Metastatische Tumorentwicklung und organoiden Modellierung verwickeln TGFBR2as ein Krebstreiber bei diffusem Magen cancer

metastatische Tumorentwicklung und organoiden Modellierung verwickeln TGFBR2
als Krebstreiber bei diffusem Magenkrebs
Zusammenfassung
Hintergrund
Magenkrebs ist die zweite -leading Ursache der globalen Todesfälle durch Krebs, mit der Krankheit metastasierendem die primäre Todesursache darstellt. Um Kandidaten Treiber in Onkogenese und Tumorentwicklung beteiligt zu identifizieren, führen wir eine umfangreiche Analyse der Genomsequenzierung von metastasierendem Progression in einem diffusen Magenkrebs. Dazu erfolgt ein Vergleich zwischen einem primären Tumor an einer erblichen Magenkrebs-Syndrom Probanden und ihre Wiederholung als ovarian Metastasierung diffundieren.
Ergebnisse | Sowohl der Primärtumor und Metastasen ovarian haben gemeinsame biallelic loss-of-Funktion sowohl der CDH1
und TP53
Tumorsuppressoren, was auf einen gemeinsamen genetischen Ursprungs. Während der Primärtumor weist Verstärkung des Rezeptor Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGFR2
) -Gen fehlt der Metastasierung insbesondere
Verstärkung FGFR2 sondern besitzt einzigartige biallelischen Veränderungen der Transforming growth factor-beta-Rezeptor-2 (TGFBR2
) , was auf die divergente in vivo
Entwicklung eines -Mutante metastasierendem Klonpopulation bei diesem Patienten
TGFBR2. Wie TGFBR2
Mutationen sind bisher nicht in Magenkrebs funktionell validiert wurde, modelliert wir das metastatische Potential von TGFBR2 Verlust in einem murinen dreidimensionalen primären Magen organoiden Kultur. Die TGFBR2
shRNA Knockdown innerhalb Cdh1
- /-
; TP53
- /-.
Organoiden erzeugt Invasion in vitro
und robust metastasierendem tumorigenicity in vivo
bestätigt TGFBR2
Aktivität Metastasierung Suppressor
Schlussfolgerungen
Wir dokumentieren die metastasiertem Differenzierung und genetische Heterogenität von diffusem Magenkrebs und zeigen das Potenzial metastasierendem Rolle von TGFBR2
loss-of-function. Zur Unterstützung dieser Studie wenden wir eine murine primären organoiden Kulturverfahren, das rekapituliert in vivo
metastasierendem Magenkrebs. Insgesamt beschreiben wir einen integrierten Ansatz zu identifizieren und funktionell vermeintlichen Krebstreiber bei der Metastasierung beteiligt zu validieren.
Hintergrund
Weltweit, Adenokarzinom des Magens die vierthäufigste Krebserkrankung und die zweithäufigste Ursache für Todesfälle durch Krebs bei Männern und Frauen. Basierend auf unverwechselbare histopathologischen Merkmalen wird kategorisiert Adenokarzinom des Magens in diffuse und Darm-Subtypen [1]. In Bezug auf die Histopathologie, diffus sind Magenkrebs im Allgemeinen undifferenziert, häufig Signet Zelle Ring Merkmale aufweisen und invasiv normalen Magengewebe infiltrieren. Im Gegensatz dazu hat der Darm-Subtyp epithelialen Merkmale und bildet Massen diskrete Tumor ähnlich wie Darmkrebs. Diffuse Magenkrebs hat eine höhere Inzidenz von Metastasen und eine im allgemeinen schlechtere Prognose im Vergleich zum Darm Subtyp [2], [3]. Derzeit haben die Genomanalysen von diffusem Magenkrebs eine kleine Anzahl von Proben, einschließlich einer aktuellen Studie des Cancer Genome Atlas Project (TCGA) und eine ganze Genomsequenzierung Befragung einer Reihe von diffusen Magentumoren [4] beteiligt. Allerdings gibt es nur wenige, wenn überhaupt, studiert, die detailliert die metastatischen Entwicklung von Magenkrebs; metastasierten Tumoren sind in der Regel fehlen von großen genomischen Krebs Erhebungen wie TCGA. Insgesamt ist wenig über die onkogenen Prozess und die Tumorentwicklung von metastasierendem Magenkrebs bekannt trotz seiner größter klinischer Bedeutung. [5] Bei der hereditären
Magenkrebs diffundieren (HDGC), Keimbahnmutationen in CDH1
(das heißt, E- Cadherin) verleihen eine 70% Lebenszeitrisiko diffuse Magenkrebs zu entwickeln [6], [7]. Die CDH1
Tumorsuppressorgen kodiert, E-Cadherin, einem transmembranen Glykoproteins, die Calcium-abhängige Zell-Zell-Adhäsion vermittelt. Änderungen in CDH1 Funktion beeinflussen die epithelial-mesenchymale Transition (EMT), die als eine Rolle spielen bei der Tumorentstehung beteiligt ist. Studien der betroffenen HDGC Individuen Tumoren bieten eine einmalige Gelegenheit, die wesentlichen Treiber der diffusen Magenkrebs im Zusammenhang mit der CDH1
Verlust der Funktion zu bestimmen. Belege für die Rolle der CDH1
in sporadischen diffuse Magenkarzinome umfasst die Erkenntnis, dass 50% enthalten CDH1
Mutationen oder Hypermethylierung des CDH1
Promotor [8], [9]. Eine kürzlich durch Sequenzierung ganzer Genome Umfrage der diffusen Magenkrebs auch häufige CDH1
Mutationen als die häufigste Treiber Ereignis [4] identifiziert. Die TCGA Magenkrebs Daten zeigen auch eine hohe Frequenz von somatischen CDH1
Mutationen [10]. Deutlich weniger ist über die Identität und die Rolle der Co-auftretende Fahrer bekannt, dass Magen-Metastasen zu diffundieren beitragen.
Hier berichten wir über eine Studie des metastatischen evolutionären Prozess in diffusem Magenkrebs. Unser Ziel war es bekannt und Kandidaten Treiber zu identifizieren, die die Tumorprogression bei Metastasierung beschreiben. Wir führten eine umfangreiche Genomsequenzierungsanalyse eines primären Magentumor und Metastasen von einem Individuum mit einer Keimbahnmutation CDH1
(Abbildung 1), die mit einem magen primären vorgelegt, gefolgt nach 3 Jahren durch Metastase in der linken Ovars. In Anbetracht
der bestehenden Keimbahnmutation in CDH1, nur der Krebs-Genom ein zweites Allel erfordert über eine somatische genetische Aberration betroffen, wie es in den Tumor von dieser Person demonstriert. Da die anfängliche Krebs Fahrer Ereignis bekannt ist, bieten Mendel'sche Krebsgenome eine seltene und sehr informativ `Experiment der Natur", die die Möglichkeit bietet somatischen Genetik der Metastasierung zu beschreiben. Die Sequenzierung des Genoms Analyse beider Tumoren ergab Hinweise auf einen gemeinsamen Ursprung auf der Grundlage gemeinsamer Mutationen aber größere genomische Vielfalt sowohl auf der Ebene der Mutationen sowie umfangreiche allelische Ungleichgewicht und die Kopienzahl Aberrationen für die metatasis gesehen. Abbildung 1 Familie und die Krankengeschichte eines Mendel'sche diffusen Magenkrebs. Der Stammbaum des Indexpatienten 525 (III-1) dargestellt. Tumortypen werden durch Farbe einschließlich grün für Bauchspeicheldrüsenkrebs, rot für diffuse Magenkrebs und Gelb für Brustkrebs angezeigt. Der Patient mit ihrem primären Magenkrebs im Alter von 37 Jahren vorgestellt. Drei Jahre später präsentierte sie mit einem Bauchbeschwerden. Kontrastmittel-CT-Scan des Beckens eine linke Ovar Masse (gelber Kreis) identifiziert, die auf Biopsie bestätigt wurde eine diffuse Magenkrebs Metastasen zu sein (das heißt, Krukenberg Tumor). Im Verlauf des metastasierten Tumorentwicklung, eine Reihe von bekannten und Kandidaten Krebstreiber Ereignisse skizziert den Tumor Evolution und genetische Divergenz der Metastasierung aus dem Primärtumor.
Wir stellten fest, ob die Kandidaten-Treiber von dieser metastatischen Progression ausreichend waren diffus zu reproduzieren Magenkrebs. Unsere Krebsmodellierungsmethodik in vitro
Magen Organoiden verwendet und erlaubt es, die genetischen Fahrer Kontext dieser Krebsarten zu entwickeln und den Prozess der metastatischen Entwicklung und onkogenen Weg Divergenz studieren. Die Integration von genetischen Analyse und biologische Modellierung, stellten wir fest, die unabhängige Rolle der TGFBR2
(transforming growth factor-β-Rezeptor 2) in der Onkogenese von diffusem Magenkrebs. Unsere experimentellen Krebs Modellierung stützt sich auf eine Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche für die primäre Maus Darm-Kultur, die beide epithelialen und mesenchymalen Elemente enthält, rekapituliert genau langfristige Proliferation, multilineage Differenzierung, die Wnt /Notch abhängigen Stammzellnische, und Peristaltik [11]. Wir berichteten über eine analoge primären Magen-organoiden Kultursystem, das genau multilineage epitheliale Differenzierung und Stromaelemente [12] rekapituliert. Vor kurzem konnten wir robuste In-vitro-
onkogene Transformation von primären Magen-, Darm- und Pankreas Organoiden über Mutationen in Kras
und Trp53
, die in vitro
mit einem Adenokarzinom hochgradigen Dysplasien und Invasion induzieren auf subkutane Transplantation in Mäusen [13]. Wir zeigen die funktionale Validierung von Magenkrebs Metastasen Treiber Kandidaten von Krebsgenomprofilstudien, die sich auf den Fahrer
TGFBR2 Modellierung als Beweis des Prinzips.
Ergebnisse
Magenkrebs Diffuse und metastatischen Progression
Im Alter von 37 Jahren, wurde der Indexpatient (525) mit der Stufe III (T3N1M0) schlecht differenzierten diffuse Adenokarzinom des Magens (Abbildung 1) diagnostiziert. Ihre 42-jährige Schwester wurde mit diffuser Adenokarzinom des Magens 2 Monate früher diagnostiziert. Auf der Grundlage der Familiengeschichte von Magenkrebs und die ungewöhnlich jungen Alter von Beginn, unterzog sie sich Keimbahn CDH1
Mutation Tests. Der Patient und wurden ihrer Schwester eine Keimbahn-Spleißstellen-Mutation in Intron 10 (c.1565 + 2insT) gefunden zu haben. Diese Keimbahnmutation wurde anschließend in einer anderen Familie mit erblichen diffusen Magenkrebs (HDGC) [14] berichtet. Der Patient unterzog sich einer Gastrektomie ihren primären Tumor zu entfernen und wurde eine einzelne Lymphknotenmetastasen gefunden zu haben. Sie erhielt eine adjuvante Standardbehandlung einschließlich kombinierter Chemotherapie (Cisplatin und 5-Fluorouracil) und Strahlung. Drei Jahre nach ihrer ersten Präsentation, berichtete der Patient progressive Unter Völlegefühl. Eine Computertomographie (CT) eine große Beckenmasse im Einklang mit einer linken ovarian Metastasierung (Abbildung 1) demonstriert. Anschließend unterzog sich der Patient Laparotomie mit bilateralen Salpingoophorektomie und Biopsie des Beckenmasse. Pathologische Studien zeigten metastatischen Adenokarzinom des Ovars beteiligt, sonst als Krukenberg Tumor bezeichnet wird, mit derselben histologischen Erscheinungsbild als Primärtumor. Eine Studie berichtet, dass unter diffusen Magenkrebs mit metastasiertem Verbreitung, das Ovar eine metastatische Stelle in 28,8% der Fälle war [15]. Somit ist das Ovar eine gemeinsame Website für metastasierte Erkrankung. Krebs-Genom-Sequenzanalyse
Sowohl Exoms und des gesamten Genoms Paired-End-Sequenzierung
auf dem Primärtumor durchgeführt wurden, Eierstock- Metastasierung und normalem Gewebe, das Blut und die normale Magen enthalten Gewebe (Zusätzliche Datei 1: Tabelle S1). Gewebe aus der Metastasierung Lymphknoten war für die Analyse nicht zur Verfügung. Mehrere Sequenzierungsmethoden wurden angewendet für das Ausmaß der normalen Stromazellen Mischung, eine direkte Folge des infiltrative Invasivität des diffusen Magenkrebs Subtyp zu kompensieren. Wir stellten fest, um das Ausmaß der normalen Genoms Mischung und für die Aufnahme der normalen DNA (1 Zusätzliche Datei: Methoden) korrigiert. die Komplexität der Tumorproben weisen wir eine zusätzliche Runde der gezielte Sequenzierung durchgeführt, das Vorhandensein von Mutationen und anderen genetischen Veränderungen zu bestätigen, die in den Exons, in der Nähe von Exon-Grenzen oder Veranstalter aufgetreten.
Insgesamt erhielten wir mehr als 100 × durchschnittliche Reichweite für jede Exoms und allgemein für die Entdeckung von Mutationen kodierenden Region auf Exoms Daten verlassen. Für ganze Genom-Sequenzierung, hatten wir mehr als 60 × durchschnittliche Abdeckung für den primären Krebs des gesamten Genoms Probe und 30 × für die metastatische Genoms. Das gesamte Genom-Sequenzierung wurde zur Identifizierung von größeren Maßstab genetischen Veränderungen wie Kopienzahl Variation (CNV), Allel-Ungleichgewichte, Umlagerungen und andere Klassen von Strukturänderungen verwendet. Nach der Ausrichtung führten wir Variante somatische Mutationen und andere Klassen von genetischen Veränderungen zu identifizieren, rufen. Dazu gehörte auch somatische Mutationen, Insertion-Deletionen (indels), CNVs, Verlust der Heterozygotie Regionen (LOH) und Krebs-Umlagerungen (Weitere Datei 1: Tabelle S3 und Tabelle S4). Als Kontrolle für den Aufruf von Einzel-Nukleotid-Variante, eine Genotypisierung wir die Proben mit Affymetrix 6.0 single nucleotide polymorphism (SNP) Arrays; Wir verglichen die Genotypen auf die identifizierten SNPS aus den Sequenzdaten. Die Übereinstimmung von Exoms und des gesamten Genoms SNP-Daten auf die Array-Daten betrug 99%.
Mit deep sequencing Region Mutationen und Validierung von Coding kaufen Wir Mutationen identifiziert, die in den Exons und intro Mutationen innerhalb von 100 Basen der Exon-Grenze aufgetreten, und die Tabelle S2: Die Ergebnisse sind in den weiteren Datei 1 zusammengefasst. Wie bereits erwähnt, hatte die Tumorproben komplexe Zusammensetzung, die die Sequenzabdeckung einiger Mutationen reduziert. Wir gingen mit einer zusätzlichen Runde gezielte Sequenzierung diese Mutationen zu bestätigen und zu bestimmen, ihre Präsenz in beiden Tumoren. Wir haben einen Test für tiefe gezielte Resequenzierung, die etwa 300 Basen rund um die spezifische Mutation loci bedeckt (Weitere Datei 1: Tabelle S5). Die durchschnittliche gezielte Sequenzierung Deckung für jede mutmaßliche Mutation oder Loci 278 × für den normalen, 251 × für den Primärtumor und 152 × für die Metastasierung war.
Zwischen den beiden Tumoren validiert wir unabhängig insgesamt 77 Mutationen, die innerhalb aufgetreten oder in der Nähe Exons (Weitere Datei 1: Methoden und Tabelle S5). Validierte genetische Abweichungen enthalten: (1) nicht auch Mutationen, (2) auch Mutationen, (3) Einfügungen, oder (4) Löschungen. Mit der Sequenzierungsdaten gezielt stellten wir fest, die Mutation Allelfrequenz (MAF) zwischen dem Primärtumor und Metastasen für jede Mutation. Dabei wird die Fraktion einer Sequenz mit einer Mutation im Vergleich zu lesen Bestimmung mit der Referenzsequenz liest. Wir waren in der Lage zu erkennen, welche Mutationen waren gemeinsam oder exklusiv für den Primärtumor im Vergleich zur Metastasierung. Unter den 77 validierten Mutationen war die Verteilung derart, daß Mutationen entweder an den primären Tumor oder metastatischen Seite allgemein einzigartig waren. Zum Beispiel hatte der Primärtumor acht Mutationen, die nicht in der Metastasen waren während der Metastase 37 Mutationen hatten nicht im Primärtumor. Gemeinsam ist den beiden Krebsarten 32 Mutationen wurden.
Vor der Erfassung der Metastasierung das Intervall von drei Jahren gegeben, gibt es eine Möglichkeit, dass die Metastasen-spezifischen Mutationen unabhängig vom primären Tumor aufgetreten ist. Mutationen spezifisch an den primären Tumor, der nicht in der ovarian Metastasierung waren möglicherweise das Ergebnis von zufälligen genetischen Drift haben. Die Mutationen, die für beide weisen auf einen gemeinsamen Ursprung, aber der genaue Zeitpunkt der Differenzierung zwischen den beiden Tumoren ist weniger klar, wie diese Mutationen mit niedrigeren MAF zur Kenntnis genommen. Eine Untergruppe dieser Gene hatten hohe MAF-Werte, was auf eine höhere Wahrscheinlichkeit in allen klonalen Populationen im Primärtumor oder Metastasen vorhanden sind. Wie wir später beschreiben, wurden diese Gene für die weitere experimentelle Prüfung im Magen-Organoiden priorisiert.
Mutations Genfunktion
Unter den Mutationen betreffen, die extern validiert wurden wir auf der Untergruppe von Mutationen konzentriert führende Säure Substitutionen, vorzeitigen Stopp zu Aminogruppen Codons und indels, die den offenen Leserahmen verändert. Anschließend bestimmten wir, ob diese Mutationen kodierenden Genfunktion potentiell schädliche waren eine Anzahl von Vorhersagealgorithmen wie PolyPhen [16] und SIFT [17] unter anderem. Auf der Grundlage der MAF-Informationen für jede Mutation haben wir festgestellt, ob diese Mutationen mit einem möglichen schädlichen Auswirkungen auf die Genprodukte waren gemeinsamen oder exklusiven zu Primärtumor und Metastasen (Abbildung 2). Abbildung 2: Vergleich der genetischen Aberrationen in den Primärtumor und Metastasen. Gemeinsame gegen
exklusiven genetischen Veränderungen zwischen den beiden Tumor Genome verglichen. (A) Gene mit Codierung Mutationen sind eine mögliche schädliche Auswirkungen haben aufgeführt. Diese Gene werden klassifiziert basierend darauf, ob sie exklusiv (red Zeichen) oder gemeinsam (grüne Zeichen) an den Primärtumor und Metastasen. Die Mutationen alle Änderungen in der Zusammensetzung des Genprodukts Aminosäure führen und erhielten eine signifikante Änderung mit einer hohen Wahrscheinlichkeit der Beeinflussung des Genprodukts Funktion zu haben identifiziert. (B) Eine Zusammenfassung der Chromosomenaberrationen über den gesamten Krebs-Genom beider Tumoren gezeigt. Dazu gehören Kopienzahl Variation (CNV) oder den Verlust der Heterozygotie (LOH). Die roten Blöcke zeigt Ereignisse exklusiv für den Primärtumor oder Metastasen. Die grünen Blöcke zeigen Ereignisse beiden gemeinsam. Die Anzahl der Ereignisse pro Chromosom in jedem Block enthalten sind. Die Pfeile zeigen LOH Ereignisse oder Deletionen, die den p Arm, q Arm oder ganze Chromosom umfassen. Rote Pfeile zeigen Chromosomenaberrationen, die exklusive und grüne Pfeile Ereignisse zeigen, die gemeinsam sind.
Bei der Untergruppe von schädlichen Mutationen, wir zusätzliche biologische Pfadanalyse, Literatur und Vergleich gegen den Krebs-Genom-Atlas-Daten verfügbar für diffuse Magenkrebs durchgeführt. Dies wird eine Reihe bekannter Krebsgene und wahrscheinlich krebsbedingte Kandidaten mit Mutationen identifiziert, die wahrscheinlich einen Einfluss auf die Proteinfunktion hatte. Wir konzentrierten uns auf eine Reihe von Kandidaten-Treiber-Genen (Tabelle 1), die zuvor onkogenen Potential haben gezeigt worden waren oder wurden Tumorsuppressoren bekannt mit biallelic Veränderungen in den Krebs genomes.Table 1 Krebs Onkogene mit Amplifikationen oder Krebs Fahrer mit biallelic Ereignisse
Herkunft Bei
Bekannte oder Fahrer Kandidat Krebs
Biallelische Ereignis
allelische Veränderung 1
Mutation oder genomische Aberration
Chr

Chr Position oder Intervall
allelische Veränderung 2
Einzigartige an den primären
FGFR2- *
Amplification
6-fach Verstärkung
10
117820033 bis 119748751
gemeinsam mit dem Primärtumor und Metastasen
CDH1
Ja
Löschen
Teil Deletion von Exon 9
16
68.847.326-68.847.403
Keimbahnmutation in CDH1
TP53
Ja
5'Spleißstelle Mutation
Aberrant Spleißen
17
7.578.370
Hemizygote Verlust von 17p Arm
Einzigartig in der Metastasierung
TGFBR2
Ja
Rasterschubmutagene indel
Stop-Codon in Exon 4
3
30.691.871
Hemizygote Löschen von Wildtyp TGFBR2
Locus
PCDH7
Ja
Missense
S87R
4 30.723.305
Hemizygote Löschen von Wildtyp 4 Arm
FERMT1
loci
Ja
Verlust der Heterozygotie
FERMT
1 20
FERMT in 20p12.3 gelegen
1-Mutation
BMP7
loci
Ja
Verlust Heterozygotie
BMP7
in 20q13.3
20 gelegen
BMP7
Mutation
Chr. Chromosom
Copy Number Variations und allelische Ungleichgewichte den primären Tumor aus der Metastase zu unterscheiden
haben wir festgestellt größeren Maßstab genomische Aberrationen, die die primäre von der Metastase (2b und 3a) unterschieden. Dazu gehörten Kopienzahl Veränderungen und LOH Ereignisse. Einzigartig für den Primärtumor wurden zwei genomische Amplifikationen auf den Chromosomen 5 und 10 und zwei Inversionen auf den Chromosomen 15 und 16 (Zusatzdatei 1: Tabelle S4). Das Chromosom 10 Verstärkung bedeckt eine 1,66 Mb-Intervall. Wenn Deletionen oder allelische Ungleichgewicht unter Berücksichtigung der einzige große Ereignis, das festgestellt wurde ein Verlust des p Arm von 3 Genetische Divergenz des ovarian Metastasierung von der primären Magenkrebs für kritische Kandidaten Treiber Chromosom 17 beteiligt. Die genomische Position der Mutation, die Kopienzahl Variationen (CNV) Regionen oder Verlust der Heterozygotie (LOH) Intervalle werden von den Krebsgenome gezeigt. Für die Chromosomen Plots bezeichnet die Y-Achsenposition mit dem jeweiligen Chromosom, dessen Länge in Megabasen (MB) und Ideogramm Bezeichnung links von der Kopienzahl Profil gezeigt. Schädliche Mutationen werden als boxed Pfeile mit dem Gen-Symbol angezeigt. (A) Das Genom breite Verteilung von krebsspezifischen CNV und LOH-Intervalle werden über alle Chromosomen für den Primärtumor und Metastasen zusammengefasst. (B) auf dem Chromosom 3 hatte die Metastasierung einzigartige biallelic Ereignisse eine schädliche TGFBR2
Mutation beteiligt und eine genomische Deletion, bei der anderen Allel zu beeinflussen, wie am deutlichsten mit LOH Abständen gesehen. Sekundäre genomische Deletionen, LOH wird als eine Verschiebung in der Neben Allelfrequenz Verhältniswert von -1 gezeigt und korreliert mit einer genomischen Deletion. (C) auf dem Chromosom 10 wurde die FGFR2-
Gen in einer genomischen Amplifikation Region nur in der primären und nicht die Metastasierung gesehen. Die Verstärkung in einem roten Kreis gekennzeichnet. Im Gegensatz zu dem Primärtumor
, das metastatische Tumor 12 verschiedenen Chromosomen zahlreiche Chromosomen Skala LOH Ereignisse und genomische Deletionen hatte beeinflussen, von denen die meisten einzigartig für die metastatische Tumor waren (Figur 2) . Dazu gehörten mehrere Deletionen und kopieren Ereignisse neutral LOH, die 1 in den weiteren Datei aufgeführt sind: Tabelle S3. Es gab eine fünffache genomische Amplifikation in Chromosom 2, aber keine spezifischen bekannten Gene gab es in dem betroffenen Intervall. Es gab keine nachweisbare inter-chromosomale Translokation entweder in der Primärtumor oder Metastasen Genome. Andere Krebs Umlagerungen wurden identifiziert, aber deutete nicht auf Abweichungen in irgendwelchen Kandidaten Treiber Gene (Zusätzliche Datei 1: Tabelle S4). Es gab Anzeichen von großen genomische Instabilität, basierend auf allelische Ungleichgewicht Analyse; Chromosomen 14, 17, 20 und 22 alle das gesamte Chromosom beteiligt.
Für Kopienzahl Aberrationen und allelische Ungleichgewichte identifizierten wir im Vergleich zu gemeinsamen Veranstaltungen zwischen dem Primärtumor und Metastasen exklusiv. Die einzige gemeinsame genetische Aberration beteiligt den p Arm des Chromosoms 17. Insgesamt ist die fehlende Überlappung indikativ war signifikante genetische Divergenz vom Primärtumor und Metastasen trotz eines gemeinsamen Ursprungs wie in kritischen Tumorsuppressoren durch gemeinsame Mutationen bezeichnet.
Die genomische Intervalle der LOH, Kopienzahl Aberration und Umlagerungs Ereignisse wurden mit der Position des validierten Genmutationen verglichen. Diese integrierte Analyse wies auf eine Reihe von Genen, die biallelischen Veränderungen, die sowohl einen Verlust des Wildtyp-Allels aus einer großen Intervall genomische Aberration und ein mutiertes Allel hatten. Die Ergebnisse für Gene mit biallelic Treffer wurden als starke Kandidaten für eine loss-of-function Beteiligung an Krebs (Tabelle 1).
Identifizierung von Krebs Fahrer gemeinsam mit dem Primärtumor und Metastasen zu sein
Sowohl die primäre und die Metastasierung enthalten Krebs Fahrer Ereignisse, die für die Tumorentstehung in Zusammenhang mit der anfänglichen CDH1
Mutation (Tabelle 1, Abbildung 2) wahrscheinlich zu sein kritisch waren. Neben der Intron-Mutation
Keimbahn CDH1, hatte das zweite CDH1
Allels eine somatische 77 bp genomische Deletion eines Teils von Exon 9, die auch die Downstream-kodierenden Regionen auswirkt. Die CDH1
somatische Mutation war identisch in den beiden primären und metastatischen Magenkrebs Genome, eine gemeinsame genetische Herkunft zeigen und starke genetische Beweise bieten, dass dieser Treiber bei diffusem Magen tumorigenesis eine entscheidende Rolle hatte. Mutationen beeinflussen CDH1
Exon 9, die zum Verlust der Proteinexpression führen haben häufig bei diffusem Magenkrebs festgestellt worden [18] - [20]. Diese Aminosäure ist Exon-Sequenz ist eine mutmaßliche Calcium-Bindungsstelle, die für die Rezeptorfunktion wahrscheinlich wichtig ist es, die primären und metastatischen Tumor
auch geteilt biallelic Spleißdonorstelle Mutation. (C.559 + 1G > A) des fünften Intron TP53
und ein Chromosom 17p LOH Veranstaltung umfasst die TP53
Locus (Zusätzliche Datei 1: Abbildung S1). Die TP53
Splicing Mutation RNA-Splicing unterbricht [21] und ein zuvor Krebs Mutation berichtet [22], [23]. Die Analysen von sporadischen und ererbten Magenkrebs haben TP53
Mutationen identifiziert, die gleichzeitig mit CDH1
Mutation auftreten [24], [25]. CDH1
Inaktivierung in Magenparietalzellen nicht induziert Magenkarzinom, was darauf hindeutet, dass der Verlust von CDH1
für Tumor Einleitung unzureichend ist [26]. Allerdings Doppel Knockout von CDH1
und TP53
Entwicklung von diffusem Magenkarzinom induziert [26]. Interessanterweise wurde die genomische Intervall des LOH Ereignis den TP53-Locus
beeinflussen größer in der Metastasierung im Vergleich zu dem Primärtumor. Dies könnte die starke Selektion für biallelic Verlust der TP53-Funktion, weil unabhängiger genomische Instabilität Ereignisse gegeben aufgetreten sind.
FGFRis einen einklagbaren Krebstreiber exklusiv für den primären Magentumor
im Primärtumor, gab es eine sechsfache genomischer Amplifikation einer Region von 10 q Arm Chromosom und bedeckt ein Intervall von 1,66 Mb. Innerhalb dieser genomischen Regionen war ein onkogener Kandidaten Fahrer FGFR2
auch als Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (Abbildung 3c) bezeichnet. Dies wurde mit mehreren Methoden, einschließlich Sequenzierung, Array-Analyse bestätigt, und die Validierung durch quantitative PCR. FGFR2- ist ein Transmembranrezeptor, der aus einem Schlüssel Signaltransduktionsweg fungiert als Teil Reparaturgewebe zu regulieren und die embryonale Entwicklung unter vielen anderen Funktionen [26].
Zur Bestimmung der Prävalenz von FGFR2-
Verstärkung in diffundieren gegen Darm-Magen-Krebs zu validieren analysierten wir 37 diffuse und 27 Darm-Subtyp primären Magentumorproben mit digitalen PCR [27]. Zuvor haben wir gezeigt, dass dieses Verfahren zum Nachweis von Aberration Kopienzahl auch im Rahmen der normalen diploiden DNA verdünnenden Tumor DNA tief empfindlich ist. Unsere Studie hat gezeigt, FGFR2
Amplifikation in vier von 37 (11%) diffuse Tumorproben, die in den Darmproben Subtyps (4a) nicht anwesend ist. Figur 4 Prävalenz FGFR2 in menschlichen Magentumoren und deren Beitrag zur Zellproliferation. (A) Sporadische Magenkrebs Proben wurden durch quantitative digitale PCR ausgewertet FGFR2- genomische Kopienzahl zu bestimmen. Schwarze Punkte repräsentieren diffuse Magenkarzinome. Rote Punkte zeigen den Darm-Subtyp von Magenkrebs. (B) Genetische Merkmale der AGS (FGFR2-
diploiden) und KatoIII (FGFR2- verstärkt) Magenkrebs-Zelllinien gezeigt werden. (C) Prozent Überleben für die AGS-Krebszelllinie mit FGFR2- Inhibitoren unterschiedlicher Spezifität gezeigt. (D) Die KatoIII Magenkrebs-Zelllinie diffundieren wurde mit FGFR2- Inhibitoren unterschiedlicher Spezifität behandelt. Die Y-Achse zeigt das prozentuale Überleben im Vergleich zu
der X-Achse mit Log-Konzentrationen. In allen Panels stellen Fehlerbalken Standardfehler des Mittelwerts. Die Differenz in Prozent Überleben der Zelle zwischen KatoIII und AGS-Zellen war statistisch signifikant (P
< 0,05). Bei den drei höchsten Konzentrationen aller Medikamente, mit Ausnahme Brivanib, die bei der höchsten Konzentration nur signifikant war
Zur Unterstützung ihrer Rolle als Kandidat Treiber ist FGFR2
Verstärkung in einer Anzahl von Magenkrebs-Zelllinien [28], [29] und anschließend in verschiedenen gastrointestinalen Tumoren wie Adenokarzinom des Ösophagus berichtet [30]. Zusätzlich Behandlung von Krebszelllinien mit FGFR2 spezifischen kleinen Molekülinhibitoren oder shRNAs führt zu potenter Wachstumshemmung [28] eine funktionelle Rolle für FGFR2
Verstärkung im diffuse Subtyps hindeutet.
Funktionsanalyse des FGFR2-Treiber in Kombination mit CDH1 und TP53 kaufen Wir zwei Beispiele eines primären diffusen Magenkrebs mit Co-Auftreten von bekannten und mutmaßlichen Krebs Fahrer beteiligt CDH1
identifiziert, TP53
und FGFR2-
wie beim Indexpatienten gesehen . Das erste Beispiel umfasste eine diffuse Magenkrebs Probe, die unter den Magen-Adenokarzinome war von TCGA analysiert. Verwendung des CBio TCGA Portal [10], identifizierten wir einen Patienten (TCGA-BR-6803), die einen ähnlichen genetischen Komplement von Aberrationen in CDH1
hatte, TP53
und FGFR2
, von denen alle gewesen zuvor in der Krebstherapie beschrieben, wie in der COSMIC Krebs Mutation Repository gesehen. Dazu gehörten die folgenden: a Missense-Mutation in CDH1
(D254Y), die in drei anderen Krebsarten beschrieben wurde; eine Missense-Mutation (L130F) in TP53
wo Mutationen in diesem Codon haben in 37 anderen Krebsarten berichtet; die FGFR2
Verstärkung, die wir und andere in diffuse Magenkrebs identifiziert haben. Als zweites Beispiel
identifizierten wir eine menschliche Magenkrebszelllinie, KatoIII diffundieren, die eine ähnliche Zusammensetzung der genetischen Aberrationen hat die gleichen Krebsgene zu beeinflussen als Primärtumor unserer Indexpatienten. KatoIII hat eine CDH1
Mutation zu einer Intron-Sequenz Insertion in der mRNA führt [31], [32], eine TP53-Mail an einen vollständigen Gen-Deletion führende Mutation [33] und die FGFR2-
Verstärkung [29] (Abbildung 4b). Diese Zelllinie erlaubt uns, das Potenzial onkogene Rolle der FGFR2-
Verstärkung im spezifischen genetischen Zusammenhang mit CDH1
und TP53
Mutationen, ähnlich dem Index des Patienten Primärtumor zu bewerten.
Der Beitrag zu bestimmen, von FGFR zu neoplastischem Wachstum Signalisierungs behandelten wir KatoIII Zellen mit mehreren FGFR2 kleines Molekül Tyrosin-Kinase-Inhibitoren (TKI), einschließlich Brivanib, TKI258, Ponatinib und AZD4547 [34]. Als Kontrolle verwendeten wir die Magenkrebszelllinie AGS, die für FGFR2-
, CDH1
Wildtyp ist, und TP53
, hat aber Mutationen in KRAS
und PIK3CA
[35] ( Abbildung 4b). Alle FGFR2 Inhibitoren induzierten Zelltod in KatoIII aber nicht AGS-Zellen (Abbildung 4c und d). Das potenteste dieser TKIs, AZD4547, hat eine IC 50 von etwa 2 nM in KatoIII Zellen und 39.580 nM in AGS-Zellen (Abbildung 4c und d). Jede der Inhibitoren zeigten eine statistisch signifikant niedrigere IC 50 in FGFR2--verstärkten KatoIII Zellen im Vergleich zu nicht-FGFR2--amplifizierte AGS-Zellen bei allen getesteten Konzentrationen (4c und d).
Dagegen Behandlung von KatoIII und AGS-Zellen mit zytotoxischen Chemotherapeutika wie Paclitaxel, 5-Fluorouracil und Carboplatin hatte keinen signifikanten Einfluss auf KatoIII oder AGS-Linien, mit ähnlichen IC 50 in jeder identifizierten (Zusätzliche Datei 1: Tabelle S7). AZD4547 für die 20.000-fachen Unterschied in der Empfindlichkeit Inhibitoren FGFR legt nahe, dass FGF-Signalisierung einen kritischen Treiber CDH1
leitete Magenzellproliferation und diese TKI stellt eine potentielle gezielte Therapie in diffuse Subtyps Krebsen beherbergen FGFR2
Amplifikationen.
Biallelische Inaktivierung von TGFBRis exklusiv für die ovarian Metastasierung
genetische Divergenz war offensichtlich;

• Botulinumtoxin im Magen-Submukosa reduziert stimulierte HCl-Produktion in Ratten
• Vorhersage von metachrone mehrere primäre Tumoren nach kurativer Resektion von Magenkrebs