwenden. Die Ergebnisse der Differential-Expressionsanalyse der prä- und posttherapeutische Tumorprobe zeigt auch, dass die Auswirkungen von GSK3B
und CTNNB1
auf diese Signatur ist nicht abhängig von der Chemotherapie, sondern im Zusammenhang mit eine Eigenschaft des primären Tumors. Sie zeigen weiterhin eine herausragende Rolle für NOTCH2 und Chemotherapie Widerstand in GC, die eher zu einer Wirkung der chemotherapeutischen Mittel auf NOTCH2
Ausdruck in Beziehung steht und nicht zu einer Anreicherung von NOTCH2
exprimierenden Tumor Zellen.}

Grundinformationen
S1 Abbildung.
Western blot und Immunhistochemie mit dem Anti-NOTCH2 Antikörper. A) Der Antikörper gegen das intrazelluläre Domäne NOTCH2 gerichtet erkennt spezifisch die volle Länge NOTCH2 Protein über dem 250 kDa-Marker sowie die gespaltenen Formen NOTCH Extrazellulär Verkürzte (NEXT) und NOTCH intrazelluläre Domäne (NICD) bei etwa 110 kDa. B) Eine schwache zytoplasmatische immunhistochemischen Färbung in der prä-therapeutischen Biopsieprobe und C) eine starke zytoplasmatische Färbung in der entsprechenden posttherapeutischen Tumor mit TRG2 gezeigt. Maßstabsbalken zeigen 50 &mgr; m
doi:. 10.1371 /journal.pone.0044566.s001
(TIF)
Tabelle S1.
Multivariate Cox-Regressionsanalyse. Die Genexpression von GSK3B, CTNNB1, DNMT1
und die Standard-prognostischen Variablen in GC, YPT, YPN, yd und Resektion Kategorie wurden in das Modell aufgenommen
doi:. 10.1371 /journal.pone.0044566.s002
(DOC)
Tabelle S2.
Genexpressionsdaten der Vor- und entsprechenden posttherapeutischen Tumorproben von Patienten mit TRG2
doi:. 10.1371 /journal.pone.0044566.s003
(DOC)
Tabelle S3.

• PLoS ONE: Der prognostische Wert der geernteten Lymphknoten und das metastatische Lymphknoten-Verhältnis für Magenkrebs-Patienten: Ergebnisse einer Studie von 1.101 Patienten
• PLoS ONE: N-myc Downstream reguliertes Gen 1 (NDRG1) Fördert Metastasierung von menschlichen Szirrhöse Magenkrebszellen durch epitheliale mesenchymale Transition