PLOS ONE: significado clínico de miR-137 Expresión en pacientes con cáncer gástrico Después Radical Gastrectomy

Extracto

La desregulación de miR-137 juega un papel vital en la oncogénesis y la progresión de diversos tipos de cáncer, pero su papel en el pronóstico de pacientes con cáncer gástrico sigue siendo desconocido. Este estudio fue diseñado para investigar la expresión y la importancia pronóstica de miR-137 en pacientes con cáncer gástrico después de gastrectomía radical. Quantitative PCR en tiempo real (qRT-PCR) se realizó para evaluar la expresión de miR-137 en líneas celulares de cáncer gástrico y tejidos humanos en pacientes con adenocarcinoma gástrico. Los resultados se evaluaron para la asociación con factores clínicos y la supervivencia global mediante el uso de análisis de Kaplan-Meier. valores pronósticos de miR-137 expresión y clínicos resultados se evaluaron mediante análisis de regresión de Cox. Los resultados mostraron que el nivel de expresión de miR-137 se redujo en líneas celulares de cáncer gástrico y tejidos humanos, y las reguladas expresión de miR-137 fue asociada a la diferenciación de las células tumorales, la etapa N, y el estadio TNM. Disminución de la expresión de miR-137 en tejidos de cáncer gástrico se correlacionó positivamente con una pobre supervivencia global de los pacientes con cáncer gástrico. Un análisis más detallado de regresión de Cox multivariado sugirió que la expresión de miR-137 era un indicador pronóstico independiente para el cáncer gástrico excepto para el estadio TNM. Aplicando el valor pronóstico de la expresión de miR-137 al estadio TNM del grupo III mostró una mejor estratificación del riesgo para la supervivencia general. En conclusión, los resultados refuerzan el papel crítico para la expresión de miR-137 las reguladas en el cáncer gástrico y sugirieron que la expresión de miR-137 podría ser un indicador pronóstico de esta enfermedad. Además, estos pacientes con cáncer de estómago en estadio TNM III y baja expresión de miR-137 podrían necesitar tratamiento postoperatorio más agresivo y un seguimiento más estrecho

Visto:. Gu Q, Zhang J, Hu H, Tan Ye, Shi S, Nian Y (2015) Importancia clínica de miR-137 Expresión en pacientes con cáncer gástrico después de gastrectomía radical. PLoS ONE 10 (11): e0142377. doi: 10.1371 /journal.pone.0142377

Editor: Hiromu Suzuki, Universidad Médica de Sapporo, Japón

Recibido: 14 Agosto, 2015; Aceptado: 21 Octubre 2015; Publicado: 6 Noviembre 2015

Derechos de Autor © 2015 Gu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel

financiación:.. los autores no tienen ningún soporte o financiación reportar

Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

china es uno de los países con mayor incidencia de cáncer gástrico y representa más del 40% de todos los casos nuevos en todo el mundo [1,2]. A pesar de la terapia agresiva, el pronóstico del cáncer gástrico avanzado en China tiende a ser pésimo [3,4]. En la actualidad, tumor-nódulo-metástasis (TNM) sistema de clasificación de la Unión para la Comisión Mixta Internacional contra el Cáncer /Americana del Cáncer (UICC /AJCC) es el factor pronóstico más importante para el cáncer gástrico [5]. Sin embargo, porque no hay heterogeneidad en el nivel molecular de cáncer gástrico, es insuficiente para sólo se basan en el escenario TNM para predecir el pronóstico de cáncer gástrico [6]. Por lo tanto, la identificación de marcadores moleculares que son predictivos de la agresividad del cáncer gástrico y el pronóstico de los pacientes como suplemento del estadio TNM tiene el potencial de mejorar la capacidad de tratar a los pacientes y podría proporcionar información clínicamente relevantes de importancia en la gestión de la enfermedad. Además, la selección de los pacientes que podrían beneficiarse de la mayor precisión en el tratamiento es considerado como el mejor método para reducir las tasas de mortalidad de cáncer gástrico a excepción de la cirugía.

Los microARN (miRNA) son pequeñas endógenos 19-25 nucleótidos ARN que regulan la expresión génico post transcriptionally a través de apareamiento de bases con la región 3 'no traducida (3'-UTR) del ARN mensajero (ARNm) diana no codificante, que resulta en la degradación del ARNm o la inhibición de la traducción [7]. En muchos cánceres humanos, miRNAs puede funcionar como oncogenes o genes supresores de tumor para suprimir la traducción o inducir la degradación del ARNm, dependiendo de la naturaleza de sus objetivos [8]. Anteriormente estudios demostraron que la expresión de miR-137 es regulada hacia abajo y se considera como un marcador pronóstico en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de pulmón [9], el cáncer colorrectal [10], el cáncer de ovario [11], mieloma múltiple [12] , tumor estromal gastrointestinal [13], glioblastoma [14], y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello [15]. Se ha demostrado recientemente que la expresión de miR-137 se redujo significativamente en los tejidos de cáncer gástrico, y la supresión era simultáneamente con la gravedad de los cambios patológicos, lo que sugiere el papel potencial supresor de tumor de miR-137 en el cáncer gástrico [16]. Sin embargo, un extenso análisis de la expresión de miR-137 en correlación con el pronóstico de los pacientes con cáncer gástrico no se ha realizado y espera una aclaración adicional.

El objetivo principal de esta investigación es evaluar la relación entre la expresión del MIR 137 y en la supervivencia global de los pacientes con cáncer gástrico en un esfuerzo por identificar el significado pronóstico de la expresión de miR-137. Los resultados de este estudio muestran que el nivel de expresión de miR-137 fue baja regulación en células de cáncer gástrico y los tejidos, y miR-137 expresión era un indicador pronóstico independiente para el cáncer gástrico.

Materiales y Métodos

Ética declaración

Este estudio fue revisado y aprobado por la Junta de Revisión Institucional de el Segundo hospital Afiliado de la Universidad Xi'an Jiaotong y el hospital Afiliado de la Universidad de Yan'an (provincia de Shanxi, china). Todos los participantes en el estudio, o su tutor legal, siempre que su consentimiento informado por escrito antes de la inscripción en el estudio.

Cultivo de células

línea celular epitelial gástrico humano líneas celulares de cáncer inmortalizadas normales GES-1 y cinco gástricos humanos, incluyendo MKN-45, SGC7901, BGC-823, MGC-803, y AGS, se obtuvieron directamente de Shanghai Banco de células de la Academia china de Ciencias (Shanghai, china). Todas estas células se hicieron crecer y se mantuvieron en RPMI-1640 (Gibco) medio de cultivo suplementado con 10% de suero fetal bovino (Invitrogen) a 37 ° C en un incubador de células humidificado con una atmósfera de 5% de CO _2.

muestras clínicas

tejidos adenocarcinoma gástrico frescas y tejidos normales adyacentes fueron recogidos a partir de dos conjuntos independientes que comprenden 154 pacientes con adenocarcinoma gástrico. Todos los pacientes incluidos en este estudio fueron gastrectomía radical secuencial (resección R0 según la UICC /AJCC y linfadenectomía D2). Se obtuvieron muestras de conjunto de entrenamiento (n = 67) entre enero de 2005 y diciembre de 2009 de El Segundo Hospital Afiliado de la Universidad Jiaotong de Xi'an (provincia de Shanxi, China), y se obtuvieron muestras de conjunto de validación (n = 87) entre enero de 2008 y diciembre de 2010 del hospital Afiliado de la Universidad de Yan'an (provincia de Shanxi, china). Las muestras se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido hasta su uso. Las muestras fueron reevaluados por dos patólogos de forma independiente, y la etapa del cáncer gástrico se clasifican de acuerdo con el sistema TNM de la UICC /[5] AJCC. Los pacientes fueron excluidos si habían estado expuestos a cualquier terapia dirigida, radioterapia, quimioterapia y /o terapia de intervención para el cáncer gástrico.

QRT-PCR

El ARN total que contiene los genes miARN fue extraído a partir cultivadas células o tejidos utilizando miRNeasy Mini Kit (Qiagen). cDNA se sintetizó usando miScript Reverse Transcription Kit (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. La transcripción inversa se llevó a cabo utilizando 50 ng de ARN total con un cebador específico para miR-137, junto con el kit de transcripción inversa SYBR Green microRNA. miRNAs se cuantificaron usando el ensayo de SYBR Green miRNA QRT-PCR de acuerdo con el protocolo del fabricante (Applied Biosystems). La reacción QRT-PCR se llevó a cabo en un sistema en tiempo real Fast 7500 (Applied Biosystems). Todos los cuantitativos RT-PCR se realizaron por triplicado. Los datos se analizaron usando una línea de base automatizada. El ciclo umbral (Ct) se define como el número de ciclo fraccional al que la fluorescencia excede el umbral dado. Los datos obtenidos de la qRT-PCR se analizaron mediante el método ΔΔCt (2 ^{ΔΔCt). Los conjuntos de cebadores de PCR usados ​​aquí por el miR-137 fue diseñado de la siguiente manera: el miR-137 cebador directo: 5'-GCGCGC TTATTGCTTAAGAATAC-3 ', y el cebador inverso: 5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'. U6 se utilizó como control interno y se amplificó con el cebador directo: 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3 ', y el cebador inverso: 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'.}

El análisis estadístico

El análisis estadístico fue realizado utilizando GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, EE.UU.) y SPSS 19.0 (SPSS, Chicago, IL, EE.UU.). La supervivencia global se define como el tiempo entre el primer día del diagnóstico y la fecha de la muerte relacionada con el cáncer o la última visita de seguimiento. χ de Pearson ^{2 o la prueba exacta de Fisher para analizar la relación entre el miR-137 expresión y factores clínico-patológicos. tasas de supervivencia acumulada se calcularon por el método de Kaplan-Meier y las diferencias entre los subgrupos se examinaron mediante la prueba de log-rank. Números en riesgo se calcularon para el comienzo de cada período de tiempo. El valor pronóstico de la expresión de miR-137 se determinó mediante análisis univariante y multivariante. Todos los valores de p son dos caras, y P < 0,05 se consideró estadísticamente significativa}

Resultados

Análisis de la expresión de miR-137 en células de cáncer gástrico humano

Con el fin. para determinar el nivel de expresión de miR-137 en células de cáncer gástrico humano, que fueron evaluados por primera miR-137 expresión de QRT-PCR en línea de células epiteliales inmortalizadas humana normal gástrica cinco líneas celulares de cáncer gástrico humano, incluyendo MKN-45 GES-1 y, SGC7901, BGC-823, MGC-803, y AGS. Como se muestra en la figura 1A, las células de cáncer gástrico humanos expresaron niveles significativamente más bajos de miR-137 de GES-1. En conjunto, estas observaciones sugieren que la expresión de miR-137 se reduce en las células de cáncer gástrico en comparación con la célula humana normal inmortalizada gástrica epitelial, y la disminución de la expresión de miR-137 puede estar relacionado con la oncogénesis de cáncer gástrico.

Las asociaciones entre la expresión de miR-137 y los factores clínico-

Los niveles de expresión de miR-137 se midieron además de analizar su relación con los factores clínico-patológicos. Los pacientes se dividieron en grupos de alto y bajo de expresión de acuerdo a la relación de sus /tejido de cáncer de la mediana de los niveles de expresión normales de miR-137 según los resultados de QRT-PCR (de corte ratio = 1,5). Y de acuerdo con el criterio, aproximadamente el 56,72% (conjunto de entrenamiento, 38 de 67) y 49.43% (conjunto de validación, 43 de 87), los tumores fueron anotados como una baja expresión de miR-137. Como se muestra en la Tabla 1, la expresión de miR-137 estaba significativamente asociado con la diferenciación celular tumoral (P = 0,009 y P = 0,002, respectivamente), N etapa (P = 0,019 y P < 0,001, respectivamente), y la etapa TNM (P = 0,007 y P = 0,007, respectivamente) en los dos conjuntos independientes. Además, en el conjunto de entrenamiento, el miR-137 expresión fue también significativamente relacionado con la etapa T (P = 0,002). Además, el porcentaje de pacientes con baja expresión de miR-137 aumentó acompañado con progresión de la enfermedad desde el estadio TNM I a III en los dos conjuntos independientes (Figura 1B y 1C).

Valor pronóstico de la expresión de miR-137 en pacientes con cáncer gástrico

para investigar más a fondo el valor pronóstico de la expresión de miR-137 en pacientes con cáncer gástrico, se comparó la supervivencia general de acuerdo con el miR-137 expresión, y se realizó un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier. Como se muestra en la figura 2, los pacientes con baja expresión de miR-137 mostraron supervivencia global significativamente más corta que aquellos altos en los dos conjuntos independientes (P < 0,001 y P < 0,001, respectivamente), lo que indica un impacto vital de miR-137 expresión de el resultado clínico en pacientes con cáncer gástrico. Además, los análisis univariado de la supervivencia global en este estudio mostraron que la baja expresión de miR-137 es un predictor pronóstico negativo significativo para los pacientes con cáncer gástrico en el conjunto de entrenamiento (hazard ratio [HR], 6,30; IC del 95%, 2,17 a la 18.27; P = 0,001) y el conjunto de validación (HR, 3,74; IC del 95%, 1,81 a la 7,73; P < 0,001). Además, la diferenciación de células tumorales (P = 0,023 y P = 0,048, respectivamente), la etapa de T (P = 0,002 y P = 0,012, respectivamente), N etapa (P = 0,004 y P = 0,001, respectivamente), el estadio TNM (P < 0,001 y P < 0,001, respectivamente), todos también afectó significativamente la supervivencia de cáncer gástrico (Tabla 2). Además, se realizaron análisis de regresión multivariante de Cox para derivar estimaciones de riesgo independientes relacionados con la supervivencia global. Como se muestra en la siguiente Tabla 3, el estadio TNM y miR-137 expresión fueron tanto reconocidos como parámetros independientes y significativos de pronóstico en los dos conjuntos independientes (conjunto de entrenamiento: estadio TNM: HR, 12,83; IC del 95%, 3,48 a 47,30; p < 0,001; miR-137 expresión: HR, 6,80; IC del 95%, 2,06 a la 22.48, p = 0,002; validación del conjunto: el estadio TNM: HR, 5,21; IC del 95%, 2,04 a la 13.31, p = 0,001; miR-137 expresión: HR, 2,41; IC del 95%, 1.13 a 5.11;. p = 0,023, respectivamente)

el análisis estratificado en el estadio TNM

Para determinar si la expresión de miR-137 podría estratificar a los pacientes con diferente estadio TNM estrato, hicimos análisis estratificados de pacientes con cáncer gástrico en estadio TNM I + II y III y el estadio TNM evaluaron el valor pronóstico de la expresión de miR-137 en los dos conjuntos independientes, respectivamente. Tal como se recoge en la Tabla 4, sólo los pacientes con cáncer gástrico en estadio TNM III podría ser estratificado por la expresión de miR-137 de manera significativa, el pronóstico de la etapa TNM III de pacientes con cáncer gástrico con alta expresión de miR-137 fue significativamente mejor que aquellos con bajos de miR-137 expresión en los dos conjuntos independientes (conjunto de entrenamiento: P = 0,006, conjunto de validación: P = 0,016, respectivamente; figura 3).

Discusión

china sigue siendo uno de los países con mayor incidencia de cáncer gástrico aunque que en muchos países industrializados ha disminuido durante las últimas décadas, y enfermedad en estadio avanzado ya presente en la gran mayoría de los pacientes [1,2,4]. Actualmente, el sistema de estadificación TNM de la UICC /AJCC es el factor pronóstico más importante para el cáncer gástrico [5]. Sin embargo, porque no hay heterogeneidad en el nivel molecular de cáncer gástrico, es insuficiente para sólo se basan en el escenario TNM para predecir el pronóstico de cáncer gástrico [6,17]. Por lo tanto, la identificación de marcadores moleculares que son predictivos de la agresividad del cáncer gástrico y el pronóstico de los pacientes como suplemento del estadio TNM tiene el potencial de mejorar la capacidad de gestionar los pacientes y podría proporcionar importantes conocimientos clínicamente relevantes en el tratamiento de la enfermedad. Además, la selección de los pacientes que podrían beneficiarse de un tratamiento mayor precisión y terapias dirigidas se considera como el mejor método para reducir las tasas de mortalidad de cáncer gástrico. La investigación sobre la relación entre los miRNAs y cáncer gástrico ha ido ganando la atención de los investigadores en el campo de la cirugía general, y esta investigación se ha convertido en un importante tema de investigación en los últimos años [7]. En el presente estudio, se evaluó el nivel de expresión de miR-137 en líneas celulares de cáncer gástrico humano con cuantitativa en tiempo real PCR, los resultados mostraron que las células de cáncer gástrico humano, incluyendo MKN-45, SGC7901, BGC-823, MGC- 803, y AGS, expresaron niveles significativamente más bajos de miR-137 de GES-1, que es una línea celular inmortalizada humana normal gástrica epitelial. Este resultado indicó que la expresión anormal miR-137 puede estar relacionado con la oncogénesis de cáncer gástrico. Sin embargo, aclarar el mecanismo subyacente de la desregulación de miR-137 en células de cáncer gástrico y tejidos espera una mayor investigación.

Lo mismo pasa con los otros miRNAs, se ha informado de que el miR-137 se correlaciona estrechamente con la formación y el desarrollo de los cánceres humanos [8,18]. Como componentes importantes de la regulación génica, en muchas células cancerosas humanas, miR-137 podría regular distintos genes e influir en sus funciones en muchas vías celulares. La proliferación celular y la migración del cáncer de mama pueden ser suprimidos por miR-137 mediante la supresión de estrógeno receptor relacionado con un (ERRA) [19]. Mientras que, en células de cáncer colorrectal, ectópico expresión de miR-137 también podría detención del ciclo celular, reprimir el crecimiento celular, e inhibir la invasión celular a través de proteína de direccionamiento de control de la división celular 42 homólogo (Cdc42) [20]. Recientemente, Wu et al. indicó que el miR-137 se actúa como supresor de tumores en células de cáncer gástrico por la orientación AKT2 y más que afecta el malo y GSK-3β, y potencialmente implicados en la tumorigénesis y la metástasis de cáncer gástrico [16]. Zheng y sus colegas demostraron que la expresión ectópica de miR-137 era suficiente para inhibir la proliferación de células de cáncer gástrico [21]. Además, Steponaitiene R et al. expuso que miR-137 metilación es un evento frecuente en los cánceres gastrointestinales que se produce al principio en forma gradual durante la carcinogénesis gástrica e inversamente correlacionada con la metilación global de [22]. Los estudios anteriormente mencionados confirman que el miR-137 juega un papel que es similar a miRNAs supresores de tumores. Sin embargo, todas estas investigaciones se llevan a cabo principalmente en las líneas celulares de cáncer gástrico, no se ha establecido la relación entre el nivel de expresión de miR-137 y los factores característicos clínicos de pacientes con cáncer gástrico. En la presente investigación, se evaluó la asociación entre la expresión de miR-137 y el pronóstico de los pacientes con cáncer gástrico después de gastrectomía radical, y encontramos que el miR-137 expresión era un factor pronóstico independiente de la supervivencia global de estos pacientes, además de estadio TNM y el pronóstico de los pacientes con baja expresión de miR-137 fueron significativamente peores que los de alto. Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio para identificar la expresión de miR-137 como un factor de mal pronóstico independiente para la supervivencia global de los pacientes con cáncer gástrico después de gastrectomía radical. Sobre la base de esta condición, aplicando el valor pronóstico de la expresión de miR-137 al estadio TNM del grupo III mostró una mejor estratificación del riesgo para la supervivencia global en pacientes con cáncer gástrico en etapa tardía. Sin embargo, el cambio potencial de la práctica clínica debe ser validado en un ensayo controlado aleatorio en el futuro.

Hasta la fecha, ya que los miRNAs representan un punto de acceso emergente de la investigación del cáncer, existe un interés cada vez mayor con respecto a las respuestas miARN a las exposiciones ambientales y de estilo de vida, incluyendo la condición social, las condiciones de vida y hábitos de vida, como el tabaquismo y el consumo de alcohol. Stánitz E et al. mostraron que el miR-21 y miR-143 eran regulados en marcha, y miR-34a se redujeron regulado en muestras de cáncer gástrico en los países occidentales [23]. A la luz de estas condiciones, si el miR-137 subexpresión también se observa en las muestras de cáncer gástrico de los pacientes de los países occidentales tiene que ser evaluado en el futuro. Además, el cáncer gástrico de la misma histopatología de población diferente de la región geográfica podría mostrar miRNAs diferenciales y los patrones de expresión de proteínas, lo que podría resultar de la existencia de diferentes factores de riesgo de carcinogénesis
.

Existen varias limitaciones de este estudio. En primer lugar, este estudio está limitado por el carácter retrospectivo de los análisis y los sesgos de selección no puede ser eliminado totalmente, aunque se recogieron los datos de una base de datos mantenida prospectivamente. En segundo lugar, hubo heterogeneidad en los umbrales utilizados para determinar el punto de corte de la expresión de miR-137 en esta investigación. fueron los más utilizada de forma coherente, se ha informado de los valores de la mediana sin embargo, una variedad de umbrales. En tercer lugar, no está incluyendo los datos de supervivencia libre de enfermedad en este estudio. Hay muchos factores, tales como los exámenes de seguimiento y el tratamiento postoperatorio, pueden influir en la supervivencia libre de enfermedad. Y los datos de supervivencia libre de enfermedad se deben recoger en las futuras investigaciones. Finalmente, el número de pacientes incluidos en este estudio es relativamente pequeño. Se necesitan estudios clínicos controlados aleatorios prospectivos grandes para identificar el valor pronóstico de la expresión de miR-137 en los pacientes con cáncer gástrico
.

En resumen, los resultados de este estudio demuestran que el miR-137 es un prometedor marcador para predecir la supervivencia global de los pacientes con cáncer gástrico después de gastrectomía radical. Por otra parte, estas etapas TNM III pacientes con cáncer gástrico con baja expresión de miR-137 podrían necesitar tratamiento postoperatorio más agresivo y un seguimiento más estrecho.

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