Das Herunterregulieren der SPARC-Expression verringert Magenkrebs Zellinvasion und survival

Herabregulation von SPARC Ausdruck Magenkrebs Zellinvasion und Überleben
Zusammenfassung
Hintergrund nimmt
sezerniertes Protein sauer und reich an Cystein (SPARC) spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung vieler Gewebe und Organtypen. Aberrant SPARC-Expression wurde in einer Vielzahl von menschlichen Krebserkrankungen, trägt zur Entwicklung von Tumoren gefunden. Da SPARC gefunden wurde in menschlichen Magenkrebsgewebe überexprimiert werden wir daher wurde die Expression von SPARC in Magenkrebs Linien und die karzinogenen Mechanismen.
Methods
SPARC-Expression in einer Reihe von menschlichen Magenkrebszelllinien ausgewertet zu erkunden . MGC803 und HGC 27 Magenkrebs-Zelllinien hohe SPARC exprimieren, wurden mit SPARC-spezifischen small interfering RNAs transient und anschließend ausgewertet werden für Auswirkungen auf die Invasion und Proliferation.
Ergebnisse | Small RNA-vermittelten Knockdown von SPARC in MGC803 stören und HGC 27 Magenkrebszellen dramatisch verringert ihre Invasion. Preissturz von SPARC wurde auch mit Kontrolle transfizierten Gruppe beobachtet, um die Apoptose von MGC803 und HGC verglichen Magenkrebszellen 27 deutlich erhöhen.
Schlussfolgerungen
Unsere Daten zeigten, dass der SPARC Herunterregulieren Invasion und Wachstum von menschlichen Magenkrebszellen hemmt. So Targeting von SPARC könnte eine wirksame Therapieansatz gegen Magenkrebs sein.
Einführung
Magenkrebs ist die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle weltweit und ist einer der aggressivsten Tumoren und wird häufig mit Lymphknoten assoziiert Metastasierung, Peritonealdialyse Verbreitung und hämatogene Metastasierung [1]. Im Großen und Ganzen 65-70% der neuen Fälle und Todesfälle aufgrund von Magenkrebs treten in weniger entwickelten Ländern [2]. Im Jahr 2005 sind die Inzidenzraten von Magenkrebs (0,3 Mio. Todesfälle und 0,4 Millionen neue Fälle) den dritten Platz unter den häufigsten Krebsarten in China [3]. Gegenwärtige Therapien für fortgeschrittenen Stadium oder metastasierten Magenkrebs haben wenig Wirkung, chirurgische Entfernung mit Resektion von benachbarten Lymphknoten die einzige Chance auf Heilung bietet, die weniger als 33% der Patienten mit Magenkrebs ist. Die 5-Jahres-Überlebensrate beträgt nur 30-40%, mit einer schlechteren Prognose für fortgeschrittenen Tumoren. die molekularen Mechanismen, um das Fortschreiten von Magenkrebs Verständnis zugrunde liegenden können Einblicke in die neue therapeutische Targets bereitzustellen
sezerniertes Protein sauer und reich an Cystein (SPARC, auch als Osteonectin oder BM-40 bezeichnet). gehört zur matrizelluläre Familie von sekretierten Proteinen [4 ]. SPARC ist eine nicht-strukturelle Komponente der extrazellulären Matrix, die Zell-Matrix-Interaktionen moduliert, insbesondere während der Gewebeentwicklung, Umbau und Reparatur [5]. Viele Krebsarten sind durch hochregulierten Expression von SPARC gekennzeichnet [6]. Überexpression von SPARC wurde in verschiedenen Arten von festen Tumoren, wie Brust- [7], Prostata [8], Melanom [9] und Glioblastome [10] dokumentiert. Im Gegensatz dazu den unteren Ebenen der SPARC-Expression wurden in anderen Arten von Krebs, wie Eierstock- [11], colorectal [12], Bauchspeicheldrüsen [13, 14] und akute myeloische Leukämie [15] zu finden. Diese Beobachtungen legen nahe, dass tumorigenen Wirkung von SPARC Zelltyp spezifisch ist, und kann von der Tumorzelle umgebenden Umwelt abhängig sein.
Die Kenntnisse über SPARC-Funktionen in Magenkrebszellen noch sehr dünn. Die Überexpression des SPARC-Gen wurde in menschlichen Magenkrebs in fünf anderen Berichten [16-20] beobachtet. Jedoch alle oben genannten Studien hatten keine Detail in Magenkrebszelllinien und karzinogene Mechanismus. SPARC wurde mit aggressiven Phasen von Magenkrebs assoziiert und ist mit einer schlechten Prognose korreliert [16], was darauf hindeutet, dass die Reduktion der Expression SPARC therapeutischen Nutzen haben können. Tatsächlich Expression von Antisense-Oligonukleotide gegen SPARC in Melanomzellen blockiert Tumorbildung [21]. Die genauen biologischen und molekularen Mechanismen, durch die eine Verringerung der SPARC-Expression zu einer verbesserten Tumortherapie beitragen könnte weiterhin untersucht werden. Daher war es das Ziel der vorliegenden Studie SPARC-Funktionen in Magenkrebszellen zu charakterisieren und seine möglicherweise karzinogen Mechanismus erforschen.
Materialien und Methoden
Zellkultur
menschlichen Magenkrebszelllinien NCI-N87, SGC7901, MGC803 , BGC823, HGC27 wurden aus dem Cancer Institute der chinesischen Akademie der Medizinischen Wissenschaften erhalten. Alle Zellen wurden in RMPI 1640 (GIBCO ™) -Medium mit 10% fötalem Rinderserum, Penicillin G (100 Einheiten /ml) und Streptomycin (100 ug /ml) bezeichnet Komplettmedium ergänzt war. Die Zellen wurden in Monolayerkultur bei 37 ° C in befeuchteter Luft mit 5% CO 2.
Chemikalien und Reagenzien
EDTA-2-Natrium, Acridinorange, Ethidiumbromid (EB) und 3- [4 gehalten wird, 5-Dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl tetrazoliumbromide (MTT) wurden von Sigma (St Louis, MO, USA) erworben. Maus monoklonaler Antikörper spezifisch für &bgr; -Actin wurde von Sigma. Kaninchen polyklonalen Antikörper, die spezifisch an Bcl-2 (sc-492), Caspase-3 (sc-7148) und PARP (sc-7150) wurden von Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) gekauft. Maus monoklonaler Antikörper spezifisch für SPARC (sc-74295) und Bax (sc-7480) wurden von Santa Cruz Biotechnology erhalten. Ziege anti-Kaninchen (w3960) und Anti-Maus (w3950) sekundäre Antikörper wurden von Promega bezogen (Madison, WI, USA).
RNAi und Transfektion
Mensch SPARC siRNA und Kontroll-siRNA waren von Dharmacon Bioscience Corp (Chicago , IL, USA). Äquimolare Mengen von siRNAs wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet, um mit Steuer nicht Targeting siRNA (CTRL). 150 000 Zellen wurden pro sechs Vertiefungen in DMEM mit 10% FBS ausplattiert und über Nacht anheften gelassen. Äquimolare Mengen von siRNAs wurden mit TRANSIT-TKO Transfektionsreagenz von Mirus (Madison, WI, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers inkubiert. Zellen wurden 48 h vor der Experimente gehalten, wenn nicht anders
Western Blot-Analyse beschrieben
Zwanzig Mikrogramm Gesamt-Proteine ​​durch SDS-PAGE und auf eine PVDF Membran getrennt. Die Membran wurde dann mit Antikörpern, die spezifisch für SPARC inkubiert (Santa Cruz; 1: 500) oder anti-β-Actin (Sigma, 1: 1000) über Nacht bei 4 ° C. Gebundene Antikörper wurden unter Verwendung von verstärkter Chemilumineszenz sichtbar gemacht. Gleich Beladung zu bestätigen, wurden die Membranen bei 50 ° C für 30 Minuten abgestreift in Puffer, enthaltend 2% SDS, 62,5 mM Tris (pH 6,7) und 100 mM 2-Mercaptoethanol und erneut sondiert mit einem anti-β-Actin-Antikörper gleiche Beladung zu demonstrieren . Die Dichte der Banden wurde durch densitometrische Analyse quantifiziert, um die Image Tool (Version 3.0) System.
RT-PCR
Gesamt-RNA (1-2 ug) wurde revers transkribiert unter Verwendung eines Superscript Pre-Amplification Kit (Invitrogen, Carlsbad , CA). Die Primer wurden basierend auf berichteten Sequenzen auf Genbank (NM 003118). SPARC Sense-Sequenz war 5'-GTGGGCAAAGGGAAGTAACA-3 'und SPARC anti-sense Sequenz 5'-GGGAGGGTGAAGAAAAGGAG-3'. Die erwartete Produktgröße von SPARC cDNA war 512bp. ß-Actin-sense-Sequenz war 5'-GGCATCCTCACCCTGAAGTA-3 'und ß-Actin-Antisense-Sequenz 5'-GTCAGG CAGCTCGTAGCTCT-3'. Die erwartete Produktgröße von ß-Actin-cDNA war 514bp. PCR-Amplifikation wurde in 25 &mgr; l Reaktionsvolumen, enthaltend 0,2 &mgr; M dNTPs, 20 pmol jedes Oligonucleotidprimers und 0,2 U Taq-Polymerase in PCR-Puffer durchgeführt. cDNA wurde für 5 min bei 95 ° C auf einem PCR Thermal-Controller mit einer anfänglichen Denaturierung amplifiziert, gefolgt von Zyklen von 95 ° C für 1 min, 65ºC für 1 min und 72ºC für 1 min, 27 Zyklen, und ein abschließender Verlängerungsschritt von 72 ° C für 10 min. Die Menge an cDNA ausgehend wurde mit β-Aktin-Intensität eingestellt.
Zellmigration Assay
Die Fähigkeit von Zellen durch Filter zu migrieren wurde eine BioCoat Matrigel Invasionskammer gemessen (BD Biosciences, San Jose, CA). Zellkultur-Einsätze mit einem 8 &mgr; m Porengrße PET-Membran nach dem Protokoll des Herstellers verwendet wurden. Die untere Kammer eingeschlossen Medium (0,75 ml) 10% FCS enthält, während SPARC siRNA transfizierten oder Kontrolle transfizierten Zellen (1,0 × 10 5 in 0,5 ml Medium suspendiert, das 1% FCS) wurden in die obere Kammer ausgesät und über Nacht inkubiert bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2. Remaning Zellen auf der oberen Oberfläche wurden mechanisch entfernt. Die Membranen wurden dann gewaschen, fixiert und gefärbt durch Diff-Quik (Medion Diagnostics). Die Anzahl der Zellen, die an der unteren Oberfläche der Filter migriert wurde in drei unabhängigen Feldern (0,25 mm 2 /well) durch Zählen von gefärbten Zellen unter einem Lichtmikroskop bestimmt.
Zellwachstum und Lebensfähigkeitstest
der Wirkung von SPARC SiRNA auf die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch den MTT-Test bestimmt. Kurz gesagt, wurden MGC803 und HGC 27-Zellen bei 1 × 10 4 Zellen pro Vertiefung in sechsundneunzig-Well-Mikrotiterplatten plattiert. Nach Inkubation für 72 h wurde die Lebensfähigkeit der Zellen bestimmt. Dann wurden 20 ul MTT (10 mg /ml in PBS Lager, verdünnt auf Arbeitskonzentration von 1 mg /ml mit Medien) wurde in jede Vertiefung gegeben und für 4 h inkubiert. Nach sorgfältiger Entfernung des Mediums wurden 200 &mgr; l Dimethylsulfoxid in jede Vertiefung und geschüttelt vorsichtig zugegeben. Die Extinktion wurde auf dem Mikrotiterplatten-Lesegerät aufgezeichnet (ELX 800; Bio-Tek Instruments, Inc. Winooski, VT, USA) bei einer Wellenlänge 570 nm. Die Wirkung der SPARC-siRNA auf Hemmung des Zellwachstums als Prozentsatz der Lebensfähigkeit der Zellen beurteilt wurde, in dem Vehikel behandelten Zellen als 100% lebensfähig.
Zellzyklus-Analyse und Annexin V-Färbung
genommen wurden für Zellzyklusanalyse durchflusszytometrischen, behandelt die Zellen mit siRNA wurden gesammelt, mit PBS gewaschen und in kaltem 70% igem Ethanol fixiert und bei -20 ° C bis zur Färbung gelagert. Nach der Fixierung wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit 50 ug /mL RNaseA (Sigma) für 30 min bei 37 ° C inkubiert, bevor sie mit 50 ug /mL Propidiumiodid (Sigma) -Färbung. Apoptotischen Zellen in frühen und späten Stadien wurden mit einem Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit von BioVision (Mountain View, CA, USA) nachgewiesen. Kurz gesagt, wurden die Zellen mit siRNA transfiziert. Bei 96 h nach der Transfektion, Kulturmedien und die Zellen wurden gesammelt und zentrifugiert. Nach dem Waschen wurden die Zellen in 490 &mgr; l Annexin V-Bindungspuffer, gefolgt von der Zugabe von 5 &mgr; l Annexin V-FITC und 5 &mgr; l Propidiumjodid resuspendiert. Die Proben wurden im Dunkeln für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Statistik
Die Ergebnisse wurden ausgedrückt als Expressionsniveaus bedeuten (± SD). Student t
-test oder Rangsummentest wurden für die statistische Analyse verwendet. Ein p-Wert < 0,05 wurde als Signifikanzniveau (zweiseitig).
Ergebnisse | Expression von SPARC in kultivierten Magenkrebszellen entnommen kaufen Wir zunächst die endogene Expression von SPARC in mehreren menschlichen Magenkrebszelllinien untersucht. Wir fanden, dass SPARC-Protein und mRNA in MGC803 und HGC27 Zellen vorherrschend waren, auf einem niedrigeren Niveau durch SGC7901 Zellinie wurden in NCI-N87 und BGC823 Zelllinien (Abbildung 1) undectable hergestellt wurden. Abbildung 1: Expression von SPARC in Magenkrebs-Zelllinien. A, Immunoblot-Analyse unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-SPARC-Antikörper (1: 500). B, Specific Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) -Analyse für SPARC. ß-Aktin wurde als Ladekontrolle verwendet. C, relative SPARC mRNA Expression. Autoradiographien wurden durch Densitometrie durch Quantifizierung in Bezug auf &bgr; -Actin gefolgt gescannt und analysiert. Die Ergebnisse werden als Ausdruck (in%) gegenüber &bgr; -Actin und sind Mittelwerte (± SD) von 3 Experimenten gezeigt.
Hemmung der endogenen Expression SPARC
diese anfängliche Screening-Folgen, MGC803 Zellen und HGC27 exprimierenden Zellen relativ hohe endogene SPARC wurden Knockdown etabliert SPARC exprimieren in einer vorübergehenden Weise die Bedeutung der endogenen SPARC-Expression zu bestimmen. Wie in 2A gezeigt, wurde SPARC-Expression mit SPARC siRNA Transfektanten in Proteinspiegel inhibiert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass diese SPARC siRNAs erfolgreich eine Schalldämpfungseffekt für SPARC-Expression ausüben. Abbildung 2: Wirkung von SPARC Knockdown auf die Zellmigration in Magenkrebs-Zelllinien MGC 803 und HGC 27 Zellen. A. Expression in SPARC MGC 803 und 27 HGC, Kontrolle und SPARC siRNA transfizierten Zellen wurde durch Immunoblot-Analyse nachgewiesen einen polyklonalen Kaninchen-SPARC-Antikörper (1: 500). ß-Aktin wurde als Ladekontrolle verwendet. B. Wirkungen von SPARC Knockdown auf die Zellmigration in Magenkrebs-Zelllinien. SPARC-Expression wurde in MGC 803 und HGC 27 Zellen unter Verwendung von SPARC siRNA gestellt und einer Migrationstest unter Verwendung eines Zweikammer-invasion Vorrichtung, wie beschrieben in Materialien und Methoden, Histogramm zeigt die prozentuale Inhibierung der MGC 803 und HGC 27 Zellinvasion umgeworfen. Das Experiment wurde in dreifacher Ausfertigung und der Wert von verschlüsselten siRNA transfizierten Zellen wurde als 100% gesetzt erhalten getan.
Herabregulation von SPARC Ausdruck Magenkrebszellen Invasion gehemmt in vitro
Um festzustellen, ob SPARC siRNA protumorigenic zelluläre Verhalten reduzieren könnte im Zusammenhang mit SPARC Ausdruck, stellten wir fest, zunächst die Wirkung der verminderten SPARC-Expression auf Tumorzellinvasion. Zellinvasionstest wurden dann Transwell Kammern durchgeführt werden. Wir maßen die Kapazität von Magenkrebszellen durch Matrigel, eine künstliche extrazelluläre Matrix, nach der Transfektion mit einem nicht-Targeting-Kontroll-siRNA oder SPARC siRNA einzudringen. Verminderte SPARC die Expression auf die Hemmung der Invasion von 69% und 79% in MGC803 und HGC27, bzw. (2B, C) geführt. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse deutlich, dass die Unterdrückung von SPARC die Migration und Invasion Fähigkeit von MGC803 Zellen und HGC27 Zellen hemmt.
Herabregulation von SPARC-Expression hemmt das Wachstum von Magenkrebszellen in vitro kaufen Wir untersuchten, ob SPARC siRNA die Abnahme könnte Überleben von Magenkrebszellen. MGC 803 und HGC 27 Magenkrebszellen mit SPARC-siRNA transfizierten überlebte mit Raten in Bezug auf abgestimmte Zellen verringert transfiziert mit einem nicht-Targeting-Kontroll-siRNA (3A). Das Herunterregulieren der SPARC-Expression nicht die Zellzyklusarrest in Magenkrebszellen induzieren. Wir untersuchten die Auswirkungen von SPARC siRNA auf die Zellzyklusprogression. Silencing von SPARC in MGC803 und HGC27 Zellen nicht G1 oder S-Phase ändern Populationen bei 72 Stunden nach der Transfektion mit SPARC siRNA im Vergleich mit der negativen Kontrollgruppe (3B). Abbildung 3 Effekte von SPARC Knockdown auf das Zellwachstum bei Magenkrebs-Zelllinien. Die linke Hälfte Daten stellen Daten von MGC 803-Zellen erhalten und die richtigen Daten darstellen, von HGC 27-Zellen erhalten. A. Basal Wachstum wurde nach 48 h in vollständigem Medium durch den MTT-Test bestimmt. Die Ergebnisse sind als mittlere Wachstums (in%) des jeweiligen MGC 803 und HGC 27 Zelllinie und sind Mittelwerte (± SE) von vierfachen Bestimmungen aus sechs getrennten Experimenten gezeigt. Zellen aus der siRNA und Kontrollgruppen wurden für Zytometrie Zellzyklusanalyse gesammelt. B. Silencing von SPARC durch siRNA-Transfektion nicht Zellzyklus-Verteilung in MGC 803 und HGC 27 Zellen Magenkrebs ändern. MGC 803 und HGC 27 Zellen wurden mit SPARC-siRNA oder negativen Kontroll-siRNA transfiziert. Bei 72 h nach der Transfektion wurde die DNA-Gehalt-Zytometrie unter Verwendung von Propidiumiodid (PI) Färbung auf Fluss gemessen.
Hemmung der SPARC-Expression Apoptose in Magenkrebszellen verbessert kaufen Wir untersuchten, ob SPARC siRNA Zelltod bei Magenkrebs auslösen können Zelllinien. Die Behandlung von MGC803 und HGC27 Zellen mit siRNA SPARC erhöht frühen apoptotischen Zellen sowie späten apoptotischen Zellen im Vergleich zu negativen Kontrolle siRNA-Behandlung (4A), wie durch die Annexin V-Assay gemessen. Wie erwartet, war die verringerte das Überleben der mit SPARC siRNA transfizierten Zellen mit einer erhöhten Apoptoseraten um 91% in MGC803 und 92% in HGC27 Zellen (4B) verbunden ist. Diese Ergebnisse legen nahe, dass SPARC in der Apoptose beteiligt ist, zelluläre Überleben in einigen Magenkrebszellen zu halten. Abbildung 4 SPARC Knockdown Ergebnisse in Induktion von Apoptose bei Magenkrebs-Zelllinien. Für durchflusszytometrische Analyse wurden die Zellen 96 Stunden nach der Transfektion mit SPARC-siRNA oder negative Kontrolle siRNA geerntet, dann mit Annexin V-FITC und Propidiumiodid (PI) gefärbt. Die linke Hälfte Daten stellen Daten von MGC 803-Zellen erhalten und die richtigen Daten darstellen, von HGC 27-Zellen erhalten. Der prozentuale Anteil der Annexin V /PI (frühe apoptotische) und Annexin V /PI (spät apoptotischen Zellen) wird in jeder Tafel gezeigt. Die fettgedruckten Werte SPARC Ausdruck deuten Abnahme erhöhte Apoptose um 65% in MGC803 und 92% in HGC27 verglichen mit negativen Kontroll-siRNA.
Apoptotische Wirkung von SPARC siRNA transfizierten Behandlung in MGC 803 und HGC27 Zellen
In dem Bemühen, die zur Aufklärung Mechanismus der SPARC siRNA induzierte Apoptose in MGC 803 Zellen und HGC27 Zellen, Expression von apoptotischen Regulation Proteinen wie Bcl-2, Bax und Caspase-3 und PARP wurden ausgewertet. MGC 803 Zellen und HGC27 Zellen wurden mit SPARC-siRNA transfiziert. Wie in Figur 5 gezeigt ist, gab es signifikante Unterschiede in den Ausdrücken von Bax und Bcl-2 in MGC 803 Zellen und HGC27 Zellen im Vergleich mit der negativen Kontrollgruppe (P < 0,05 und P < 0,01). In Reaktion auf apoptotische Stimuli Procaspase-3 wird in ein Fragment 20 kDa gespalten, und die anschließende autokatalytisch Reaktion führt zur Bildung des aktiven 17 kDa-Fragment. Wenn die Caspase-3 aktiviert wird, wird PARP gespalten. So Spaltung von PARP als Indikator der Apoptose verwendet. Um das Verhältnis von Caspase-Aktivierung und Apoptose direkten Beweis zeigt, procaspase-3-Spaltung und PARP zu erhalten wurden in MGC 803 Zellen und HGC27 Zellen nach der SPARC-siRNA transfiziert sucht. Wie in 5 gezeigt, SPARC SiRNA die Spaltung von 32 kDa Procaspase-3 in seine aktive 17 kDa Form und Spaltung von PARP erschienen in MGC 803 Zellen und HGC27 Zellen induziert. Abbildung 5 Die Expression von Apoptose-Proteine ​​in MGC 803 und HGC27 Zellen nach der Transfektion mit entweder Kontrolle oder SPARC-siRNA. Die Zelllysate wurden auf 10% SDS-PAGE-Gel aufgetrennt, auf Nitrocellulosemembran transferiert und sondiert mit anti-PARP, Anti-Caspase-3, anti-Bcl-2 und anti-Bax. Proteingehalte wurden durch Sondieren der gleichen Membran mit anti-β-Actin normalisiert. . Die linke Hälfte Daten stellen Daten von MGC erhalten 803 Zellen und die richtigen Daten darstellen, von HGC 27-Zellen erhalten
Diskussion
sezerniertes Protein und reich an Cystein, SPARC (auch als Osteonectin bekannt sind, oder Keller-Membran-40 BM-40), ist ein Mitglied einer Familie von matrizelluläre Proteine, deren Funktion es ist, ohne die Teilnahme an der Strukturgerüst der extrazellulären Matrix Zell-Matrix-Wechselwirkungen und Zell-Funktion zu modulieren. Überexpression von SPARC wurde in verschiedenen Arten von festen Tumoren, wie Brust- [7], Prostata [8], Melanom [9] und Glioblastome [10] dokumentiert. Im Gegensatz dazu den unteren Ebenen der SPARC-Expression wurden in anderen Arten von Krebs, wie Eierstock- [11], colorectal [12], Bauchspeicheldrüsen [13, 14] und akute myeloische Leukämie [15] zu finden. Diese Beobachtungen legen nahe, dass tumorigenen Wirkung von SPARC Zelltyp spezifisch ist, und kann von der Tumorzelle umgebenden Umwelt abhängig sein.
Die Kenntnisse über SPARC-Funktionen in Magenkrebszellen noch sehr dünn. Einige immunhistochemischen Untersuchungen [16-20, 22] berichtet gemeinsam eine Hochregulation von SPARC bei Magenkrebs im Vergleich mit nichtneoplastische Schleimhaut. Wewer et al. [17] beschrieben eine differentielle Expression von SPARC in den epithelialen und stromalen Fächer von sechs Magenkrebs Proben. Maeng [18] festgestellt, dass SPARC ist sehr in reaktiven Stroma exprimiert mit invasiven differenzierten Adenokarzinomen assoziiert und es kann als eine nützliche klinische diagnostische Marker für Magenkrebs dienen. Wang et al. [16] zu finden auch ein SPARC differentiell in Magenkrebs-Patienten, wie beurteilt exprimiert wurde durch Gen-Array-Analyse, quantitative RT-PCR und Immunfärbung höher SPARC die Expression signifikant mit Tumorprogression und den fortgeschrittenen Stadien von Magenkrebs in Verbindung gebracht. Franke et al. [20] zeigten, auf einer größeren Patienten Serie, dass SPARC differentiell in Magenkarzinome exprimiert und dass seine Expression korreliert mit der Tumorprogression und Knoten Ausbreitung unter Verwendung von Gewebe-Mikroarrays (TMA), der Grad der Expression von SPARC, durch Immunhistochemie bestimmt, korreliert in Darm-Typ Magenkrebs mit der lokalen Tumorwachstum, Knoten Ausbreitung und Tumorstadium nach der Internationalen Union gegen den Krebs. Zhao ZS et al. [19] festgestellt, dass SPARC wurde im Jahre 334 von 436 menschlichen Magenkrebsfälle entdeckt und wurde in 239 Tumoren stark exprimiert. In den Stufen I, II und III, die 5-Jahres-Überlebensrate von Patienten mit einer hohen Expression von SPARC war signifikant niedriger als bei Patienten mit niedriger Expression. Weitere multivariaten Analyse vorgeschlagen, dass Hochregulation von SPARC, MMP-2 und Integrin beta 1, für die Krankheit unabhängiger prognostischer Indikatoren waren.
Wir haben 49 Gewebe Magenkrebs gesammelt und entsprechenden normalen Geweben durch chirurgische Eingriffe (Jie Yin, Guowei Chen, Si Liu, Jianxun Zhao, Yucun Liu: Expression von SPARC in menschlichen Magenkrebs ist mit den klinisch-pathologischen Merkmale zugeordnet sind, eingereicht). Die Verteilung und die Expression von SPARC wurden durch Immunhistochemie, Western Blotting und RT-PCR beobachtet. SPARC-Protein und mRNA ausgedrückt signifikant höher als bei Magenkrebsgewebe im Vergleich zu normalen Geweben. Die Grade der Expression wurden mit der Differenzierung von Tumor, TNM Division, peritoneale Aussaat und Gefäßinvasion bemerkenswert verbunden. Patienten mit hoher Expression von SPARC haben schlechtere Prognose als solche mit niedrigen Expression von SPARC.
Zusammengenommen höhere SPARC-Expression signifikant mit Tumorprogression und fortgeschrittenen Stadien von Magenkrebs assoziiert war. Neuere Forschungen von Inoue M et al [23] auch SPARC als Kandidat Ziel-Antigen für die Immuntherapie von verschiedenen Tumoren einschließlich Magenkrebs durch genomweite cDNA-Microarray identifed. Es ist spannend, dass die Therapie der SPARC-Untereinheit Targeting kann ein sinnvoller Ansatz sein, um Magenkrebswachstum unterdrücken. Jedoch ist die molekularen Mechanismen, die für die Onkogenese von SPARC in Magenkrebs nicht vollständig verstanden. Durch Expressionsanalyse eines Panels von Magenkrebszelllinien zeigten wir, dass auch in SPARC Sevel menschlichen Magenkrebszelllinien überexprimiert wird. Deshalb testeten wir unsere Hypothesen, die SPARC ein Schlüsselmolekül bei Magenkrebs Invasion sein können, und dass Targeting SPARC eine neue therapeutische Strategie für Anti-Invasion von Magenkrebs darstellen können.
Verbreitung von Krebszellen, entweder lokal oder auf Fernmetastasen Sites erfordert, dass bösartige Zellen die Fähigkeit erwerben, die Basalmembran zu erobern und zu anderen Matrizen zu halten. Es wurde vorgeschlagen, dass SPARC eine Schlüsselrolle während der ersten Schritte im Prozess der Tumorinvasion und Metastasierung spielen kann [24]. Zusätzlich kann SPARC die Expression von Metalloproteinasen oder Enzyme induzieren, die anschließend eine wichtige Rolle beim Abbau der Basalmembranen und extrazellulären Matrixkomponenten [25] spielen. SPARC wurde mit der Invasivität von Meningiomen assoziiert [26, 27] und Gliomen [28]. Weiterhin Unterdrückung der SPARC-Expression Antisense-RNA gehemmt Motilität und Invasion von menschlichen Brustkrebszellen in vitro unter Verwendung von [21].
Um festzustellen, ob SPARC siRNA protumorigenic zelluläre Verhaltensweisen im Zusammenhang mit SPARC-Expression reduzieren konnte, stellten wir fest, zunächst die Wirkung der verminderten SPARC Expression auf Tumorzellinvasion. Wir maßen die Kapazität von Magenkrebszellen durch Matrigel, eine künstliche extrazelluläre Matrix, nach der Transfektion mit SPARC-siRNA oder einer nicht-Targeting-Kontroll-siRNA einzudringen. Verminderte SPARC die Expression auf die Hemmung der Invasion von 69% und 79% in MGC803 und HGC27 bzw. geführt. Somit kann SPARC siRNA in vitro Magenkrebs Invasion zu verringern.
Eine aktuelle Studie ergab, dass SPARC-Zellen von Stress-induzierten Apoptose in vitro durch eine Interaktion mit Integrin β1 Heterodimere schützt, die ILK-Aktivierung und prosurvival Aktivität [28] zu verbessern. Erste Studien Antisense-RNA-Strategien vollständig menschlichen Melanomwachstum in Nacktmäusen [21] außer Kraft gesetzt. Horie et al. [29] zeigten, dass die Herabregulation von SPARC Expression Wachstumshemmung mit G induziert 1 Arrest in menschlichen Melanomzellen. Es wurde berichtet, dass SPARC Gliom-Zellüberlebens durch Akt-Aktivierung durch Integrin-Signalisierung unter serumfreien Bedingungen [30] fördert. Diese Berichte deuten stark darauf hin, dass SPARC eine Rolle als Anti-Stress-Faktor spielt.
Auf der anderen Seite fanden einige Artikel, dass SPARC Apoptose in Krebszellen fördern kann. Yiu und Kollegen [11] haben gezeigt, dass exogene Behandlung verschiedener Eierstockkrebszelllinien mit SPARC-induzierte Apoptose. Said und Motamed [31] gefunden SPARC Exposition Caspase 3 in menschlichen Eierstockkrebszellen, die die frühere Beobachtung gestützt, gespalten erhöht. Pancreatic [13] und Ovarialkarzinome [30] zeigten mehr Wachstum und reduziert die Apoptose, wenn sie in SPARC implantiert - /-. In Darmkrebs-Zelllinien, die Überexpression von SPARC verminderte Lebensfähigkeit Zelle und verbesserte Apoptose in verschiedenen chemotherapeutischen Mitteln exponierten Zellen [32].
Diese scheinbar paradoxe Beobachtungen in jeder Art von Krebs und in verschiedenen Krebsarten können durch Tai Verständnis von SPARC erklärt werden Biologie [33]: kleinere Peptidfragmente von SPARC, die die verschiedenen Bereiche der SPARC verleihen biologischen Aktivitäten, die zu Zeiten, Protein denen anderer Fragmente oder der nativen SPARC entgegenzutreten. Da die Proteaseprofil der Tumor-Mikroumgebung kann in verschiedenen Arten von Krebs unterscheiden und als SPARC bekannt Proteolyse durch Matrix-Metalloproteinasen zu unterziehen, [34], dieser Unterschiede in Verbindung mit Änderungen in der lokalen Zusammensetzung der Matrix-Molekülen und Cytokine, können alle in verschiedenen Arten von Krebs beiträgt zum komplexen Verhalten SPARC sein.
um die Auswirkungen von SPARC siRNA auf Magenkrebszellwachstum, MTT-Proliferationstest wurde durchgeführt aufzuklären transfiziert, die Proliferation von SPARC siRNA transfizierten und Kontroll MGC803 und 27 HGC vergleichen, Zellen. MGC803 und HGC27 Magenkrebszellen mit SPARC-siRNA transfizierten überlebte mit Raten verringert relativ zu angepassten Zellen mit einem nicht-Targeting Kontrolle transfiziert siRNA (Abbildung 3). Die verminderte Überleben der mit SPARC-siRNA transfizierten Zellen wurde mit erhöhten Raten von Apoptose assoziiert, wie durch die Annexin V-Test gemessen. Eine Verringerung SPARC erhöhte Expression Apoptose um 91% in MGC803 und 92% in HGC27 (4B).
Aktive Caspasen eine wichtige Rolle bei der Induktion der Apoptose spielen. Wenn Caspase-3 aktiviert wurde, wird PARP Ende gespalten. Gewöhnlich die Spaltung von PARP wurde als Indikator der Apoptose verwendet. In der vorliegenden Studie haben wir festgestellt SPARC siRNA aktiviert Caspase-3 gespaltene Caspase-3 (p17) Fragmenten in MGC 803 Zellen und HGC 27 auf 48 h zu erzeugen. Zur gleichen Zeit wurde die Spaltung von PARP ebenfalls nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigen, dass SPARC Fragmentierung von PARP induziert sowie erhöhte Caspase-3-Aktivität in MGC 803 Zellen.
Die Bcl-2-Familie Proteine ​​berichtet wurde, die Apoptose zu regulieren, indem sie die mitochondriale Membrandurchlässigkeit zu steuern. SPARC bis die Expression von Bax geregelt und nach unten um die Expression von Bcl-2 in MGC 803 Zellen und HGC 27 Zellen reguliert. Wir fanden, dass SPARC siRNA Magenkrebszellen Apoptose induzieren kann, und gleichzeitig das Verhältnis von Bcl-2 zu Bax reduzieren. Daher kann die Regelung von Bcl-2 und Bax Ausdruck einen Schlüsselmechanismus SPARC Induktion von Apoptose in Magenkrebszellen sein zugrunde liegen.
So angegeben unsere Daten, dass die Herunterregulierung von SPARC Zellproliferation von Magenkrebszellen durch Apoptose Initiation gehemmt, das Gewissen mit Melanom und Gliom, aber im Gegensatz zu Eierstock- und Bauchspeicheldrüsenkrebs. Die Induktion der Apoptose wurde teilweise reguliert mitochondriale Weg wie die Aktivierung von Caspase-Weg sowie Spaltung von PARP. Zukünftige Studie über den genauen Mechanismus zu konzentrieren muss.
Abschließend unsere aktuellen Daten legten nahe, dass SPARC eine wichtige Rolle bei der Apoptose und die Metastasierung von Magenkrebs gespielt. Derzeit gibt es keine wirksame Ansätze für die späten Stadium Magenkrebs zu heilen. Wie erhöht SPARC-Expression mit einer verringerten Magenkrebs das Überleben des Patienten [16] verbunden ist, glauben wir, dass unsere Ergebnisse, Invasion verringert Demonstrieren und erhöht mit siRNA Zelltod gegen SPARC gerichtet, deuten darauf hin, dass SPARC Ausdruck abnehm Patienten einen therapeutischen Nutzen für Magenkrebs haben kann.
Erklärungen
Danksagung
Diese Arbeit wurde von der National Scientific Techno Unterstützung der Projektfonds [30901417] unterstützt. Wir danken Professor Yang Ke und Xiaojuan Du von der Universität Peking Health Science Center, Beijing, China, für die technische Unterstützung.
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Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

• Metallothionein 2A hemmt NF-kappaB Signalweg-Aktivierung und prognostiziert klinischen Ergebnisse mit TNM-Stadium getrennt in Magenkrebs-Patienten nach radikaler Resektion
• Tief Sequenzierung des Magenkarzinoms zeigt somatische Mutationen relevant personalisierte Medizin