PLOS ONE: Reg IV es un objetivo directo del Factor de Transcripción intestinal gástrica CDX2 en Cancer

Extracto

REG4
, que codifica la proteína Reg IV, es un miembro de la lectina dependiente de calcio superfamilia y potente activador del factor de crecimiento epidérmico receptor //activador de la proteína-1 vía de señalización Akt. Varios cánceres humanos sobreexpresan Reg IV, y la expresión Reg IV se asocia con la diferenciación fenotipo intestinal. Sin embargo, la regulación de REG4
la transcripción sigue siendo poco clara. En el presente estudio, se investigó si CDX2 regula la expresión Reg IV en células de cáncer gástrico (CG). La expresión de Reg IV y CDX2 se analizó mediante Western blot y reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa en 9 líneas celulares GC y líneas celulares de cáncer de colon 2. La función de la región flanqueante 5 'de la REG4
gen se caracterizó por ensayo de luciferasa. En 9 líneas celulares GC, Reg IV endógena y la expresión de CDX2 se correlacionan bien. El uso de una forma regulada por el receptor de estrógeno de CDX2, se observó una rápida inducción de la expresión de Reg IV en células HT-29. ensayos de gen reportero revelaron un papel importante en la transcripción de los elementos de la región flanqueante 5 'de la REG4
gen de ADN CDX2 consenso de unión. ensayos de inmunoprecipitación de cromatina mostraron que CDX2 se une directamente a la región flanqueante 5 'de REG4
. Estos resultados indican que la proteína CDX2 regula directamente la expresión Reg IV

Visto:. Naito Y, Oue N, Hinoi T, Sakamoto N, K Sentani, Ohdan H, et al. (2012) Reg IV es un objetivo directo del Factor de Transcripción intestinal CDX2 en el cáncer gástrico. PLoS ONE 7 (11): e47545. doi: 10.1371 /journal.pone.0047545

Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América

Recibido: 24 de mayo de 2012; Aceptado: 12 de septiembre de 2012; Publicado: 2 de noviembre 2012

Derechos de Autor © 2012 Naito et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas-en-Ayudas a la Investigación del Ministerio de Educación, Cultura, Ciencia, Deportes y Tecnología de Japón, y, en parte, por una subvención-en-Ayudas a la estrategia de 10 años Tercera Integral de control del cáncer y de Investigación del cáncer del Ministerio de Salud, Trabajo y Bienestar de Japón, y por el Instituto Nacional de Innovación Biomédica (Programa de Promoción de Estudios Fundamentales en Ciencias de la Salud). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer gástrico (CG) es uno de los cánceres humanos más comunes en el mundo. El cáncer se desarrolla como resultado de múltiples alteraciones genéticas y epigenéticas [1]. Se realizó previamente un análisis en serie de la expresión génica (SAGE) de cuatro GC primaria y se identificaron varios genes GC-específica [2]. De estos genes, regenerar miembro de la familia derivadas de islotes 4 gratis ( REG4
, que codifica la proteína Reg IV) es un gen candidato para la expresión específica del cáncer [3]. REG4
es un miembro de la REG
familia de genes, que pertenece a la superfamilia de lectina dependiente de calcio. REG4
fue identificado originalmente por alto rendimiento análisis de la secuencia de una gran biblioteca de ADNc de la enfermedad inflamatoria intestinal [4]. Reg IV es un potente activador del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) /Akt /activador de la proteína-1 (AP-1) la vía de señalización en células de cáncer de colon y aumenta la expresión de Bcl-2, Bcl-XL y survivina, que son proteínas asociado con la inhibición de la apoptosis [5]. La amplificación de la REG4
gen ha sido reportado en el cáncer de páncreas [6]. Reg IV se ha identificado como uno de los genes hasta reguladas en las células iniciadoras del cáncer [7]. Hemos examinado ya el efecto de la expresión forzada de Reg IV en la línea celular de GC. Demostramos que Reg IV inhibe la 5-fluorouracilo (5-FU) apoptosis inducida a través de la activación de EGFR en células de GC [8]. En contraste, las células que sobreexpresan Reg IV-no mostraron diferencias significativas en la proliferación y la actividad de la invasión en comparación con las células transfectadas con el vector vacío [8]. Estos hallazgos apoyan la idea de que la proteína Reg IV participa en la carcinogénesis gástrica

GC se puede subdividir en cuatro fenotipos según la expresión de mucina:. Fenotipo gástrico o foveolar; fenotipo intestinal; fenotipo mixto intestinal y gástrica; y ni fenotipo gástrico ni intestinal [9]. cambios genéticos distintos parecen estar asociados con gástrica e intestinal GC fenotipo [10]. En nuestras observaciones anteriores, Reg IV se expresó en el 30% de los casos de CG y se correlacionó con el fenotipo intestinal [11]. Una serie de análisis inmunohistoquímicos de Reg IV han sido reportados en los cánceres humanos [11] - [20]. En general, estos análisis indicaron que Reg IV se expresa en células de adenocarcinoma de que exhiben un fenotipo intestinal. Se ha informado de que la expresión de Reg IV es inducida por GLI1, que es un factor de transcripción clave en la vía de señalización Hedgehog [21], o por factores de crecimiento tales como EGF, factor de crecimiento transformante α (TGF-α), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), o factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) [22]. Sin embargo, estas moléculas son poco probable para explicar la asociación entre la expresión Reg IV y diferenciación fenotipo intestinal.

Hemos encontrado previamente que la expresión de Reg IV se correlaciona con la expresión de CDX2 [11]. CDX2 es un factor de mamíferos relacionados caudal-intestinal transcripción e importante para el mantenimiento de las células epiteliales intestinales [23], [24]. Varias líneas de evidencia sugieren que la metaplasia intestinal del estómago y GC fenotipo intestinal se asocia con la expresión ectópica CDX2 [9], [25]. En el presente estudio, se investigó si CDX2 regula la expresión Reg IV en GC y se encontró que CDX2 se une directamente a la región flanqueante 5 'de REG4
gen y mejora la actividad del promotor.

Resultados

reg IV y expresión CDX2 se correlacionan en células GC

lo primero que investigó la inducción de la expresión reg IV de CDX2 en líneas celulares de GC. Western blot de CDX2 en 9 líneas celulares GC reveló que no se detectó o bajo nivel de expresión de CDX2 en MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, y Kato-III (fig. 1A). Para determinar si la expresión de CDX2 y Reg IV estaban fuertemente correlacionados en las células de GC, Western blot y reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (QRT-PCR) el análisis de Reg IV se realizaron en líneas celulares de 9 GC. Como se muestra en la Fig. 1A, expresión de la proteína Reg IV sólo se detectó en las líneas celulares 3 con altos niveles de REG4
transcripciones medidos mediante qRT-PCR. De las líneas celulares 5 GC con expresión de la proteína CDX2, 2 líneas celulares (MKN-1 y MKN-28) carecían de expresión detectable de REG4
transcripciones y proteínas. Las líneas celulares con expresión de la proteína CDX2 indetectable (MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, y Kato-III) no mostraron REG4
transcripciones o proteínas (Fig. 1A).

a continuación, se generó una población policlonal de células KATO-III MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, y expresan altos niveles de CDX2 por la infección de las células con retrovirus de replicación defectuosa que lleva un CDX2 humana ADNc de longitud completa porque no se detectó o bajo nivel de expresión de CDX2 en estas líneas celulares. Sin embargo, la sobreexpresión de CDX2 no pudo activar la expresión Reg IV por Western blot (datos no mostrados). Debido a que es posible que CDX2 por sí sola no es suficiente para activar la expresión Reg IV, la expresión de CDH17
(que codifica la proteína LI-cadherina), que es uno de los objetivos de CDX2 [24], fue también investigada. Sin embargo, la activación de la expresión de LI-cadherina no se encontró en MKN-7, TMK-1, las células HSC-44PE, y KATO-III que expresan altos niveles de CDX2 (datos no mostrados). Debido a que hemos demostrado la activación de la expresión de LI-cadherina por CDX2 en el colon línea celular de cáncer HT-29 [24], la inducción de la expresión Reg IV se investigó en la misma línea celular. Como se muestra en la Fig. 1B, inducción de la expresión Reg IV se detectó en las células HT-29 infectadas con retrovirus que llevan un cDNA CDX2 humano de longitud completa. También generó una población policlonal de SW480 (línea celular de cáncer de colon) las células que expresan altos niveles de CDX2 por la infección de las células con retrovirus de replicación defectuosa que lleva un cDNA CDX2 humano de longitud completa. Como se muestra en la Fig. 1B, inducción de la expresión Reg IV se encuentra en las células SW480 infectadas con retrovirus que llevan un cDNA CDX2 humano de longitud completa. Estos resultados sugieren que la expresión Reg IV puede ser inducida por CDX2 en líneas celulares derivadas de cáncer de colon. Debido a que en la metaplasia intestinal del estómago, CDX2 y expresión Reg IV están bien correlacionados [11], el uso de una línea celular de cáncer de colon podría ser adecuado para el modelo de metaplasia intestinal.

Para evaluar mejor la relación entre CDX2 y expresión reg IV, se estudió la expresión reg IV en una línea derivada-HT-29 con la actividad CDX2 estrictamente regulados. Se utilizó una línea de células HT-29 policlonal que habían sido transducidas con el vector pCDX2-ER. El vector pCDX2-ER codifica una proteína quimérica en la que las secuencias de longitud completa CDX2 se fusionan aguas arriba de un receptor de estrógeno mutado (ER) de dominio de unión a ligando. El dominio de unión ligando-ER mutado ya no se une el estrógeno, pero retiene la capacidad de unirse tamoxifeno. El tratamiento de la línea celular /CDX2-ER-29 HT-4 con hidroxitamoxifeno (4-OHT) dio lugar a una fuerte inducción de la expresión de la proteína Reg IV dentro de las 48 horas (Fig. 1C). Estos resultados indican que Reg IV es un gen diana directa o primaria regulada por CDX2. Sin embargo, CDX2 por sí sola no es suficiente para activar la expresión Reg IV.

La inhibición de CDX2 mediante ARN de interferencia (RNAi) se traduce en la baja regulación de la regla IV en células GC

Para determinar si CDX2 es necesaria para la expresión reg IV en las células de GC, se analizó el efecto de inhibir la expresión de CDX2 por RNAi en el nivel de expresión reg IV en la línea de células HSC-39 debido a alta CDX2 endógena y la expresión reg IV se detectó en la línea celular HSC-39. pequeños ARN-CDX2 específica de interferencia (siRNAs) expresión de la proteína CDX2 suprimió de forma significativa 3 días después de la transfección y expresión de Reg IV transcripción se redujo reguladas aproximadamente el 50% en CDX2 siRNAs en HSC-39 en comparación con sus niveles en las células siRNA tratados con control ( Fig. 1D). Estos resultados indican que CDX2 participa en el mantenimiento Reg IV expresión génica.

Caracterización funcional de la región flanqueante 5 'de REG4
Gene de ensayo de luciferasa

Para identificar el potencial CDX2 -sitios de unión en el caudal se realizó REG4
región promotora, una búsqueda de las secuencias genómicas inmediatamente 5 'del sitio de inicio de la transcripción de presunción, utilizando un elemento de unión para el pollo CDXA consenso
homólogo (5'-a, a /T, T, a /T, a, T, a /G-3 ') [26] y un algoritmo de búsqueda descrito anteriormente [27]. Encontramos cuatro sitios de unión CDX2-putativos en el 2 kilobases (kb) 5'-región de acompañamiento de la REG4
gen (Fig. 2A). Estos fueron: el sitio A (5'-AATAATA-3 ', -1828--1,834), el sitio B (5'-CTTTACAG-3', -901 a -908), el sitio C (5'-3-TTTTATGG ', -114 a -121), el sitio D (5'-AATAATA -3', -90 a -96). Para evaluar el papel de estos sitios de unión CDX2-presuntivos en la regulación de REG4
la transcripción, se generaron varias construcciones del gen indicador. Como se muestra en la Fig. 2B, reportero construcciones genéticas que contienen 2,1, 1,2 o 0,6 kb de 5'-secuencia de acompañamiento de la REG4
gen mostró una fuerte actividad en las células HSC-39, que muestran una fuerte expresión endógena de REG4
transcripciones y proteínas. Por comparación, las células MKN-1 tienen poco endógena de REG4 Versión taquigráfica y muestran poca o ninguna actividad transcripcional inducida por las 2.1, 1.2, o 0.6 kb REG4
construcciones del gen indicador (datos no mostrados) . La REG4
construcciones de genes reportero que contienen pares de bases -116 a 58 y -87 a 58 habían reducido la actividad en las células HSC-39 (Figura 2B.), Lo que indica que las secuencias entre -634 pares de bases y - 116 desempeñan un papel clave en la activación de REG4
transcripción. Por otra parte, se analizaron las mutaciones únicas y múltiples en los sitios de unión CDX2-presuntivos en la región 5'-acompañamiento del REG4
génica usando células HSC-39 (Fig. 2C). Como era de esperar, presunto sitio de unión CDX2-C, que se encuentra entre los pares de bases -634 y -116, juega un papel crucial en la activación de REG4
transcripción.

CDX2 se une directamente al extremo 5 ' -flanking región de REG4
génica

para analizar si CDX2 se une directamente a los sitios de unión CDX2-putativos en el REG4 región
flanqueante 5 ', se realizó la inmunoprecipitación de la cromatina (cHIP) ensayos utilizando células HSC-39. Usando 6 cebadores para la REG4
región flanqueante 5 '(Fig. 3A), se recuperaron fragmentos de ADN que contienen el REG4
5'-región de acompañamiento de imprimación 1, que abarca CDX2- presuntiva sitio de unión C (Fig. 3B). Los fragmentos de ADN de la región flanqueante 5 'de REG4
, que fueron generados usando cebadores 2, 3, 4, 5 y 6, de forma que no contienen sitios de unión CDX2 presuntivos, no fueron recuperados por el anti- anticuerpo CDX2. La especificidad de la recuperación de la REG4
región promotora siguiente chip con anticuerpo anti-CDX2 se demostró por el hecho de que otros fragmentos de ADN irrelevante que carecen de sitios de unión CDX2-(por ejemplo, el exón 3 del CDX1
gen) no se recuperaron (Fig. 3B). Además, inmunoprecipitación maqueta (IgG de ratón) produjo pocos REG4
o CDX1
fragmentos de ADN específicos de (Fig. 3B). Todos estos hallazgos sugieren que CDX2 activa REG4
la transcripción uniéndose directamente a las secuencias de la región flanqueante 5 'del gen.

trimethylation de la histona H3 lisina 27 (H3K27me3) en el em <> REG4
Promotor en el GC líneas celulares

a pesar de expresión de la proteína CDX2 se encontró en MKN-28 líneas de células MKN-1 y, estas 2 líneas de células carecían de expresión detectable de REG4 Versión taquigráfica y proteínas. Debido a que se ha informado de que la hipermetilación del ADN de las islas CpG está asociada con el silenciamiento de varios genes [28], investigamos si la metilación del ADN induce la inactivación transcripcional de Reg IV en MKN-1 y las células MKN-28. Se han tratado estas células con un agente de desmetilación, 5-aza-2 'desoxicitidina (Aza-dC) y luego realizaron QRT-PCR. Sin embargo, la expresión Reg IV no fue restaurado en estas líneas celulares (datos no presentados), lo que sugiere que la metilación del ADN no es probable que afecte la expresión Reg IV. También se ha informado de que H3K27me3 se ha asociado con la expresión de genes reprimidos [29]. Además, investigó H3K27me3 en líneas celulares de GC. Para determinar el enriquecimiento de H3K27me3 en el REG4
promotor en las líneas celulares de GC, se realizaron ensayos de chip. En MKN-1 y MKN-28 líneas celulares, los niveles H3K27me3 en el REG4
región promotora eran altos, mientras que en la línea de células HSC-39, nivel H3K27me3 en el REG4
región promotora fue baja (Fig. 3C). Estos resultados sugieren que la estructura de la cromatina cerrado de REG4
promotor puede inhibir la expresión Reg IV por CDX2.

Discusión

Aunque se ha informado de que la expresión de Reg IV es inducida por GLI1 [21] o EGF [22], es poco probable que explicar la asociación entre reg IV y diferenciación intestinal estas moléculas. En el presente estudio, hemos demostrado que la expresión endógena y CDX2 Reg IV se correlaciona bien en líneas celulares de GC. Además, el uso de un formulario de ER-regulada de CDX2, se encontró que hubo una rápida inducción de la expresión Reg IV después del tratamiento 4-OHT. ensayos de gen reportero revelaron un papel importante para los elementos en el REG4
región promotora de ADN CDX2 vinculante consenso en su transcripción. Chip ensayos posteriores demostraron que CDX2 se une directamente a la REG4
promotor. Anteriormente puso de manifiesto que en el tejido GC primaria y metaplasia intestinal del estómago, CDX2 y expresión Reg IV se correlaciona bien [11]. Estos resultados indican que la proteína CDX2 regula directamente la expresión Reg IV en GC y metaplasia intestinal del estómago.

CDX2 se sobreexpresa en GC fenotipo intestinal y en la metaplasia intestinal del estómago [9], [25]. En contraste, no se observó pérdida de expresión de CDX2 en un subconjunto de cánceres colorrectales primarios, cánceres colorrectales por lo general en mal diferenciados [30]. El significado de alteración de la expresión CDX2 en cánceres humanos no está claro, y por lo tanto es importante definir los genes diana que son aguas abajo de CDX2. Hemos identificado varios genes CDX2 regulados como CDH17 gratis (que codifica LI-cadherina) [24], HEPH gratis (que codifica hefaestina) [31], ABCB1
(que codifica la resistencia a múltiples fármacos 1) [32], y DSC2 gratis (que codifica desmocolina 2) [33]. Entre estos genes, ABCB1
fue originalmente identificado como un gen sobreexpresado y amplificado en múltiples células resistentes a los fármacos, y su producto, P-glicoproteína, parece jugar un papel fundamental en la resistencia a los medicamentos [34]. Anteriormente, se informó de que la expresión forzada de Reg IV en las células GC inhibe la apoptosis inducida por 5-FU a través de la inducción de Bcl-2 y dihidropirimidina [8] deshidrogenasa. Tomados en conjunto, es posible que en GC intestinal fenotipo, la expresión (o la expresión ectópica) de CDX2 induce Reg IV y multirresistencia 1 de expresión, dando como resultado un aumento de la resistencia a las drogas. De hecho, se ha informado de que la quimioterapia postoperatoria no es beneficioso para los pacientes con fenotipo intestinal GC [35].

Aunque nuestros datos apoyan la opinión de que CDX2 juega un papel en la regulación REG4
transcripción a través de la unión a la región promotora, varios hallazgos indican que CDX2 por sí sola no es suficiente para activar REG4
expresión. En el presente estudio, hemos generado una población policlonal de MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, y KATO-III células que expresan altos niveles de CDX2 por la infección con retrovirus que llevan un cDNA CDX2 humano de longitud completa. Sin embargo, la sobreexpresión de CDX2 no pudo activar la expresión Reg IV. En líneas celulares de GC, ninguna de las líneas celulares con expresión de la proteína CDX2 indetectable tenía detectables REG4
transcripciones y proteínas. Por lo tanto, CDX2 se requiere para la expresión Reg IV, pero CDX2 por sí sola no es suficiente para activar la expresión Reg IV. En el presente estudio, se estudiaron nueve líneas celulares de GC. Los orígenes de las líneas celulares fueron los siguientes. Las líneas de células MKN MKN-74-7, MKN-28, y se establecieron a partir CG de tipo intestinal. Las líneas de células TMK-1 y MKN-45 se establecieron a partir GC tipo difuso. líneas celulares de la KATO-III, HSC-39, y HSC-44PE se establecieron a partir carcinoma de células en anillo de sello. La línea celular MKN-1 se estableció a partir carcinoma de células adenoescamosa. Debido a que en la metaplasia intestinal del estómago, CDX2 y expresión Reg IV se correlacionan bien, las líneas celulares establecidas a partir de GC GC tipo difuso o carcinoma de células en anillo de sello puede no ser adecuado para el análisis de la inducción Reg IV de CDX2. De hecho, la expresión Reg IV puede ser inducida por CDX2 en líneas celulares derivadas de cáncer de colon en el presente estudio. Además, se demostró que los niveles H3K27me3 en el REG4
región promotora fueron altas en líneas de células MKN-1 y MKN-28 GC. Estas líneas celulares 2 carecían de expresión detectable de REG4
aunque la expresión de proteína CDX2 fue encontrado. Por lo tanto, los niveles de H3K27me3 en el REG4
región promotora pueden ser altos en MKN-7, TMK-1, HSC-44PE, y Kato-III células, en el que la sobreexpresión de CDX2 no lograron activar la expresión Reg IV.

se ha informado de que REG4
la expresión de ARNm se ve reforzada por la estimulación con TGF-α, EGF, HGF, o bFGF a través de la activación de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) [22] . Por lo tanto, podría ser la hipótesis de que Reg IV también está regulada por factores de transcripción aguas abajo de las vías de MAPK. Se realizó in silico
análisis de la REG4
gen de la región 5'-acompañamiento, y han encontrado al menos un presunto AP-1 secuencias de consenso (a -883 pares de bases de REG4
gen de la región), que es un factor de transcripción aguas abajo de la señalización de MAPK flanqueante 5 '. En el presente estudio, HSC-39 células mostraron actividad transcripcional similar de reportero construcciones genéticas que contienen de 1,2 kb y 0,6 kb de REG4
secuencia 5'-acompañamiento. Como el efecto de EGF o TGF-α en REG4
la transcripción no fue investigada en el presente estudio, se necesita más investigación para aclarar los mecanismos de señalización que inducen la regulación de los REG4
transcripción.

En conclusión, nuestros datos actuales muestran que la proteína CDX2 regula directamente la expresión reg IV. Reg IV activa la ruta de señalización de EGFR /Akt /AP-1. Como intestinal GC fenotipo expresa frecuentemente EGFR [36], se sugiere que esta vía activado-IV Reg juega un papel importante en este subtipo de GC. Debido a que CDX2 también induce la expresión del gen de resistencia a múltiples fármacos, ABCB1
, la terapia anti-EGFR, pero no la quimioterapia puede ser beneficiosa para los pacientes con GC fenotipo intestinal.

Materiales y Métodos

los plásmidos

el ADNc CDX2 se insertó en el sitio de clonación múltiple del vector de expresión retroviral PPG-CMV-CITE-neo como se describe anteriormente [24]. La larga duración, de tipo salvaje CDX2 ADNc también se subclonó en el vector retroviral pBabe-Puro ER como se describió anteriormente para generar pCDX2-ER [24]. El vector pCDX2-ER codifica una proteína quimérica en la que las secuencias de longitud completa CDX2 se fusionan aguas arriba de un dominio de unión a ligando-ER mutado. El dominio de unión ligando-ER mutado ya no se une el estrógeno, pero retiene la capacidad de unirse tamoxifeno. secuencias de ADN genómico de la región flanqueante 5 'de la humana REG4
gen fueron amplificados por PCR utilizando ADN genómico purificado a partir de células HSC-39 como una plantilla y se subclonó en el [luc2] vector pGL4.10 (Promega , Madison, WI). Los enfoques basados ​​en PCR se utilizaron para introducir mutaciones en los sitios de unión CDX2-presuntivos en la construcción del gen reportero pGL4.10-REG4 utilizando QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jolla, CA). Cuatro sitios de unión putativos-CDX2 se cambiaron. Todos los fragmentos generados por PCR se verificaron mediante secuenciación automatizada. El vector plásmido pGL4.74 [hRluc /CT] (Promega) se utilizó como control para la eficacia de transfección en los ensayos de reportero.

Líneas Celulares, infecciones por retrovirus, y Tratamiento de Drogas

El anfotrópica Phoenix línea celular de empaquetamiento fue proporcionado por G. Nolan (Universidad de Stanford, Stanford, CA) [37]. Se utilizaron nueve líneas celulares derivadas de GC humana y 2 líneas celulares derivadas de cáncer de colon humano. La línea celular TMK-1 se estableció en nuestro laboratorio [38]. Las líneas de células HSC-39 y HSC-44PE fueron establecidos por uno de los autores (Kazuyoshi Yanagihara) [39], [40]. Cinco líneas de células de GC de la serie MKN fueron amablemente proporcionados por el Dr. Suzuki Toshimitsu [41], [42]. La línea de células KATO-III fue proporcionado amablemente por el Dr. Morimasa Sekiguchi [43]. Las líneas celulares de cáncer de colon HT-29 y SW480 se obtuvieron de la American Type Culture Collection. Las células se almacenan en nitrógeno líquido hasta el inicio de este estudio. Después de la descongelación de las existencias congeladas, las células se mantuvieron a bajo paso durante todo el estudio. la morfología celular Consistente se controló mediante la comparación de imágenes microscópicas. Las células de empaquetamiento Phoenix fueron transfectadas con las construcciones retrovirales de expresión (PPG-CDX2, PPG-neo, y pCDX2-ER) y el sobrenadante que contiene el virus no se dividen anfotrópico se cosechó tal como se describe anteriormente [24]. En las células HT-29 que expresan la proteína de fusión CDX2-ER (HT-29 /CDX2-ER), la función CDX2 se activó mediante la adición de 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT) (Sigma Chemical, St. Louis, MO) para el crecimiento medio a una concentración final de 500 nmol. Para investigar si la metilación del ADN induce la inactivación transcripcional de Reg IV, las células se trataron con una concentración final de 1 mM Aza-dC (Sigma Chemical) durante 5 días antes de que se recogieron para la extracción de RNA.

Análisis Western Blot

Por Western blot, las células se lisaron como se describe anteriormente [44]. Las concentraciones de proteína se determinaron mediante el ensayo de proteínas de Bradford (BioRad, Richmond, CA) con BSA se utiliza como el estándar. Los lisados ​​(20 g) se solubilizaron en tampón de muestra de Laemmli hirviendo y después se sometió a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida al 12%, seguido de electro-transferencia sobre un filtro de nitrocelulosa. El filtro se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con un anticuerpo anti-Reg IV (anticuerpo policlonal de conejo desarrollado en nuestro laboratorio, Ref. 10) o el anticuerpo anti-CDX2 (BioGenex, San Ramon, CA). Y conjugado con peroxidasa anti-conejo o anti-IgG de ratón se usó en la reacción secundaria. Los inmunocomplejos se visualizaron con un sistema ECL Plus Western Blot detección (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). β-actina (Sigma Chemical) se detectó también como control de carga.

Análisis QRT-PCR

ARN total fue extraído con un kit RNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA), y 1 g de RNA total se convirtió en cDNA con un Kit de Síntesis de ADNc de la primera cadena (Amersham Biosciences). La cuantificación de REG4
niveles de mRNA se realizó por detección de fluorescencia en tiempo real como se describe anteriormente [45]. PCR se realizó con un kit SYBR Green PCR Core Reagents (Applied Biosystems, Foster City, CA). Detección en tiempo real de la intensidad de emisión de SYBR verde unido al ADN de doble cadena se realizó con un ABI PRISM 7900 Sequence sistema de detección (Applied Biosystems) tal como se describe anteriormente [46]. ACTB
productos de PCR fueron amplificados específicos de de las mismas muestras de ARN y sirvieron como control interno. Las secuencias de los cebadores para REG4
QRT-PCR se muestran en la Tabla 1. QRT-PCR se realizaron por triplicado para cada conjunto de cebadores de la muestra, y la media y desviación estándar (DE) de los tres experimentos se calculó como la valor de cuantificación relativa. Al final de 40 ciclos de PCR, los productos de reacción se separaron por electroforesis en geles de poliacrilamida al 8% no desnaturalizantes para la confirmación visual de los productos de PCR.

RNAi

Para desmontables el CDX2 endógeno, se realizó RNAi . Dos dúplex de siRNA dirigidos CDX2 (5'-AACCAGGACGAAAGACAAAUA-3 ', CDX2 siRNA1; y 5'-AAGCCUCAGUGUCUGGCUCUG-3', CDX2 siRNA2) y un dúplex siARN nonsilencing (5'-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3 ') fueron sintetizados (Qiagen). La transfección se realizó utilizando Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. En resumen, 60 pmol de siRNA y 10 l de Lipofectamine RNAiMAX se mezclaron en 1 ml de medio RPMI (10 nmol /L concentración siRNA final). Después de 20 min de incubación, se añadió la mezcla a las células y éstas se sembraron en platos para cada ensayo. Tres días después de la transfección, las células se analizaron para todos los experimentos.

gen reportero ensayos

HSC-39 y MKN-1 células fueron sembradas en placas de 6 pocillos (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ ). La transfección de las células en 50% -80% de confluencia se realizó con 3 l de reactivo de transfección FuGENE6 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), 0,8 g de pGL4.10 construcciones del gen indicador, y 0,2 g pGL4.74 [hRluc /TK] vector (Promega). A las 48 horas después de la transfección, se recogieron las células y se resuspendieron en tampón de lisis pasiva (Promega). La actividad de luciferasa se determinó con un sistema de ensayo de luciferasa dual (96 GloMax luminómetro de microplacas, Promega).

Los ensayos de chip

Los ensayos de chip se realizaron con el EZ-chip Inmunoprecipitación de cromatina Kit (Millipore, Billerica , MA) según las instrucciones del fabricante. Para analizar si CDX2 se une directamente a los sitios de unión CDX2-putativo de la región REG4
flanqueante 5 ', se realizó los ensayos de chip utilizando células HSC-39. En resumen, HSC-39 células (1-2 x 10 ^{7) fueron reticuladas con formaldehído al 1% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 15 minutos a 37 ° C, y se añadió glicina para saciar aldehídos reactivos. Después de lavar las células con PBS frío, las células se resuspendieron en SDS tampón de lisis (1% de SDS, EDTA 10 mM, y Tris 50 mM pH 8,1) con Proteinase Inhibitor (Roche Diagnostics). Después las muestras se sometieron a ultrasonidos, extractos que contienen fragmentos de ADN de la cromatina (tamaño medio, 500 pares de bases) se inmunoprecipitaron usando el anticuerpo monoclonal anti g 2-CDX2 (BioGenex) o 2 mg de IgG de ratón (Millipore). Cada muestra de ADN inmunoprecipitado se cuantificó mediante qPCR usando los cebadores listados en la Tabla 1. Como un control negativo, una de aproximadamente 200 pares de bases del fragmento de ADN desde el exón 3 de la CDX1
gen se amplificó por PCR usando cebadores específicos (Tabla 1 ).}

Para determinar el enriquecimiento de H3K27me3 en el REG4
promotor en las líneas celulares de GC, ensayos de chip se realizaron con MKN-1, MKN-28, y líneas de células HSC-39. En breves, células GC (1-2 × 10 ^{7) fueron reticuladas con formaldehído al 1% en PBS durante 15 minutos a 37 ° C, y se añadió glicina para saciar aldehídos reactivos. Después de lavar las células con PBS frío, las células se resuspendieron en tampón de lisis SDS con Proteinase Inhibitor (Roche Diagnostics). Después las muestras se sometieron a ultrasonidos, extractos que contienen fragmentos de ADN de la cromatina (tamaño medio, 500 pares de bases) se inmunoprecipitaron utilizando 2 mg anti-H3K27me3 anticuerpo policlonal (Abcam, Cambridge, MA) o 2 mg de IgG de conejo (Millipore). Cada muestra de ADN inmunoprecipitado se cuantificó mediante qPCR utilizando REG4
Primer 1 (Tabla 1).}

qPCRs se realizaron por triplicado para cada conjunto de cebadores de la muestra, y la media y desviación estándar (DE) de los tres experimentos se calculó como el valor de cuantificación relativa. Al final de 40 ciclos de PCR, los productos de reacción se separaron por electroforesis en geles de poliacrilamida al 8% no desnaturalizantes para la confirmación visual de los productos de PCR.

Reconocimientos

Agradecemos al Sr. Shinichi Norimura por su excelente asistencia técnica y asesoramiento. Este trabajo se realizó con la amable cooperación del Centro de Investigación de Medicina Molecular, Facultad de Medicina, Universidad de Hiroshima. Agradecemos al Centro de Análisis de Ciencias de la Vida, Universidad de Hiroshima, para el uso de sus instalaciones.

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