PLOS ONE: Alto Rendimiento Secuenciación y Copy Number Variación Detección Usando fijados con formol y tejido embebido en metastásico gástrico Cancer

Extracto

En la era de la terapia dirigida, perfiles de mutación del cáncer es un aspecto crucial de la toma de decisiones terapéuticas . Para caracterizar el cáncer a nivel molecular, el uso de tejido incluido en parafina y fijado en formalina es importante. Hemos probado el panel Ion AmpliSeq cáncer hotspot v2 y nCounter Copia Número Variación del ensayo en 89 muestras de cáncer gástrico en parafina fijados con formol para determinar si son aplicables en muestras clínicas de archivo para las terapias dirigidas personalizadas. Hemos validado los resultados con la secuenciación de Sanger, PCR en tiempo real cuantitativa, fluorescencia de hibridación in situ e inmunohistoquímica. detectaron mutaciones somáticas más frecuentes incluyen TP53 gratis (28,17%), APC gratis (10,1%), PIK3CA gratis (5,6%), KRAS gratis (4,5 %), SMO gratis (3,4%), STK11 gratis (3,4%), CDKN2A gratis (3,4%) y SMAD4 gratis (3,4%) . Las amplificaciones de HER2
, CCNE1
, MYC
, KRAS
y se observaron EGFR
genes en 8 (8,9%) , 4 (4,5%), 2 (2,2%), 1 (1,1%) y 1 (1,1%) casos, respectivamente. En los casos con la amplificación, hibridación in situ fluorescente para HER2
amplificación de genes verificado e inmunohistoquímica para HER2, EGFR y CCNE1 verificó la sobreexpresión de proteínas en células tumorales. En conclusión, se realizó con éxito la secuenciación basada en semiconductores y analiza la variación del número de copias nCounter en muestras de cáncer gástrico en parafina fijados con formol. La selección de alto rendimiento en muestras clínicas de archivos permite una detección más rápida, más precisa y rentable de las mutaciones de punto de acceso o la amplificación de genes

Visto:. Kim S, Lee J, Hong mí, ¿IG, Kang SY, Ha SY, et al. (2014) de Alto Rendimiento Secuenciación y Copy Number detección de variación Usando fijados con formol y tejido incluidas en el cáncer gástrico metastásico. PLoS ONE 9 (11): e111693. doi: 10.1371 /journal.pone.0111693

Editor: Hiromu Suzuki, de la Universidad Médica de Sapporo, Japón

Recibido: 28 de abril de 2014; Aceptado: September 29, 2014; Publicado: 5 Noviembre 2014

Derechos de Autor © 2014 Kim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y

Financiación:. Este estudio fue apoyado por una beca de la Corea del Healthcare Technology R & D Proyecto, Ministerio de Salud & Asuntos de bienestar, República de Corea (A101130) y una subvención de Samsung Instituto de Investigación Biomédica (# SBRI-SP1B20112). Este estudio también fue apoyado por una beca intramural Samsung Medical Center, 20 x 20 Proyecto (# GFO1140111). Los co-autores Seokhwi Kim, Jeeyun Lee, Min Eui Hong, En-Gu Do, So Young Kang, Sang Yun Ha, Seung Tae Kim, Se Hoon Park, Won Ki Kang Min-Gew Choi, Jun Ho Lee, Tae Sung Sohn , Jae Bae Luna, Sung Kim y Kim Kyoung-Mee son empleados de Samsung Medical Center. Co-autor Duk-Hwan Kim es empleada por Samsung Instituto de Investigación Biomédica. Samsung Instituto de Investigación Biomédica y Samsung Medical Center proporcionan apoyo en forma de salarios de los autores Seokhwi Kim, JL, MEH, IGD, SYK, Syh, STK, SHP, WKK, MGC, JHL, TSS, JMB, Sung Kim, KMK y DHK , pero no tuvo ningún papel adicional en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Las funciones específicas de estos autores se articulan en la sección 'autor' contribuciones

Conflicto de intereses:. Los autores tienen los siguientes intereses: Este estudio fue financiado en parte por el Instituto de Investigación Biomédica de Samsung y Samsung Medical Center. Los co-autores Seokhwi Kim, Jeeyun Lee, Min Eui Hong, En-Gu Do, So Young Kang, Sang Yun Ha, Seung Tae Kim, Se Hoon Park, Won Ki Kang Min-Gew Choi, Jun Ho Lee, Tae Sung Sohn , Jae Bae Luna, Sung Kim y Kim Kyoung-Mee son empleados de Samsung Medical Center. Co-autor Duk-Hwan Kim es empleada por Samsung Instituto de Investigación Biomédica. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.

Introducción

Mientras que el cáncer gástrico es el cuarto cáncer más común en el mundo, es la segunda principal causa de muerte. [1] Su incidencia es significativamente mayor en los países asiáticos, como Corea, donde es el segundo cáncer más común. [2] Recientemente, varias terapias dirigidas para el cáncer gástrico se han descubierto, que proporcionan opciones adicionales para los médicos y los pacientes [3] - [5]

En la era de la terapia dirigida, perfiles de mutación del cáncer causante. es crucial para la toma de decisiones terapéuticas. Los intentos para perfilar las mutaciones han sido realizadas con la secuenciación de Sanger tradicional; sin embargo, no es un método óptimo en entornos clínicos debido al costo, tiempo y mano de obra necesaria. Por otra parte, la secuenciación de Sanger requiere cantidades sustanciales de ADN; la evaluación de pequeñas cantidades de muestra para varios genes al mismo tiempo no es posible. Introducción de métodos de secuenciación de próxima generación (NGS) ha resuelto este problema mediante secuenciación multiplex, de alto rendimiento de muchas muestras para múltiples genes simultáneamente. [6], [7] Una de las plataformas NGS, el panel de cáncer de Ion Torrent AmpliSeq, se basa en la detección no óptica de iones de hidrógeno en un dispositivo semiconductor, [8] y es capaz de detectar 2.855 mutaciones oncogénicas en 50 genes comúnmente mutados (Tabla S1). Es superior a otros métodos de secuenciación basados ​​en espectroscopía de masas, proporcionando resultados de secuenciación más rápido ya menor costo. [8] Es aplicable en especímenes (FFPE) de tejido fijado en formol e incluidos en parafina con pequeñas cantidades de ADN. Debido a que garantiza una alta sensibilidad en la detección de mutaciones oncogénicas conocido, [9], [10] el Grupo cáncer Ion Torrent AmpliSeq es la elección de los 5 principales centros de cáncer en los Estados Unidos para el diagnóstico molecular de la terapia dirigida [11].

la amplificación de oncogenes es un mecanismo importante para la sobreexpresión de genes y contribuye al desarrollo de tumores. [12] Los ejemplos incluyen la amplificación de HER2
, MET
, FGFR2
y KRAS
genes en el cáncer gástrico. [13], [14] En la detección de variaciones del número de copias (CNV) en muestras clínicas, hibridación in situ fluorescente (FISH) y /o inmunohistoquímica (IHC) ha sido ampliamente utilizado. Sin embargo, los altos costos y los pequeños tamaños de muestra de los materiales de biopsia limitan la aplicación de estos métodos, y todavía hay una necesidad de una mayor tecnología de alto rendimiento con fácil accesibilidad, alta sensibilidad y bajo costo. Juegos de códigos nCounter la CNV (tecnologías Nanostring, Ciencias de la Vida, Seattle, WA) proporcionar una precisión y reproducibilidad superior para los estudios de todos los tamaños y de producir mejores resultados en menos tiempo con bastante menos esfuerzo que con la reacción en tiempo real en cadena de polimerasa cuantitativa (qPCR) o matrices CNV [ ,,,0],15].

tratamiento del cáncer adaptados Mejor-puede mejorar los resultados del paciente. se requieren muestras tumorales del paciente con el fin de caracterizar el cáncer a nivel molecular e identificar los subgrupos de enfermedades que deben recibir diferentes tratamientos. El uso de tejido FFPE es importante para que tales estudios. [16] Aquí hemos probado personalizados paneles CNV AmpliSeq y NCounter en muestras de cáncer gástrico FFPE para determinar si son aplicables en muestras clínicas de archivos para terapias dirigidas personalizadas.

Materiales y Métodos

porcentaje de células tumorales con más de 75% fueron disecados bajo microscopía de 4 mm secciones no teñidas por comparación con un H & e portaobjetos teñido, y se extrajo ADN genómico usando un kit de ADN de tejidos Qiagen FFPE (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante a partir de 96 pacientes con cáncer gástrico avanzado. Después de la extracción, que mide la concentración, así como 260/280 y 260/230 relación nm con un espectrofotómetro (ND1000, NanoDrop Technologies, ThermoFisher Scientific, MA, EE.UU.). Cada muestra se cuantificó con el fluorómetro Qubit (Life Technologies, Carlsbad, California). ADN genómico con > 10 ng mide por fluorómetro Qubit se sometió a la preparación de la biblioteca y siete muestras fallaron en construir bibliotecas y fueron excluidos de este estudio. Por último, 89 casos fueron analizados y, finalmente, incluidas 31 mujeres y 58 varones. La Tabla 1 enumera las características clínicas y patológicas de los pacientes en este estudio. La recurrencia o metástasis desarrollaron en 11 pacientes con la mediana del período de seguimiento de 76 meses (rango 5,5 a 149,3). El estudio fue aprobado por el comité de revisión institucional (IRB) de Samsung Medical Center. Toda la investigación clínica se llevó a cabo de acuerdo con los principios expresados ​​en la Declaración de Helsinki. El consentimiento informado escrito fue cortado por la IRB debido a un análisis retrospectivo y los datos anónimos. Las muestras se recogieron como parte de un procedimiento médico de rutina y fueron recogidos por los autores de este estudio. Las muestras de pacientes fallecidos o vivos pacientes fueron todos sin identificación, incluyendo la eliminación de cualquier tipo de información demográfica, antes del análisis y formulario de consentimiento informado se renunció por el IRB.

Panel de cáncer de Ion AmpliSeq v2

se utilizó el Ion AmpliSeq cáncer v2 Panel (Ion torrent) para detectar mutaciones somáticas frecuentes que se seleccionaron en base a revisión de la literatura. Examina 2855 mutaciones en oncogenes frecuentemente mutados 50 y los genes supresores de tumores (Tabla S1). En primer lugar, 10 ng de ADN de cada una de 89 muestras tumorales FFPE se sometió a un solo tubo, la amplificación por PCR multiplex utilizando el Ion AmpliSeqCancer Primer piscina y los reactivos Ion AmpliSeqKit (Life Technologies). El tratamiento de los amplicones resultantes con FUPA Reactivo digirió parcialmente los cebadores y fosforilada los amplicones. Los amplicones fosforilados se ligaron a adaptadores de iones y se purifica. Para la preparación de la biblioteca de código de barras, sustituimos los adaptadores de código de barras del ion Xpress adaptadores de código de barras 1-96 Kit para la mezcla con código de barras adaptador no suministrado en el Kit de Ion AmpliSeq Biblioteca. El ADN ligado se sometió a desplazamiento de la mella y amplificación para completar la conexión entre los adaptadores y los amplicones y generar suficiente material para la preparación plantilla de aguas abajo. Dos rondas de Agencourt AMPure XP reactivo de unión a 0.6 y 1.2-ratios de volumen de grano-a muestra de ADN retiran de entrada y cebadores no incorporados de los amplicones. Las moléculas de la biblioteca finales fueron 125~300 pb de tamaño. entonces transferimos las bibliotecas del Sistema OneTouch Ion para la preparación automatizada de plantilla. La secuenciación se realizó en el secuenciador Ion PGM de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilizamos IonTorrent software para análisis de datos automatizado.

Para medir la sensibilidad y especificidad del panel cáncer Ion AmpliSeq, se utilizaron resultados de la secuenciación del exoma enteros de 4 muestras de cáncer gástrico con el estado de mutación conocida [17].

nCounter Copia Número Variación conjuntos de códigos

Para la detección de la CNV, juegos de códigos Número nCounter Copia de variación fueron utilizados con 300 ng de ADN genómico purificado extraído de 2-3 secciones de 4 micras de espesor FFPE tumor bloques representativa utilizando QIAamp ADN FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Alemania). ADN se fragmentó mediante digestión AluI y desnaturalizado a 95 ° C. La fragmentación de ADN se hibridó con el conjunto de códigos de 86 genes en el cáncer nCounter CN Assay Kit (Nanostring Technologies) durante 18 horas a 65 ° C y se procesa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El analizador digital nCounter contó y tabularon las señales de las sondas indicadoras y números promedio de recuento de > 3 fueron llamados y confirmados por IHC, FISH o PCR en tiempo real

IHC para HER2, EGFR (HER1) y CCNE1.

para la validación de los resultados obtenidos a partir de la CNV nCounter, se realizó inmunohistoquímica para HER2 en todos los casos, y EGFR y CCNE1 en casos seleccionados. Después de desparafinación y rehidratación, 4 mm secciones sobre portaobjetos recubiertos de silano se immunostained para HER2. El HercepTest (Dako, Glostrup, Dinamarca) se utilizó de acuerdo con las directrices del fabricante como se ha descrito anteriormente. [18] Para EGFR que utiliza anticuerpo anti-NCL-L-EGFR-384 monoclonal de ratón primario (dilución 1:100; Novocastra /Vision Biosystems, Newcastle, Reino Unido) y para CCNE1 hemos utilizado anti-CCNE1 /ciclina E1 de anticuerpos (HE12 clon; 1:200 dilución; Thermo Fisher Scientific, MA). El sistema de deslizamiento tratamiento automatizado Ventana BenchMark XT se utilizó de acuerdo con el protocolo del fabricante. Un experto patólogo (KMK) evaluó los resultados

FISH para HER2

FISH se realizó utilizando sondas de ADN específico de doble color a partir PathVision ™ (Abbott /Vysis:. LSI HER2 SpectrumOrange ™ y el CEP 17 SpectrumGreen ™) como se describe anteriormente en los casos con sobreexpresión de HER2 equívoca. [19] Nos contaron las señales de hibridación en 20 núcleos por muestra bajo un microscopio de fluorescencia (Zeiss Axioskop) utilizando conjuntos de filtros recomendados por Vysis (DAPI /Spectrum Naranja de doble paso de banda, DAPI /Espectro de paso de banda dual verde). Se excluyeron todos los núcleos superpuestos, y se evaluaron sólo los núcleos con una frontera distinta nuclear. HER2
gen se consideró amplifica cuando la relación señal de FISH de HER2 /CEP17
fue mayor o igual a 2,0 [20].

-PCR en tiempo real para KRAS y amplificación MET

Se utilizó ADN obtenidas de tejidos tumorales de carcinoma gástrico FFPE. La mezcla de reacción contenía 2 uL molde de ADN genómico, 10 uL de la mezcla maestra Taqman PCR Universal (Applied Biosystems Inc, Foster City, CA) y 0,2 uM de cada cebador. Para la detección precisa de las alteraciones de la NC, se analizaron tres regiones diferentes de la KRAS
gen: una región dentro de intrón 1 (TaqMan Copia número de ensayo Hs06943812_cn), una región en el intrón 2 (Hs002534878_cn), y una región en el exón 6 (Hs02739788_cn). . MET
gen, que utiliza los cebadores como se describe anteriormente [21]

mide el aumento de número de copia con el siguiente perfil: 2 min a 50 ° C, desnaturalización a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 1 min. Se determinó la cuantificación relativa mediante el rápido sistema de PCR en tiempo real HT 7900 por cuadruplicado. Un kit de ensayo de RNasaP (Applied Biosystems) se utilizó como control. Después de la amplificación, importamos los resultados del experimento que contienen valores de ciclo umbral para el número de copias y ensayo de referencia en el software CopyCaller (Applied Biosystems) para el análisis de datos post-PCR como se ha descrito anteriormente. [22] Se le asigna el estado de ganancia CN y el número de KRAS
copias basado en la concordancia de los resultados en al menos dos de las tres sondas.

Los métodos analíticos

se excluyeron todos los cambios sinónimos después de un algoritmo mutación de llamadas automáticas se utilizó para detectar supuestas mutaciones. llamadas recurrentes en más de 10 de 89 muestras fueron considerados como falsos positivos y fueron excluidos. Utilizamos los valores de corte de más de 6% de frecuencia variante y más de cobertura X100 para detectar verdaderos cambios mutacionales en concordancia con estudios previos y nuestra propia experiencia. [9], [10] Se filtran los polimorfismos de un solo nucleótido después de la revisión manual de cada polimorfismo en el Catálogo de mutaciones somáticas en el Cáncer (COSMIC, http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic) ( Figura 1). Para los genes mutados conocidos en los carcinomas gástricos ( TP53
, APC
, PIK3CA
, STK11
, CDKN2A
, KRAS
, HRAS
, BRAF
y CTNNB1
), se realizó una revisión manual de los resultados de llamada automática para coger con mutaciones deletéreas ligeramente bajos de frecuencia variable.

resultados

resultados de la Ion AmpliSeq panel de cáncer

las concentraciones de ADN, su concentración de plegado, la cobertura media de las muestras, los números totales de bases, > Q20 bases, lee, lee significan longitud, asignan lecturas, lo que la tasa objetivo (%), la profundidad media y la uniformidad de los resultados se describen en la Tabla S2. En total se obtuvieron 8178 llamadas variantes de 89 muestras, entre ellas 3554 eran llamadas no es sinónimo cambios. Después de filtrar las llamadas recurrentes, < 6% de la frecuencia del alelo variante, < 100X de cobertura y los de la región del intrón, se seleccionaron 65 llamadas variantes. Además, se revisaron las llamadas automatizadas en las mutaciones conocidas como BRAF
, KRAS
y PIK3CA Opiniones y podría salvar dos llamadas variantes, que fueron eliminados en el proceso de filtrado procesos. Treinta y nueve de las 89 muestras (43,8%) albergaban al menos una mutación (Figura 1). Dos casos mostraron 22 y 5 mutaciones, respectivamente. El último caso albergaba MLH1
mutación somática [mutación sin sentido en el exón 20: c.1147A > G (p.M383 V)] y MLH1
la hipermetilación del promotor con pérdida de proteínas MLH1 por IHC usando el los métodos descritos anteriormente, [23] lo que sugiere tumor hypermutated. Sin embargo, a pesar de las mutaciones encontradas en el primer caso pasado frecuencia variante y la cobertura cortan offs, esas mutaciones no fueron confirmadas por secuenciación Sanger, lo que sugiere falso positivo en este caso debido a la mala calidad del ADN. Por lo tanto, este caso se excluyó del análisis final de los resultados. detectaron mutaciones somáticas más frecuentes incluyen TP53 gratis (24 casos, 27,0%), APC gratis (9 casos, 10,1%), PIK3CA gratis (5 casos, 5,6%), %), KRAS
(3 casos, 3,4%), SMO gratis (4 casos, 4,5%), STK11 gratis (3 casos, 3,4%), CDKN2A
(3 casos, 3,4%), y SMAD4 gratis (3 casos, 3,4%), como se muestra en la Tabla 2. Tabla 2 también resume los cambios de aminoácidos en los genes mutados con frecuencia. Se identificaron 19 pacientes (21,3%) con dos o más mutaciones somáticas únicas y concomitantes.

En cuatro muestras de cáncer gástrico con frecuencias de mutación conocidos determinados por secuenciación del exoma y confirmados por secuenciación de Sanger, se identificaron mutaciones somáticas en TP53
, ERBB4
y CTNNB1
sin llamadas falsos positivos en otros genes (Tabla S3).

la amplificación por nCounter y validación por IHC, FISH o PCR en tiempo real

Las amplificaciones de HER2
, CCNE1
, MYC
, KRAS
y EGFR
genes se observaron en 8 (8,9%), 4 (4,5%), 2 (2,2%), 1 (1,1%) y 1 (1,1%) casos, respectivamente (Tabla 3). No se observó amplificación de MET
, FGFR2
, CDK4 y CDK6
en cualquiera de los casos. En los casos con amplificación, IHC para HER2, EGFR y CCNE1 mostró sobreexpresión de las proteínas en las células tumorales (Figura 2A, B y C). En un caso con HER2 2+ por HercepTest, FISH mostró amplificación heterogéneo de HER2
genes (Figura 2D).

Dentro de la PCR en tiempo real para KRAS
, un caso con la amplificación mostraron aumento de número de copias (36, 37 y 49); en los casos que fueron negativos para KRAS
amplificación, no hubo un aumento del número de copias (de 0,9 a 2,4, con una media de 1,4).

En MET
gen, no encontramos caso positivo debido a su rareza [21]. Por lo tanto, hemos utilizado adicional de diez (cinco cada uno amplificada y no amplificada) muestras de cáncer gástrico y MET
amplifica las líneas celulares de cáncer gástrico (MKN45 y SNU5) con el número de copias de ARNm conocidos y asciende. VNC detectada por nCounter correlaciona bien con el número de copias detectadas por PCR en tiempo real (Tabla S4) y los niveles de mRNA de MET
gen (prueba de correlación de Pearson, r = 0,874, p = 0,001). (Figura S2)

Discusión

mediante el uso de iones AmpliSeq v2, se encontró que 39 de las 89 muestras de adenocarcinoma gástrico avanzado contenían mutaciones somáticas, lo que demuestra que esta plataforma es fácilmente aplicable en muestras de tejido FFPE de archivo. TP53
se encuentra con mayor frecuencia la mutación, seguido por APC
, PIK3CA
y KRAS
. Por otra parte, nuestra costumbre panel de la CNV con éxito detectado aumentos de NC HER2
, CCNE1
, MYC
, EGFR
y KRAS
genes, lo que nos confirma mediante IHC y PCR en tiempo real

frecuencias mutacional en la base de datos COSMIC revelan similitudes sustanciales en los datos obtenidos de este estudio:. TP53 gratis (32%), PIK3CA gratis (10%), KRAS gratis (6%), APC gratis (6%), CTNNB1 gratis (5%), CDKN2A gratis (5%), FBXW7 gratis (5%), SMO gratis (4%), erbB2 gratis (2%) y STK11
(2%). Recientes estudios de secuenciación del exoma conjunto de adenocarcinoma gástrico mostraron frecuencias algo superiores de TP53 gratis (36% y 73%) y PIK3CA
(14% y 20%) mutaciones en comparación con nuestros resultados. [24], [25] Aunque nuestros frecuencias de mutación eran más bajos en comparación con los resultados de la secuenciación del exoma, hubo un aumento significativo en comparación con nuestros datos previos sobre espectrometría de masas basada en OncoMap v4. [26] Tanto AmpliSeq y OncoMap detectar mutaciones en las regiones de punto de acceso, que explican resultados de mutación menos frecuente en algunos oncogenes y genes supresores de tumores. Figura S1 compara AmpliSeq v2 y v4 OncoMap en los perfiles de mutaciones detectables. OncoMap pruebas anteriores en 237 adenocarcinomas gástricos revelado que PIK3CA
mutaciones eran frecuentes en las etapas avanzadas de la enfermedad (5,1% en estadio IV; 6,4% en estadio II /III; 2,4% en estadio IB). [26] En este estudio observamos tres PIK3CA
mutaciones en pacientes con estadio III y dos de cada enfermedad en estadio II, el apoyo a su función biológica en la progresión tumoral. También observamos HER2 gratis ( ErbB2
) c.2524G > A (V842I) mutación en un caso de cáncer gástrico. En estudios preclínicos, las líneas celulares que albergan la mutación V842I eran resistentes a trastuzumab, pero fueron sensibles a inhibidor de HER2 irreversible, neratinib [27].

secuenciación basados ​​en semiconductores tiene diferencias fundamentales en la detección y la transducción de señal en comparación con la espectrometría de masas secuenciación basada. En lugar de utilizar métodos ópticos para detectar cambios de nucleótidos, la técnica basada en semiconductor detecta los cambios de pH por la liberación de protones (H ^{+) cuando nucleótidos se integran en la creciente cadena de ADN. [8] Por lo tanto, hay una reducción significativa en el coste y el tiempo requerido para el procesamiento de datos en comparación con otras plataformas NGS. El suministro de información rápida y precisa sobre las mutaciones a bajo costo es crucial para los pacientes con cánceres más agresivos, incluyendo el cáncer gástrico.}

En este estudio, se revisaron manualmente las llamadas automatizadas en las mutaciones conocidas después de aplicar los valores de corte de frecuencia y la cobertura, añadiendo posteriormente dos llamadas con baja cobertura de la variante. A pesar de sus valores de cobertura no alcanzaron los criterios iniciales, sus frecuencias exceden nuestro primer ajuste (6%) y la calidad de los datos era bueno. Esto pone de relieve la importancia de la revisión manual después de la detección automatizada. resultados publicados recientemente utilizando AmpliSeq como la plataforma de análisis también hacen hincapié en la compensación de los datos de detección con la revisión manual [9], [10].

terapia dirigida personalizado para el cáncer avanzado se basa principalmente en el concepto de "adicción oncogén", en que múltiples anomalías genéticas son adictos a uno o unos pocos genes para el mantenimiento de las células tumorales y la supervivencia. [28] Un estudio abierto, ToGA internacional, fase 3, aleatorizado y controlado (trastuzumab para el cáncer gástrico) ensayo indicaron que el trastuzumab en combinación con la quimioterapia es un nuevo estándar para los pacientes con cáncer avanzado de unión gástrico o gastroesofágico HER2 positivo. [29] En un ensayo preclínico demostró que un subconjunto de los cánceres gástricos con EGFR
o tratamiento con inhibidores de tirosina quinasa del receptor MET MET
amplificación y sobreexpresión responden al cetuximab o. [30] Además, las amplificaciones de ciclo celular mediador CCNE1
sugieren el potencial para la inhibición terapéutica de las quinasas dependientes de ciclinas en los cánceres gástricos. [31] El tamizaje genes amplificados para la terapia dirigida con tecnología de alto rendimiento es muy importante. Los métodos tradicionales como el pescado y variedad de hibridación genómica comparada sufren de baja resolución de las regiones genómicas, alto costo y son en mano de obra y requiere mucho tiempo. [32] En este primer estudio sobre nCounter CNV análisis, encontramos que esta tecnología es aplicable en muestras clínicas FFPE y se validó los resultados de IHC, FISH y PCR en tiempo real. Aunque no nos validar todos los genes utilizados en los cebadores personalizados, resultados de la validación en varios genes seleccionados fueron notables.

En resumen, se realizó con éxito la secuenciación basada en semiconductores y análisis nCounter CNV en muestras de tejido FFPE de 89 gástrica adenocarcinomas. secuenciación de alto rendimiento y la detección de la CNV en muestras clínicas de archivos permite una detección más rápida, más precisa y rentable de las mutaciones de punto de acceso y la CNV en los genes. En la era de la medicina genómica personalizada, tenemos la intención de utilizar estas herramientas para la detección de pacientes con cáncer gástrico que pueden beneficiarse de las terapias dirigidas.

Apoyo a la Información
Figura S1.
Comparación de la cobertura del panel de cáncer de Ion AmpliSeq v2 frente Oncomap v4
doi:. 10.1371 /journal.pone.0111693.s001 gratis (TIF)
figura S2. Terrenos de correlación entre los MET
CNV detectados por los niveles de mRNA de NCounter y MET
génica mediante PCR en tiempo real
doi:. 10.1371 /journal.pone.0111693.s002 gratis (TIF)
Tabla S1.
la lista de genes para el cáncer Grupo Ion Torrent AmpliSeq
doi:. 10.1371 /journal.pone.0111693.s003 gratis (XLS)
Tabla S2.
Las concentraciones de ADN, su redil concentración, la cobertura media de las muestras, el número total de bases, > bases Q20, lee, lee significan longitud, asignada lee, en el objetivo de la tasa (%), la profundidad media y la uniformidad.
doi: 10.1371 /journal.pone.0111693.s004 gratis (XLS) sobre Table S3.
mutaciones somáticas en TP53
, ERBB4
y CTNNB1
doi:. 10.1371 /journal.pone.0111693.s005 gratis (XLS)
Tabla S4.
CNV detectada por nCounter correlaciona bien con el número de copias detectadas por PCR en tiempo real
doi:. 10.1371 /journal.pone.0111693.s006 gratis (XLSX)

• PLOS ONE: ¿Es la alimentación oral precoz después de la cirugía del cáncer gástrico factible? Una revisión sistemática y meta-análisis de ensayos controlados aleatorios
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