PLOS ONE: SIRT3 mejora la glucólisis y la proliferación de cáncer gástrico Cells

Extracto

SIRT3 SIRT3-Expresar es una clave NAD ^{+ - deacetilasa dependiente de la proteína en la mitocondria de las células de los mamíferos, que funciona para prevenir el envejecimiento celular y la transformación a través de la regulación de la homeostasis metabólica mitocondrial. Sin embargo, también se encuentra SIRT3 expresar en algunos tumores humanos; su papel en estas células tumorales que expresan SIRT3 necesita ser dilucidado. Este estudio demostró que la expresión de SIRT3 se elevó en un grupo de células de cáncer gástrico en comparación con las células epiteliales gástricas normales. Aunque los niveles de expresión SIRT3 se incrementaron en los tejidos tumorales gástricas en comparación con los tejidos no tumorales adyacentes, las células cancerosas positivas SIRT3 se detectaron más frecuentemente en los cánceres gástricos de tipo intestinal que los cánceres gástricos de tipo difuso, lo que indica que SIRT3 se vincula con subtipos de gástrico cáncer. La sobreexpresión de SIRT3 promovió la proliferación celular y la generación de ATP mejorada, la captación de glucosa, la formación de glucógeno, la actividad de MnSOD y la producción de lactato, que se inhibe por SIRT3 caída, lo que indica que SIRT3 juega un papel en la reprogramación de la bioenergética en las células tumorales gástricas. Análisis posteriores revelaron que SIRT3 interactuó con y desacetilado la lactato deshidrogenasa A (LDHA), una proteína clave en la regulación de la glucólisis anaeróbica, la mejora de la actividad LDHA. En consistencia, un grupo de genes glucólisis asociada se upregulated en las células tumorales gástricas SIRT3 sobreexpresan. Por lo tanto, además de la homeostasis mitocondrial SIRT3 mediada bien documentada en las células normales, SIRT3 puede mejorar la glucólisis y la proliferación celular en las células cancerosas que expresan SIRT3}

Visto:. Cui Y, Qin L, Wu J, Qu X, Hou C, Sun W, et al. (2015) SIRT3 Mejora la glucólisis y la proliferación de células de cáncer gástrico SIRT3-Expresando. PLoS ONE 10 (6): e0129834. doi: 10.1371 /journal.pone.0129834

Editor: Xianglin Shi, Universidad de Kentucky, Estados Unidos |

Recibido: 16 de abril, 2015; Aceptado: 13-may de 2015; Publicado: 29 Junio ​​2015

Derechos de Autor © 2015 Cui et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y

Financiación:. Este estudio fue parcialmente apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China, Key Program (30930105), del Proyecto del plan Nacional de Apoyo 12-5 del Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2012BAH30F03), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31070740), el 985 y el 211 Proyectos de la Universidad Jiaotong de Xi'an (JKL), y el Instituto Nacional del cáncer de subvención RO1 CA152313-01-A1 (JJL).

Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

Las sirtuinas, una familia de NAD ^{+ - dependientes de las histonas desacetilasas (HDAC) en mamíferos células, están implicados en una amplia gama de procesos físicos, incluyendo la supervivencia celular, la apoptosis, el metabolismo, las respuestas de estrés, envejecimiento y longevidad [1,2]. Entre siete miembros sirtuinas (SIRT1-7), SIRT3 es la mejor sirtuin mitocondrial caracterizado, que funciona para regular las proteínas mitocondriales implicadas en la fosforilación oxidativa, oxidación de ácidos grasos, el ciclo de la urea, y la respuesta antioxidante [2-9]. Varios estudios han puesto de relieve el papel de SIRT3 en el metabolismo y la homeostasis de las células normales y reveló nuevos objetivos y sustratos para SIRT3 dependiente de desacetilación [10]. Kim et al informaron de que SIRT3 es una proteína clave mitocondrias, y la falta de la expresión SIRT3 está vinculada a un aumento de daño mitocondrial de ADN y el envejecimiento, así como una mayor potencial de transformación celular inducida por Ras y la activación MnSOD SIRT3 mediada por contribuir a la homeostasis mitocondrial [11,12]. En apoyo, las células 293 de riñón embrionarias humanas células (HEK293) exhiben una expresión mejorada SIRT3 bajo estrés oxidativo, que conduce a la desacetilación y la activación de MnSOD [13]. SIRT3 se cree que funciona como un gen supresor de tumores y desempeña un papel clave en la mejora de la homeostasis celular contra el envejecimiento y la carcinogénesis.}

Sin embargo, algunas células tumorales muestran la expresión de SIRT3 y el papel potencial de SIRT3 en estas células tumorales , especialmente su relación potencial con el fenotipo agresivo, ha sido controvertida [14]. expresión SIRT3 es más baja o indetectable en una variedad de cánceres humanos, incluyendo el cáncer de mama, glioblastoma, cáncer de colon, y osteosarcoma, cáncer de próstata y de ovario [11,15,16]. SIRT3 induce la detención del crecimiento y la apoptosis por el silenciamiento selectivo de la Bcl-2 en las células HCT116 a través de la modulación de JNK2 vía de señalización [17]. También, SIRT3 se divulga para contribuir a aumentar la sensibilidad de las células de leucemia humana a la quimioterapia posiblemente a través de la inducción de la apoptosis mediada por mitocondrias [18]. Por otro lado, la expresión SIRT3 se encuentra también incrementarse en el cáncer oral, cáncer de mama con ganglios positivos, cáncer de esófago, y los carcinomas de tiroides; y el aumento de la SIRT3 se asocia con mayor fenotipo maligno y regulación a la baja de SIRT3 aumenta la sensibilidad del tumor al tratamiento contra el cáncer [19-23]. Estos resultados alertan un papel diferente de SIRT3 en tumores específicos que necesita ser aclarada.

Las células cancerosas son metabólicamente activas y consumen más combustible celular que las células normales. Sin embargo las células cancerosas retransmiten en principalmente en la síntesis de ATP por la glucólisis aeróbica, una característica conocida como efecto Warburg [24]. Tal glucólisis aeróbica se cree que protege a las células cancerosas forman el estrés oxidativo ya la respiración mitocondrial es la principal fuente de ROS intracelular [25]. La lactato deshidrogenasa A (LDHA) es una enzima que controla la interconversión entre piruvato y L-lactato de forma reversible en el paso final de la glucólisis anaeróbica [26]. La inhibición de la LDHA disminuye el potencial tumorigénico con un mayor consumo de oxígeno mitocondrial y la disminución de potencial de membrana mitocondrial [26] y la producción de ATP celular en general y de la glucólisis [27].

En este estudio, hemos investigado el papel potencial de la SIRT3 en gástrica las células cancerosas que expresan SIRT3. Expresión de SIRT3 estaba vinculado con el crecimiento agresivo, que fue mediada a través de SIRT3-desacetilada y activado LDHA, la mejora de la glucólisis y la expresión de un grupo de genes glucólisis-asociado. Por lo tanto el metabolismo de la glucólisis mediada por SIRT3-LDHA puede ser una posible diana terapéutica para el tratamiento de las células cancerosas que expresan SIRT3.

Materiales y Métodos

Líneas celulares y cultivo

cáncer gástrico humano líneas de células MGC-803, HGC-27, SGC-7901 [28] y AGS [29] e inmortalizado línea celular epitelial gástrica humana GES-1 [30] se mantuvieron en medio RPMI-1640 (Invitrogen) suplementado con 10% de bovino fetal suero y 1% de penicilina /estreptomicina, y se cultivaron a 37 ° C bajo una atmósfera de 5% de CO2.

inmunoprecipitación y western blot
células

subconfluentes se lisaron y los lisados ​​se incubaron con proteína a /perlas de agarosa G más la cantidad recomendada de anticuerpos contra cualquiera de SIRT3 (Cell Signaling Technology) o LDHA (Santa Cruze) a 4 ° C durante la noche. Las muestras se centrifugaron y se separaron por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS y a electrotransferencia sobre membranas de nitrocelulosa. Después de bloquear con leche no grasa al 5% en TBST, las membranas se incubaron con anticuerpo primario a 4 ° C durante la noche seguido por incubación con anticuerpo secundario durante 1 hora a RT. Las proteínas de interés se visualizaron por ECL kit de detección (Thermo Fisher).

Inmunohistoquímica ensayo

diapositivas patológicas de cáncer gástrico con los tejidos normales adyacentes fueron analizados mediante el ensayo de inmunohistoquímica se realizaron siguiendo las instrucciones del fabricante. El kit de detección de polímero para el análisis de inmunohistoquímica se adquirió de Zhongshan puente Golden Biotecnología. Brevemente, las secciones de parafina fueron desparafinados y re-hidratado en etanol (100%, 90% y 75%). Las secciones fueron incubadas con 3% de H _{2O 2 a TA durante 10 minutos y luego se bloquearon con suero de cabra no inmune a TA durante 15 minutos. Las secciones fueron incubadas con el anticuerpo primario a SIRT3 (Cell Signaling Technology) durante 2 horas a TA seguido de anti-conejo de incubación de anticuerpo secundario durante 15 minutos a RT. Las secciones fueron incubadas con reactivo de detección DAB durante 2 minutos cada uno, a contratinción con hematoxilina y dehydraded en etanol (90% y 100%). Las secciones se montaron y se analizó la tinción bajo la microscopía.}

construcción del plásmido y la transfección de células

SIRT3 conjunto de ADNc de longitud se sintetizó usando RT-PCR con ARN total extraído de células GES-1 como plantilla (cebadores: 5 'CCGCGGTACCATGGCGTTGTGGGGTTG 3' y 5 'CCGCTCTAGACTATTTGTCTGGTCCATCAAGC 3'). El cDNA se clonó en pcDNA3.1 + expresión vector (Invitrogen). El /GFP /Neo-SIRT3-shRNA plásmido pGPH1 focalización SIRT3 humana (5 'CTTGCTGCATGTGGTTGAT 3') y el control shRNA plásmido se obtuvieron de GenePharma. Para generar transfectantes estables, AGS y células SGC-7901 fueron transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 reactivo (Invitrogen) y los transfectantes estables fueron seleccionados por 400 ug /ml G418 (Gibco).

proliferación celular y ensayo de clonogenicidad

Para el ensayo de proliferación, las células se sembraron en una placa de 6 pocillos a 2 x 10 ^{4 células /pocillo. La proliferación celular se calculó en los días 2, 4, 6, y 8 después de la siembra. Para el ensayo de clonogenicidad, las células se sembraron en una placa de 6 pocillos con el número de células variadas y se cultivaron durante 14 días y las colonias a continuación se tiñeron con cristal violeta, y el número de colonias (> 50 células /colonia) se contó siguiendo los métodos establecidos [31].}

Medición de glucosa, lactato y glucógeno

El rojo de fenol medio libre se utilizó para células de cultivo en 6 pocillos de placa durante 24 horas y los niveles de captación de glucosa y la generación de lactato se midieron usando el kit de glucosa y el ácido láctico de ensayo Kit (Jiancheng Bioingeniería Institute). Los valores relativos se normalizaron al número de células de cada pocillo. los niveles de glucógeno celulares fueron detectados utilizando el kit de ensayo de glucógeno (Biovision). Brevemente, 1 × 10 ^{6 células se homogeneizaron en agua 200μL en hielo, y los homogeneizados se hirvieron durante 5 minutos para inactivar las enzimas y se centrifugó a 13.000 rpm durante 5 minutos a 4 ° C para eliminar el material insoluble. La producción de glucógeno se midió con el valor de la DO a 570 nm.}

Medición de la producción de ATP
se midieron los niveles

celular de ATP y ROS como se describe anteriormente [32]. Las células cultivadas en una placa de 6 pocillos después de varios tratamientos, se lisaron y los niveles celulares de ATP se midieron con ATP bioluminiscencia Assay Kit (Sigma). Para la medición de la producción de ATP mediada por glucólisis, las células se trataron con 2 M de rotenona durante 24 horas antes de las mediciones.

Medición de la generación de ROS

generación celular ROS se ensayó con 5- (y 6-) carboxi-2 ', 7'-diacetato dichlorodihydrofluorescein (DCFDA) usando el espectrómetro de microplacas (Thermo Fisher) a 488/530 nm de longitud de onda nm.

actividad MnSOD

Las células cultivadas en un 6 pocillos placa se lisaron y la actividad de MnSOD se determinó mediante WST-8 métodos usando el kit de ensayo de MnSOD (Beyotime) siguiendo las instrucciones del fabricante.

ensayos de tumorogénesis en ratones desnudos

SGC7901 células (7,5 x 10 ^{6) con sobreexpresión SIRT3 o desmontables se suspendieron en 0,1 ml de PBS y se inoculó en cada flanco de 5 semanas de edad macho BALB /c atímicos ratones desnudos, y en la 28 TH días después de la inoculación, cuando el volumen maximal tumor (~ 1.500 mm 3) alcanzado en el grupo de control, los experimentos se terminaron y todos los tumores de cada grupo se extirparon y se pesaron. El procedimiento experimental en los ensayos con animales se llevó a cabo de acuerdo con las directrices institucionales; el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) en Xian Universidad Jiao Tong de aprobado específicamente este estudio (Protocolox181).}

lactato deshidrogenasa ensayo

La lactato deshidrogenasa se determinó la actividad siguiendo el protocolo establecido mediante la medición de la tasa de reducción en la absorbancia a longitud de onda de 340 nm que resulta de la oxidación de NADH [27]. Brevemente, las células se cultivaron en placas de 10 cm y se homogeneizaron en PBS en hielo. Los homogeneizados se añadieron en tampón que contenía NADH 6,6 mM, piruvato de sodio 30 mM y Tris-HCl 0,2, pH 7,3 y se mezcló. Incubar la mezcla durante 5 minutos para alcanzar la temperatura de equilibrio y luego registrar la tasa de disminución de la absorbancia a 340 nm.

SIRT3 in vitro
desacetilación ensayo

enzima recombinante SIRT3 humana ( BPS) se incubó con deshidrogenasa-L láctico a partir de corazón bovino (Sigma) en tampón de reacción (NaCl 50 mM, MgCl 4 mM _{2, mM NAD 10 ^{+, DTT 50 mM, Tris 50 mM, pH 8,0) con /sin nicotinamida inhibidor SIRT3 (NAM, 10 mM) a 37 ° C durante 1,5 horas, y luego las reacciones se utilizan para el ensayo de la actividad LDHA descritos como anteriormente.}}

-PCR en tiempo real

El ARN total se aisló usando reactivo TRIZOL (Invitrogen) seguido de tratamiento con fenol /cloroformo y precipitación con 2-propanol. a continuación, el ARN total de pellets se lavó con 75% de etanol y se resuspendió en agua. RNA se sometió a transcripción con el Kit de PrimeScript RT-PCR (Takara) y el análisis de PCR cuantitativa en tiempo real de los genes de interés se llevó a cabo usando el kit SYBR PremixExTaq II (Takara) siguiendo las instrucciones del fabricante inversa. Los datos se normalizaron al nivel de γ-tubulina.

inmunofluorescencia

células AGS sembradas sobre cubreobjetos en una placa de 6 pocillos se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 10 minutos y se bloquearon en el 1% BSA durante 1 hora a RT. Se incuban las células con anticuerpos primarios contra SIRT3 y LDHA a 4 ° C durante la noche, seguido de incubación con el anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia durante 1 hora a RT. Contratinción se realizó con DAPI usando el kit de inmunofluorescencia (Beyotime). Las células fueron montadas y la imagen por escaneo láser confocal microscopio.

El análisis estadístico

Los datos se presentan como media ± SE de al menos tres experimentos independientes. El análisis estadístico se realizó con la prueba t no pareada de dos colas de Student no ser que se indique lo contrario. P Hotel < 0,05 fue considerado significativo.

Resultados

SIRT3 expresión en células de cáncer gástrico

SIRT3 está bien definido en la regulación de la homeostasis mitocondrial en anti-envejecimiento y anti-transformación. Recientemente, se informó de resultados diferentes con respecto a la inhibición de células SIRT3 mediada y la proliferación, lo que lleva a la controversia de sus papeles en tipos de cáncer [19,20]. Para determinar el papel potencial de la SIRT3 en el cáncer gástrico, se detectó expresión de SIRT3 en 4 líneas celulares de cáncer gástrico AGS, SGC-7901, MGC-803, HGC-27 y un grupo de tejidos tumorales de cáncer gástrico. Se encontró que los niveles de proteína SIRT3 eran elevados en las 4 líneas celulares de cáncer gástrico en comparación con las GES-1 epiteliales gástricas inmortalizadas células (AGS, 1,9 veces; SGC-7901, 1,5 veces; MGC-803, 2,0 veces, y HGC -27, 1,8 veces en comparación con células GES-1) (Fig 1A). De acuerdo, los niveles de mRNA de SIRT3 en estas líneas celulares también se incrementaron (AGS, 2,6 veces; SGC-7901, 1,7 veces; MGC-803, de 2,5 veces; HGC-27, de 2,2 veces) en comparación con ges- 1 en las células (Fig 1B).

inmunohistoquímica análisis en el tumor y los tejidos normales no tumorales adyacentes de un grupo de pacientes con cáncer gástrico demostraron que las células SIRT3-positivas fueron más frecuentemente detectable en los tejidos tumorales que en los tejidos normales. Los resultados mostraron que 55,1% de los tejidos tumorales (7% de los tejidos normales) mostraron alto nivel (positivo fuerte), 41,4% de los tejidos tumorales (28% de los tejidos normales) mostraron alto nivel medio (débil positivo), mientras que 3,5% de tumor tejidos y el 64% de los tejidos normales fue negativo en la expresión SIRT3 (figura 1C y 1D, la figura S1 a). Curiosamente, SIRT3 expresión en tipo intestinal de los tejidos tumorales (15 casos; 93,3% positivo fuerte y 6,6% positivo débil) fue significativamente mayor que la de tipo difuso de los tejidos tumorales (14 casos; 14,3% positivo fuerte, 78,6% débil positivo y 7,1 % negativo) (figura 1C y 1E, S1B la figura). Estos resultados sugieren que la expresión SIRT3 se incrementa en algunos tumores en comparación con los tejidos normales relacionadas y SIRT3 expresión puede ser varían en los tumores individuales, que deben investigarse más a fondo.

SIRT3 niveles están vinculados con la proliferación celular

A continuación, se estableció la sobreexpresión SIRT3 y líneas celulares desmontables utilizando AGS y células SGC-7901. La expresión de SIRT3 en transfectantes estables se confirmó por Western blot. La sobreexpresión de SIRT3 aumento del crecimiento celular, mientras que SIRT3 desmontables inhibe el crecimiento celular de las dos líneas celulares de cáncer gástrico (Fig 2A). Además, la sobreexpresión de SIRT3 activado más la formación de colonias de células de control transfectadas que estaba en contraste con sólo el menor número de colonias formadas en las células SIRT3 desmontables (Fig 2B).

A fin de determinar el papel de la SIRT3 en la capacidad de formación de tumores, inyectamos sobreexpresión SIRT3 y células SGC-7901 desmontables en los flancos de ratones desnudos y el crecimiento del tumor se le permitió durante 28 días después de la inoculación de células (figura S2). El peso medio de los tumores derivados de células que sobreexpresan SIRT3 era 0.7079g, significativamente más grande que el peso del tumor promedio de control (NC), p
= 0,015, (Fig 2C, panel izquierdo). Por el contrario, el peso medio de los tumores derivados de células desmontables SIRT3 era 0.0588g, significativamente menor que el de las células de control scramble shRNA (SCR) (0.2033g; p
= 0,009) (Fig 2C, panel derecho) . El volumen medio de los tumores derivados de células que sobreexpresan SIRT3 se aumentó que la de las células control (NC) (Fig 2C, panel de la izquierda hasta la esquina derecha). Por el contrario, el volumen medio de los tumores que crecen a partir de células desmontables SIRT3 fue dramáticamente pequeña en comparación con la de células control (SCR) (Figura 2C, el panel de la derecha esquina superior derecha).

glucólisis mejorada en SIRT3 expresando el cáncer gástrico células

luego nos preguntamos cómo la bioenergética celular podría ser alterada en células de cáncer gástrico SIRT3 sobreexpresan. sobreexpresión SIRT3 aumentó drásticamente la captación de glucosa (1,4 veces en AGS y 1,9 veces en la SGC-7901), mientras que knockdown SIRT3 disminuyó la captación de glucosa (alrededor de 40% en ambos AGS y SGC-7901) (Fig 3A y 3B). De acuerdo con el patrón de uso de la glucosa, las células que sobreexpresan SIRT3 ha aumentado los niveles de secreción de lactato (1,2 veces en AGS y 1,3 veces en la SGC-7901), mientras que las células desmontables SIRT3 habían disminuido los niveles de secreción de lactato (55% en AGS y 45 % en SGC-7901) (Fig 3C y 3D). También se encontró que la formación de glucógeno se incrementó significativamente por SIRT3 sobreexpresión (1,5 veces en AGS y 1,3 veces en la SGC-7901), una característica de rápido crecimiento de las células tumorales [33], mientras que la reducción por SIRT3 desmontables (40% en AGS y 70% en SGC-7901) (Fig 3E y 3F).

SIRT3 se ha demostrado que participan en la desacetilación de las enzimas del metabolismo globales y de mantenimiento de los niveles basales de ATP en las células, tanto en condiciones normales y en las enfermedades [1 , 2]. la generación de ATP y ATP glucólisis celular total se detectaron en células AGS y SGC-7901, ya sea con la sobreexpresión o derribo SIRT3 SIRT3. Los niveles de ATP celulares totales se incrementaron en las células que sobreexpresan SIRT3 (alrededor de 1,3 veces en ambas líneas celulares), pero disminuyó en las células SIRT3 desmontables (alrededor de 75% en ambas líneas celulares) en comparación con células de control NC o SCR (Fig 4A y 4B) . A continuación, las células tratadas con rotenona para inhibir la fosforilación oxidativa, y probamos la generación de ATP a partir de la glucólisis. Como se muestra en la figura 4C y 4D, SIRT3 sobreexpresión condujo a un aumento en la producción de la glucólisis ATP (1,4 veces en AGS y 1,6 veces en la SGC-7901), mientras que SIRT3 caída condujo a una disminución significativa en la producción de la glucólisis ATP (20% en AGS y el 40% en el SGC-7901) respecto al CN o SCR de control.

SIRT3 regula la homeostasis de ROS en células de cáncer gástrico

un cuerpo de evidencia apoya que el aumento de nivel de ROS es una característica crítica en las células cancerosas, que hacen que las células cancerosas más sensibles al estrés ROS adicional [34]. Aquí encontramos que la sobreexpresión de SIRT3 disminución de los niveles de ROS a 70% y 80% en las células AGS y SGC-7901, mientras que la inhibición de la expresión de SIRT3 aumentó los niveles de ROS (1,4 veces en las células AGS y 1,6 veces en las células SGC-7901), respectivamente (Fig 5A y 5B). De acuerdo con la literatura que muestra deacetylates SIRT3 y activa MnSOD (11, 12), en células de cáncer gástrico, actividad MnSOD fue reforzada por SIRT3 sobreexpresión (1,4 veces en las células AGS y 1,2 veces en las células SGC-7901), pero reduce en knockdown SIRT3 (50% en las células AGS y 65% ​​en las células SGC-7901) (Fig 5C y 5D), sugiriendo que SIRT3 puede proteger las células del daño inducido por el estrés oxidativo mediante el reequilibrio de ROS intracelulares mediante el aumento de la actividad de MnSOD en células de cáncer gástrico.

deacetylates SIRT3 y activa LDHA

LDHA juega un papel clave en la iniciación del tumor, el mantenimiento y la progresión. La inhibición de la actividad LDHA bloques tumorigenicidad y la progresión tumoral [26,27] y la actividad LDHA se puede regular por modificación de acetilación /desacetilación [35]. Nos preguntamos si SIRT3 está implicada en la regulación de la actividad LDHA. Hemos encontrado que, en células de cáncer gástrico, actividad LDHA fue significativamente mayor en las células que sobreexpresan SIRT3, mientras que la disminución en las células SIRT3 desmontables en comparación con NC o de control Scr células por separado sin cambio detectable en el nivel de proteína LDHA en los transfectantes estables (Fig 6A). Inmunomarcación resultados mostraron que LDHA y SIRT3 se co-localiza en el citoplasma (Fig 6B), y el análisis de co-IP, ya sea con LDHA o anticuerpo SIRT3 revelaron que SIRT3 es capaz de interactuar con LDHA (figura 6C). Además, el nivel de acetilación LDHA se redujo en las células que sobreexpresan SIRT3, pero aumentó en las células SIRT3 desmontables (Fig 6D). Además, in vitro
LDHA ensayo de actividad llevó a cabo utilizando SIRT3 humana recombinante comercial y corazón bovino L-láctico deshidrogenasa indicó que la actividad LDHA se incrementó con la presencia de SIRT3 en la reacción, que fue revertida por la adición de inhibidor de la SIRT3 , nicotinamida (6E Fig). Para identificar el potencial sitio (s) SIRT3 desacetilación en LDHA, se realizaron búsquedas en la base de datos y se encontró que K5, K14, K57, K81, K118, K126, K222 y K318 son sitios de acetilación potenciales de LDHA, y el estudio anterior informó de que K5 acetilación /desacetilación era implicado en la regulación de la actividad LDHA [35]. Luego hicimos el ensayo de actividad LDHA usando lisina 5 y lisina 318 mímica acetilación (K5Q /K318Q) o desacetilación mímica (K5R /K318R) LDHA mutante, y se encontró que era necesaria ni K5 ni K318 para la activación LDHA SIRT3 mediada (S3 figura). La identificación posterior de SIRT3 mediada por desacetilación LDHA está en necesidad.

SIRT3 regula por incremento genes implicados en el metabolismo celular

Para caracterizar la firma molecular de SIRT3-LDHA bioenergética mediadas en células de cáncer gástrico, que mide la expresión de genes asociados con el transporte de la glucosa y la glucólisis. Los datos en la figura 7A y 7B muestran que la sobreexpresión de SIRT3 en AGS o SGC-7901 indujo la expresión de HK2 (1,47 veces en las células AGS, 1,3 veces en las células SGC-7901), MCT4 (2,3 veces en las células AGS, 1,34 -fold en las células SGC-7901) y Glut1 (1,55 veces en las células AGS, 1,38 veces en las células SGC-7901) a nivel de ARNm probado por PCR en tiempo real. Por el contrario, SIRT3 desmontables disminuyó la expresión de HK2 gen a 76%, MCT4 a 73% y Glut1 a 62% en las células AGS, mientras HK2 a 80%, MCT4 a 62% y Glut1 a 74% en las células SGC-7901. Además, cuando SIRT3 se sobreexpresa, el nivel MCT1 ARNm se incrementó en las células AGS por 1,6 veces pero no en células SGC-7901, y cuando SIRT3 se desmontables, MCT1 se redujo a 59% en AGS y 65% ​​en las células SGC-7901 , respectivamente.

Discusión

Este estudio proporciona la evidencia que indica que SIRT3 expresa en algunas células cancerosas, como las células de cáncer gástrico, puede estar vinculado con la agresividad aumentada por la bioenergética SIRT3 mediada a través de desacetilación y la activación de LADH. Aunque la acumulación de evidencias indica que SIRT3 juega un papel clave en la protección de las células normales contra el envejecimiento y la transformación maligna, su función en las células ya transformadas tales como las células tumorales que expresan SIRT3 necesita ser investigado [19]. La falta de SIRT3 en MEFs conduce a la inestabilidad genómica y una alta frecuencia de transformación celular mediada por Ras con una mayor tasa de formación de tumores y el envejecimiento, lo que sugiere que SIRT3 es necesario en la prevención del envejecimiento celular y la carcinogénesis [11,15]. Además, la falta de o menor expresión de SIRT3 se detecta en varios cánceres humanos y el nivel SIRT3 se asocia con la sensibilidad de las células cancerosas a la quimioterapia y la radioterapia [11,15,16]. Sin embargo, también se muestra SIRT3 se sobreexpresa en los cánceres humanos y se asocia con la resistencia a la terapia [19,21,36]. Estos resultados sugieren que SIRT3 puede dirigirse a diferentes proteínas entre las células normales y cancerosas, y que la expresión SIRT3 se pueden variar en diferentes tipos de cáncer, como los resultados actuales indican que el tipo intestinal de cáncer gástrico expresa un mayor nivel de SIRT3 que el difusa tipo de cáncer gástrico.

se ha aceptado generalmente que las células tumorales consumen más energía celular para apoyar el crecimiento rápido y la proliferación de las células normales usando la glucólisis como la fuente principal de la generación de ATP en lugar de la fosforilación oxidativa [24] . En el estudio actual, hemos demostrado que, en las células de cáncer gástrico, SIRT3 interactúa con y deacetylates LDHA, causando aumento de la actividad LDHA; y SIRT3 sobreexpresión conduce a un aumento de la producción de ATP celular y actividad de MnSOD en paralelo con la reducción de nivel de ROS celular, lo que indica una mayor capacidad oxidativa del tesoro de SIRT3 posiblemente a través de la activación de la enzima MnSOD mediada por desacetilación. aumento de la evidencia muestra que SIRT3 se requiere para el mantenimiento de la homeostasis celular y las mitocondrias a través de la regulación del metabolismo mitocondrias y el sistema de equilibrio redox celular, protegiendo las células contra el estrés oxidativo a través de la regulación de la generación de ROS, un mecanismo crítico en el envejecimiento, cáncer y enfermedades del corazón [1,2, 37]. SIRT3 puede deacetylate un grupo de destinos mitocondrias implicado en la regulación tanto de la glucólisis y el estrés oxidativo celular. Recientemente, SIRT3 se encuentra capaz de desacetilar y aumentar la actividad de piruvato deshidrogenasa en las células cancerosas, lo que puede aumentar tanto la bioenergética mitocondrial y la glucólisis [38]. De acuerdo, el presente estudio indica que SIRT3 puede desacetilar y activar LDHA que se puede utilizar tanto para la respiración mitocondrial y la glucólisis. Por otro lado, SIRT3 puede desacetilar y posteriormente activar otros sustratos, tales como mitocondrias MnSOD [11,12], FOXO3 [39] y IDH2 [9] para secuestrar ROS producido por la fosforilación oxidativa, protección de las células contra el daño oxidativo [40] . También en consonancia con estos resultados, en este estudio, encontramos que la sobreexpresión de SIRT3 aumenta la actividad de MnSOD, que podría ser una de las razones de la reducción del nivel de ROS celular bajo condiciones de metabolismo celular mejorada.

LDHA, como miembro de la familia de lactato deshidrogenasa (LDH), se encuentra en las células existido glucolíticas y localizada en las mitocondrias, además de la citosol [41], y sobre todo que cataliza la interconversión de piruvato y lactato [42]. LDHA se muestra a desempeñar un papel clave en la glucólisis aeróbica y la tumorigenicidad de las células malignas [26,27]. En las células cancerosas, LDHA consume rápidamente el piruvato producido por vía glucolítica, lo que lleva a un aumento de la producción de lactato aeróbico [26]. La inhibición de la LDHA induce la producción de ROS, disminuye los niveles de ATP celular e inhibe la glucólisis, por lo tanto, inhibe el crecimiento celular y desencadena la muerte celular en el cáncer [27]. Consistente con estos informes, se encontró que SIRT3 puede interactuar y activar LDHA. En la SIRT3 células que sobreexpresan, LDHA acetilación se redujo con un aumento de la actividad de la enzima LDHA. Aunque el mecanismo exacto que causa la regulación LDHA SIRT3 mediada necesita de mayor investigación, estos resultados demuestran que LDHA controlado vía de la glucólisis que acelera la bioenergética del tumor puede ser afectada por los niveles de expresión SIRT3.

Nuestro estudio también reveló que la expresión de un grupo de genes, tales como MCT1, MCT4, HK2 y Glut1, conocido como reguladores clave de metabolismo de la energía en el cáncer también se incrementan en células de cáncer gástrico SIRT3 sobreexpresan, lo que demuestra un papel potencial de la SIRT3 en la mejora de la glucólisis en las células tumorales. HK2 cataliza la fosforilación de glucosa a glucosa-6-fosfato en el paso inicial de la glucólisis [43]. transportador de glucosa (GLUT) controla el transporte de glucosa a través de la membrana plasmática, que funciona como el primer paso limitante de la velocidad para metabolismo de la glucosa [44]. MCT1 y MCT4, los miembros de monocarboxilatos (tales como lactato y piruvato) transportador de la familia, también están implicados en el crecimiento de tumores glucólisis dependiente de [45]. En conjunto, estos resultados sugieren una interacción potencial entre SIRT3 y un grupo de genes asociados a la glucólisis en la señalización de crecimiento agresivo del tumor, que debe investigarse más a fondo.

En conclusión, aunque SIRT3 está bien caracterizado en la homeostasis celular mitocondrial contra envejecimiento y transformación, expresión de la SIRT3 en las células tumorales está vinculada a una mayor proliferación y el crecimiento agresivo de células de cáncer gástrico. interactúa SIRT3 y activa LDHA, lo que lleva a un aumento de la glucólisis y la producción de ATP, que junto con aumento de la actividad antioxidante MnSOD mitocondrial y la disminución de nivel de ROS intracelular (un modelo hipotético se propone en la figura 7C). Por lo tanto, la función de estimulación del crecimiento de SIRT3 demuestra un objetivo potencial para el tratamiento de tumores con expresión SIRT3.

Apoyo a la Información
S1 Fig. diapositivas representativos patológicos para determinar la expresión SIRT3 en muestras de cáncer gástrico humano.
A, el cáncer gástrico humano embebido en parafina y muestras de tejido patológicamente normales adyacentes apareados fueron sometidas a tinción inmunohistoquímica con el anticuerpo SIRT3 (marrón), seguido de núcleos contratinción con hematoxilina ( azul; cada tumor se demostró con los tejidos normales adyacentes en una fila en un 20 × y 40 ×). B, las imágenes representativas de la expresión SIRT3 en los tipos intestinales y difusos de cáncer gástrico. Barra de escala, 50 micras
doi:. 10.1371 /journal.pone.0129834.s001 gratis (TIF)
S2 Fig. La sobreexpresión de SIRT3 promovió la carga tumoral in vivo.
Células SGC-7901 con sobreexpresión SIRT3 (A) o desmontables (B) se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de los ratones desnudos con las células de control relativos (NC o SCR) en el izquierdo flanco. xenoinjertos de tumores se extirparon y se pesaron en el día 28 después de la inoculación de células. Imágenes del panel de la derecha muestran los xenoinjertos de tumores in vivo al final del experimento. Imágenes mostraron crecimiento tumoral en ratones
doi:. 10.1371 /journal.pone.0129834.s002 gratis (TIF)
S3 Fig.

• PLOS ONE: La metástasis de ganglios linfáticos, un único factor de pronóstico independiente en el cáncer gástrico precoz
• PLOS ONE: Identificación y Caracterización de CXCR4 positivos de cáncer gástrico Stem Cells