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PLOS ONE: La sobreexpresión de Nuclear Factor inductor de apoptosis 1 alterado el perfil proteómico de celulares de cáncer gástrico humano MKN45 e inducidos del ciclo celular detención en G1 /S Phase

Extracto

El factor nuclear 1 inductor de apoptosis (NAIF1) se informó anteriormente para inducir la apoptosis. Por otra parte, la expresión de NAIF1 fue significativamente las reguladas en tejidos de cáncer gástrico humano en comparación con los tejidos normales adyacentes. Sin embargo, el mecanismo por el cual el gen NAIF1 induce la apoptosis no se entiende completamente. Nuestros resultados muestran que NAIF1 se expresó mínimamente en todas las líneas celulares de cáncer gástrico probadas. Nuestros datos también demuestran que NAIF1 se localiza en los núcleos de las células tal como se detecta por el control de la fluorescencia verde de la proteína de fusión NAIF1-GFP mediante microscopía confocal de fluorescencia. A continuación, se utilizó un enfoque proteómico comparativo para identificar la expresión diferencial de proteínas entre las líneas celulares de cáncer gástrico MKN45 /NAIF1 (-) y MKN45 /NAIF1 (+). Se encontraron cinco proteínas (subunidad 26S del proteasoma 2, del proteasoma 26S subunidad 13, NADH deshidrogenasa Fe-S proteína 1, que contiene chaperonina TCP1 subunidad 3 y tiorredoxina reductasa 1), que fueron hasta reguladas y tres proteínas (inhibidores de ribonucleasa 1, 14-3- 3 proteínas isoforma épsilon y la proteína de unión de la apolipoproteína AI) que se redujeron reguladas en las células que sobreexpresan MKN45 NAIF1. También descubrimos que NAIF1 podría inducir la detención del ciclo celular en la fase G1 /S mediante la alteración de la expresión de proteínas del ciclo celular cyclinD1, cdc2 y p21. Las proteínas expresadas diferencialmente identificados aquí están relacionados con diversos programas celulares que implican el ciclo celular, la apoptosis y la regulación de transducción de señales y sugieren que NAIF1 puede ser un supresor tumoral en el cáncer gástrico. Nuestra investigación proporciona evidencia de que aclara el papel de cómo funciona NAIF1 en el cáncer gástrico

Visto:. Yang M, Zhong J, M Zhao, Wang J, Gu Y, X Yuan, et al. (2014) La sobreexpresión de Nuclear Factor inductor de apoptosis 1 alterado el perfil proteómico de celulares de cáncer gástrico humano MKN45 e inducidos del ciclo celular detención en G1 /S fase. PLoS ONE 9 (6): e100216. doi: 10.1371 /journal.pone.0100216

Editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesú, Italia |

Recibido: 27 Octubre, 2013; Aceptado: 23-may de 2014; Publicado: 13 Junio ​​2014

Derechos de Autor © 2014 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Esta investigación fue apoyado por el Programa Nacional de Investigación básica clave de China (2007CB914700). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer gástrico es una de las neoplasias más frecuentes en el mundo causan aproximadamente el 8% y el 10% de los casos y las muertes por cáncer anuales, respectivamente. De acuerdo con el informe epidemia mundial por la Organización Mundial de la Salud, se estima que casi un millón de casos de cáncer gástrico y 738.000 muertes que se han producido en el año 2008 [1], [2]. Muchos esfuerzos se han tomado en la clínica; Sin embargo, la mortalidad de los pacientes con cáncer gástrico sigue siendo tan alto como 70% [2]. Una razón para esto es la alta mortalidad que los pacientes con cáncer gástrico a menudo no se diagnostica hasta la etapa avanzada, que es demasiado tarde para proporcionar un tratamiento eficaz. Por lo tanto, existe una necesidad obvia de encontrar nuevos biomarcadores y estrategias eficaces para el diagnóstico y tratamiento del cáncer gástrico precoz.

La proteómica se ha utilizado en muchas áreas de investigación, incluyendo la investigación del cáncer. Las muestras comunes en el análisis proteómico para la investigación del cáncer incluyen el tejido y la sangre de pacientes con cáncer, así como líneas celulares de cáncer de orígenes o diferentes tratamientos [3] - [6]. Estos análisis proteómicos se utilizaron para investigar el origen y el desarrollo de cáncer o para buscar biomarcadores de diagnóstico. Los resultados que obtuvimos a través de métodos de proteómica son no sólo debido a la regulación directa del nivel de la transcripción, pero también reflejan las modificaciones post-traduccionales de proteínas [3], [7]. Por lo tanto, podemos analizar tanto la expresión y regulación de la proteína con el análisis proteómicos. A pesar de una gran cantidad de técnicas emergentes, electroforesis en 2 dimensiones junto con la espectrometría de masas se ha mantenido el método más utilizado para el análisis proteómico.

El factor inductor de apoptosis nuclear gen humano que codifica 1 (NAIF1) se encuentra en el cromosoma 9q34.11 . NAIF1 codifica una proteína con un Myb
dominio similar en su región N-terminal [8], [9]. Estudios anteriores han demostrado que la sobreexpresión de NAIF1 en líneas celulares de cáncer humano HeLa y MKN45 induce apoptosis [8], [10]. . Por otra parte, Luo et al
encontró que NAIF1 se expresa de manera significativa en el tejido gástrico normal, mientras que su expresión está regulada hacia abajo o se pierde en los tejidos de cáncer gástrico ( P < 0,001
). Además, la expresión NAIF1 fue mayor en bien diferenciado ( P
= 0,004) que en el cáncer gástrico moderada- o pobremente diferenciado [10]. Sin embargo, el papel de NAIF1 en la regulación del perfil de expresión de proteína celular es desconocida.

En el presente estudio, hemos empleado la tecnología proteómica basado en electroforesis en 2 dimensiones combinada con espectrometría de masas MALDI-TOF para identificar las proteínas asociadas con el funciones biológicas de NAIF1. Los perfiles de expresión de proteínas de la línea celular de cáncer gástrico, MKN45 con o sin NAIF1 sobreexpresión se analizaron y se compararon con 24 cm de pH inmovilizado gradiente de pH (IPG) tiras 3-10 rango NL. Para validar estos datos, hemos medido los niveles de ARN de expresión de todas las proteínas expresadas de forma diferente y tres proteínas fueron verificadas aún más por el Western Blot. Nuestros resultados demuestran que NAIF1 induce la detención del ciclo celular en fase G1 /S mediante la regulación de los niveles de expresión de cyclinD1, cdc2 y la proteína p21. Los resultados de nuestro estudio podrían conducir a una mejor comprensión de cómo funciona NAIF1 en la inducción de la apoptosis y también puede arrojar luz sobre el diagnóstico y el tratamiento de los cánceres gástricos en el futuro.

Materiales y Métodos

cultivo de células y transfección

líneas celulares de cáncer gástrico humano MKN45, BGC823, AGS y SGC7901 se obtuvieron del Banco de células de tumor Académico china de Ciencias médicas y se cultivaron en medio esencial mínimo de Dulbecco líquido (DMEM) suplementado con 10% inactivado por calor suero fetal bovino (FBS), 100 UI /ml de penicilina, 100 mg /ml de estreptomicina a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO 2 atmósfera. transfección de ADN se realizó usando el reactivo de transfección de ADN HP X-tremeGENE (Roche, Suiza) según las instrucciones del fabricante.

Los plásmidos de expresión

Los plásmidos de expresión pEGFP-N1-NAIF1, que expresa una NAIF1-GFP proteína de fusión, y pEGFP-N1, que expresa la proteína verde fluorescente (GFP), fue proporcionado amablemente por el Dr. Luo Qing [10].

distribución del ciclo celular análisis

en crecimiento exponencial las células se transfectaron con el vector pEGFP-N1 o el plásmido pEGFP-N1-NAIF1. Las células se recogieron a las 24 h o 48 h después de la transfección, y 1 × 10 6 células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se fijaron con paraformaldehído al 4% a 4 ° C durante 1 h. Después de la centrifugación, los sedimentos celulares se resuspendieron en solución de tinción (0,05 mg /ml de yoduro de propidio (PI), 0,2 mg /ml de RNasa, y 0,1% de Triton X-100) a 4 ° C durante 15 min en la oscuridad. Análisis de citometría de flujo para GFP y PI se realizó con un analizador de células BD LSR II (BD, San José, CA, EE.UU.). la fluorescencia PI se midió en la población de células positivas GFP y las distribuciones de los ciclos celulares se analizaron utilizando el software ModFit LT3.2. Tres muestras separadas se prepararon y todos los ensayos se realizaron por triplicado.

cuantificación de apoptosis

La cuantificación de la apoptosis se realizó utilizando el Kit de PE Anexina V Apoptosis Detección I (BD). Brevemente, BGC823 o MKN45 células fueron transfectadas con el vector pEGFP-N1 o el plásmido pEGFP-N1-NAIF1. Después de 24 h o 48 h después de la transfección, se recogieron las células, se lavaron con PBS frío dos veces y luego se resuspendieron con tampón de unión (10 mM Hepes /NaOH (pH 7,4), NaCl 140 mM, CaCl 2,5 mM 2) . Las células resuspendidas se incubaron con ficoeritrina (PE) conjugado con Anexina V (AV) y 7-amino-actinomicina (7-AAD) y, a continuación, se mide por citometría de flujo utilizando el analizador de células BD LSR II. Cuatro poblaciones de células diferenciadas puede ser detectada en un punto de parcelas: células viables (AV - /7-AAD -), las células apoptóticas de fase temprana (AV + /7-AAD - ), células apoptóticas tardías (AV + /7-AAD +) y células necróticas (AV - /7-AAD +). Un mínimo de células positivas 10.000 GFP fueron contados por muestra y los datos fueron reportados como el porcentaje de células apoptóticas (AV + /7-AAD - y AV + /7-AAD + ) entre las células totales. Tres preparaciones de muestras independientes se realizaron y todos los ensayos se repitieron por triplicado.

confocal de barrido

Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se lavaron tres veces con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4% para 15 min. a temperatura ambiente. Para mejorar la permeabilidad de la membrana celular, las células se incubaron con 0,5% de Triton X-100, seguido de incubación con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para teñir los núcleos. distribución celular de NAIF1 se analizó mediante el control de la fluorescencia verde de la proteína de fusión NAIF1-GFP usando un microscopio Leica Microsystems Heidelberg GmbH.

preparación de Proteína para 2-DE

Para cada muestra, 5 × 10 6 Las células se recogieron y se lisaron en 1 ml de tampón de lisis (7 M urea, tiourea 2 M, 2% CHAPS, 20 mM DL-ditiotreitol (DTT), fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF), fluoruro de sodio 30 mM, y 0,25 mg /ml ARNasa) durante 1 h a temperatura ambiente, y después se centrifugó a 4 ° C durante 30 min. a 12000 rpm. El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo y se concentró con 0,1 M NH 4COOH. El tampón de lisis se añadió a un volumen final de 800 l, y se determinó la concentración de proteína usando un ensayo de Bradford (Tiangen, Pekín, China).

electroforesis bidimensional

electroforesis bidimensional se realizó como [5] se describe anteriormente. En resumen, se diluyó 1 mg de proteínas a 450 l con tampón de rehidratación (7 M urea, tiourea 2 M, 2% de CHAPS, y DTT 20 mM). tiras IPG (IPG de 24 cm, de pH 3 a 10, NL, límite de GE.) se rehidrataron con las muestras rehidratadas durante 18 horas a temperatura ambiente. Las proteínas se sometieron a enfoque isoeléctrico con un Ettan IPGphorIII (GE, CT, EE.UU.) sucesivamente durante 1 h a 100 V, 1 h a 250 V, 1 h a 500 V, 1 h a 1000 V, 1 h a 3000 V, 1 h a 5000 V, 2 horas a 8000 V, y 6 horas a 8000 V para conseguir un total de 80 KVH. Siguiendo el enfoque isoeléctrico, tiras IPG se equilibraron con tampón de equilibrio I (6 M urea, 150 mM Tris-HCl (pH 8,8), 30% de glicerol, 2% SDS, 1% DTT) durante 15 min. seguido de una segunda incubación con otro tampón de equilibrio II (6 M urea, 150 mM Tris-HCl (pH 8,8), 30% de glicerol, 2% SDS, 2,5% de yodoacetamida) durante 15 min. La segunda dimensión de la SDS-PAGE se llevó a cabo con el 12,5% en geles de SDS-PAGE utilizando los Ettan DALT seis sistemas verticales (GE).

tinción del gel y análisis de imágenes

El SDS-PAGE geles se fijaron en la fijación de tampón (10% CH 3COOH, 40% C 2H 5OH, y 50% ddH 2O) durante 30 min. A continuación, los geles se lavaron en ddH 2O para 10 min. 3 veces y se tiñeron con azul de Coomassie G-250.

Los geles fueron escaneados con un escáner de imágenes utilizando el software MagicScan para evaluar los patrones de manchas. Se empleó el software imagemaster platino (versión 5.0) para analizar las imágenes de gel. Las manchas que se observaron tanto en el gel de control y gel NAIF1 se analizaron y la intensidad de cada mancha se cuantificó mediante el cálculo del volumen de clavo después de la normalización de la imagen de gel. El análisis cuantitativo de imágenes de gel (tres repeticiones /muestra) se tomaron y las manchas con diferencias estadísticamente significativa (prueba t, * P Hotel < 0,05). fueron extirpados y se digirió para la identificación

Proteínas identificaciones

diferencialmente expresado puntos de proteínas se extrajeron y se tiñeron-revocado de 50 mM NH 4HCO 3 /acetonitrilo (50/50) y se secaron por centrifugación al vacío. El gel piezas fueron digeridos con 10 ng /ml de tripsina (Promega, WI, EE.UU.) en 50 mM NH 4HCO 3 tampón a 37 ° C durante la noche. El líquido de la tripsina se transfirió a un tubo limpio, se diluyó con ácido trifluoroacético 100 l 60% de acetonitrilo /0,1%, y se trató con ultrasonidos durante 15 min, tres veces. Se recogió todo el líquido adquirido y se secó al vacío y se almacenó a -80 ° C. Los péptidos eluidos se analizaron usando un Bruker ULTRAFLEX MALDI-TOF /TOF equipado con la fuente de SCOUT por BGI-Beijing. Los resultados de espectro de masas fueron contrastados contra secuencias de mamíferos a partir de la base de datos NCBInr (no redundante) para péptido de identificación de huellas másicas.

Aislamiento de ARN, RT y en tiempo real Q PCR

El ARN total se se extrajo usando el reactivo TRIzol (Invitrogen) según el protocolo del fabricante. Se sintetizó ADNc mediante transcripción inversa usando 1 g ARN total con oligo (dT) 18 cebadores y M-MuLV la transcriptasa inversa (Takara)
.

Para la PCR de transcripción inversa, los cebadores para NAIF1 y β-actina fueron como sigue: sentido NAIF1, 5'-AGCCACGGTCACCCTGACACA-3 ', y anti-sentido, 5'-CGTGTCTGCATGCTGGGCCAT-3'; sentido ß-actina, 5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3 'y antisentido, 5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT. Todos los cebadores fueron diseñados utilizando NCBI explosión y adquiridos de Sangon, Beijing.

PCR cuantitativa se realizó con el Kit de SYBR Green qPCR (TAKARA, Japón) con un sistema de reacción 20 l configurar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. expresión del gen diana se analizó utilizando en tiempo real qPCR apropiada cebadores (Tabla 1). β-actina se utilizó para la normalización. El tiempo real qPCR se realizó en un ciclador ABI7300 (ABI, MA, EE.UU.) con las siguientes condiciones: desnaturalización durante 30 s a 95 ° C, seguido de 40 ciclos de desnaturalización durante 5 s a 95 ° C, y la extensión de 31 s a 60 ° C. Melting análisis de la curva se realizó al final para validar la especificidad del producto de PCR esperado. Expresión relativa se calculó usando los dos métodos curva estándar. Tres muestras independientes fueron preparados para cada condición y cada experimento se realizó por triplicado.

se realizó Western Blotting

transferencia de Western como se describió previamente. Brevemente, 2 x 10 6 células se recogieron con el flujo medio, se sedimentaron por centrifugación durante 5 min a 500 g
, y se lavó 3 veces con PBS. Después las células se lisaron con 100 l de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 150 mM, 1,5% NP-40, 0,1% SDS, y 50 g /PMSF ml, con recién añadido cóctel inhibidor de proteinasa) en hielo por 30 min. Los lisados ​​se centrifugaron a 13.000 rpm durante 15 min. y la concentración de proteínas se midió utilizando métodos de Bradford. Cincuenta microgramos proteínas se separaron sobre 12% de SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno. Las membranas se bloquearon con 5% de BSA en TBST durante una hora a temperatura ambiente seguido de incubación con soluciones de anticuerpo primario de acuerdo con las instrucciones del fabricante (β-actina, 1:5000, Sigma; NAIF1, 1:1000, Santa Cruz; 14- 3-3 ε, 1:500, Santa Cruz; TCP1-γ, 1:1000, Abcam; TXNRD1, 1:1000, Abcam; CyclinD1, 1:1000, CCT; cdc2, 1:500, CCT; y p21, 1 :500, CST). Las membranas se lavaron 3 veces con TBST, seguido de incubación con anticuerpos secundarios apropiados para dos horas a temperatura ambiente. Las señales se detectaron utilizando el sistema de quimioluminiscencia ECL. β-actina se utilizó como control.

Análisis estadístico

Todos los análisis estadísticos se realizaron con el paquete estadístico SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). Los datos se expresan como media ± desviación estándar. Se utilizó la prueba t de Student para la comparación estadística. Un valor asociado de P <.
0,05 fue considerado significativo

Resultados

transfectadas NAIF1 localiza en el núcleo

Tanto la transcripción inversa PCR y occidental experimentos de transferencia demostró que NAIF1 se expresa mínimamente en líneas celulares de cáncer gástrico, MKN45, BGC823, AGS, y SGC7901; mientras que NAIF1 se detectó fácilmente cuando se transfectó en las células (Figura. 1A y B). Estamos transfectadas una construcción de fusión NAIF1-GFP en células MKN45 y BGC823 y un vector GFP se utilizó como control. La microscopía confocal demostró que cuando las células fueron transfectadas con el constructo de pEGFP-N1-NAIF1, se detectó fluorescencia verde sólo en los núcleos; por el contrario, se detectó la señal flurescent verde a lo largo de toda la célula cuando se transfectan con el vector de GFP (Figura. 1C). Los mismos resultados se observaron también en otras líneas celulares tales como BGC823 (Figura S1). Estos resultados confirmaron que la proteína transfectadas NAIF1 se localiza en el núcleo.

NAIF1 inducida por la detención del ciclo celular en la fase G1 /S

El perfil del ciclo celular de células de cáncer gástrico bajo el efecto de NAIF1 se investigó siguiente. Se analizaron las células GFP-positivas para asegurar la correcta población fue utilizado (Figura S2). análisis de citometría de flujo demostró que NAIF1 indujo un cambio significativo en la distribución del ciclo celular: se observó un aumento de la población celular en la fase G0 /G1 y una disminución en la fase S en células que sobreexpresan NAIF1 comparación con las células transfectadas con el vacío vector, tanto después de la transfección 24 h y 48 h. Como se muestra en la figura. 2A, citometría de flujo reveló que 24 h después de la transfección, aproximadamente el 54% de BGC823 células transfectadas con pEGFP-N1 vector estaban en la fase G0 /G1, y 34% y el 12% de las células estaban en fase S y G2 /M fase, respectivamente . Por otro lado, en BGC823 células transfectadas con el pEGFP-N1-NAIF1 construyen hubo un claro aumento en el porcentaje de células en fase G0 /G1 (74%), así como una disminución en el porcentaje de células en fase S (26%) y la fase G2 /M (0%). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, aproximadamente el 36% de las células de control BGC823 estaban en fase G1 G0 /, y el 59% y el 5% de las células están en fase S y G2 /M fase respectivamente. En BGC823 células transfectadas con el pEGFP-N1-NAIF1 construyen, aproximadamente el 55% de las células estaban en fase G1 G0 /, y el 37% y el 8% de las células estaban en fase S y G2 /M fase, respectivamente. En células MKN45, 24 h después de la transfección, aproximadamente el 56% de las células transfectadas con el vector pEGFP-N1 estaban en la fase G0 /G1, y 29% y el 15% de las células estaban en fase S y G2 /M fase, respectivamente. Aproximadamente el 76% de MKN45 células transfectadas con el constructo de pEGFP-N1-NAIF1 estaban en fase G0 /G1, y los porcentajes de células en fase S y G2 /M fase se redujo a 24% y 0%, respectivamente. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, aproximadamente el 43% de las células control MKN45 estaban en la fase G0 /G1, y 43% y el 14% de las células estaban en fase S y G2 /M fase, respectivamente. En MKN45 células transfectadas con el pEGFP-N1-NAIF1 construyen, aproximadamente el 56% de las células estaban en fase G1 G0 /, y el 28% y el 16% de las células estaban en fase S y G2 /M fase, respectivamente (Figura. 2B). Estos resultados demuestran claramente que la sobreexpresión de NAIF1 la detención del ciclo celular inducida en G1 /S fase de células de cáncer gástrico y BGC823 MKN45.

Para aclarar el mecanismo por el cual NAIF1 induce la detención del ciclo celular, se examinaron las posibles funciones de cyclinD1 , proteínas p21 y cdc2, que son importantes en la regulación del ciclo celular en fase G1 /S. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, los niveles de expresión de cyclinD1 y cdc2 se redujeron en comparación con las células de control, tanto en las células BGC823 y MKN45. Además, los niveles de expresión de p21 se incrementaron (Figura. 2C).

análisis proteómico comparativo de la línea celular de cáncer gástrico MKN45 con o sin expresión adicional de la proteína NAIF1

Los perfiles de proteínas de MKN45 células transfectadas con el pEGFP-N1-NAIF1 construye como el grupo tratado o con el vector pEGFP-N1 como el grupo de control se midieron por 2-dE 48 h después de la transfección. En total, se resolvieron más de 700 puntos, de los cuales 11 proteínas fue > 1,5 veces expresados ​​diferencialmente como se determina por análisis con la versión 5.0 ImageMaster. Las manchas de proteínas expresados ​​diferencialmente se escindieron del gel, y 8 proteínas se identificaron por análisis /TOF MALDI-TOF. Representante tratados y los controles mapas de gel 2-DE se muestran en la Figura. 3A y las manchas de proteínas expresados ​​diferencialmente están marcados. Megascópica 2-DE gel imágenes de cada uno de los puntos de proteínas expresados ​​diferencialmente se representan en la figura. 3B y 3C. Cinco de las proteínas fueron reguladas en el grupo tratado incluyendo NADH deshidrogenasa (ubiquinona) Fe-S proteína 1 (NADUSF1), chaperonina que contiene TCP1 subunidad 3 (TCP1-γ), tiorredoxina reductasa 1 (TXNRD1), proteosoma 26S subunidad 2 ( PSMC2) y del proteasoma 26S subunidad 13 (PSMD13). 3 proteínas se redujeron reguladas, incluyendo el inhibidor de ribonucleasas 1 (RNH1), la proteína 14-3-3 isoforma épsilon (ε 14-3-3) y apolipoproteína A-I proteína de unión (APOAIBP). La Tabla 2 muestra información específica sobre estas proteínas y su nivel de expresión diferencial.

Validación de proteínas expresadas diferencialmente

qPCR en tiempo real y Western Blot se realizaron para verificar la 2-DE resultante. los niveles de expresión génica de las proteínas identificadas fueron analizados por qPCR en tiempo real y son consistentes con los resultados de 2-DE, a excepción de una proteína, 14-3-3ε (Figura. 4A). Se seleccionaron tres proteínas en función de su importancia y las funciones probables para su posterior análisis por Western Blot para verificar los resultados de 2-DE. Los resultados muestran que los niveles de expresión de proteínas de TXNRD1 y TCP1-γ se incrementaron significativamente en el grupo NAIF1 comparación con el grupo control ( P
< 0,05), mientras que el nivel de expresión de la proteína de 14-3-3ε se redujo significativamente en el grupo de NAIF1 ( P < 0,05
) (Figura 4B.). En general, los resultados de Western Blot son consistentes con los resultados de la 2-DE

Discusión

Varios estudios se han realizado para describir el gen NAIF1.; Sin embargo, poco se sabe sobre el perfil proteómico NAIF1 se sobreexpresa. El objetivo del presente estudio fue detectar e identificar las proteínas cuya expresión se modifica en las células que sobreexpresan MKN45 NAIF1. Además, se proporciona la evidencia para explicar cómo NAIF1 funciones en la inducción de la apoptosis celular y otras actividades. Una estrategia 2-DE se empleó en este estudio debido a su metodología conveniente y de alta eficiencia. En total, se han detectado e identificado 5 proteínas que son regulados hasta 3 y proteínas que se redujeron reguladas en las células que sobreexpresan MKN45 NAIF1 en comparación con el grupo control. Las proteínas identificadas implican una serie de actividades fisiológicas, tales como la degradación de proteínas, el control de la homeostasis redox celular, la progresión del ciclo celular, la regulación del citoesqueleto, la respuesta al estrés celular, la apoptosis y la regulación del metabolismo. El perfil del ciclo celular de las líneas celulares de cáncer gástrico, BGC823 y MKN45 también se investigó, y nuestros resultados demostraron que la sobreexpresión de NAIF1 puede inducir la detención del ciclo celular en G1 /fase S a través de la alteración de los niveles de expresión de proteínas de regulación del ciclo celular cyclinD1, cdc2 y p21 .

Los resultados de Western Blot y PCR inversa transcripcional demostró que NAIF1 se expresa mínimamente en células de cáncer gástrico. Los datos presentados en este documento es análogo al hallazgo de Luo en los tejidos [10]. Por otra parte, se confirmó que NAIF1 es una proteína nuclear en las líneas celulares de cáncer gástrico MKN45 y BGC823. Dado que el ADN genómico existe principalmente en el núcleo, estos datos sugieren que NAIF1 puede funcionar en el núcleo mediante la interacción con el ADN genómico y nucleoproteína con el fin de afectar a la expresión de genes y proteínas integral. Por esta razón se realizó un análisis proteómicos para investigar el perfil proteómico de las células que sobreexpresan MKN45 NAIF1.

regulación anormal del ciclo celular es una característica notable de las células del cáncer [11]. Los estudios han demostrado que muchas moléculas pequeñas pueden activar los puntos de control del ciclo celular e inducir la detención del ciclo celular, que permiten a las células para reparar los defectos. Sin embargo, repairation deficiente puede conducir a la apoptosis [12] - [15]. Nuestros resultados muestran que NAIF1 induce la detención del ciclo celular en G1 /S fase. La transición de G1 a la fase S requiere la activación de montaje de cyclinD-Cdk4 /6 y ciclina-cdc2 (también conocido como Cdk1). Mientras tanto, p21 inhibe la actividad de cdc2 y media el montaje y la activación de cyclinD-cdk4 /6 en el citoplasma, así como la inhibición de su actividad en el núcleo [16]. En este estudio, el análisis de transferencia Western detectó que los niveles de expresión de proteínas de cyclinD1 y cdc2 disminuyeron, mientras que el nivel de expresión de la proteína de p21 se incrementó en las células que sobreexpresan NAIF1. Estos resultados sugieren que G1 /S detención del ciclo celular inducida por NAIF1 está mediada a través de la p21 y la vía cyclinD1. Además, hemos demostrado que 48 h después de la transfección, la población de células apoptóticas aumentó aproximadamente 10% en las células que sobreexpresan NAIF1 como resultado de la detención del ciclo celular (Figura S3).

proteasoma 26S es un orgánulo conservador en todo las células eucariotas y que es responsable de la degradación de proteínas intracelulares [17]. Las proteínas que se degradan por proteasoma 26S están involucrados en una serie de procesos biológicos incluyendo la apoptosis, ciclo celular, y el crecimiento y la regulación de la expresión de muchos genes que a su vez regulan otros procesos [18]. La perturbación del equilibrio degradación de proteínas conduce a la originación y desarrollo del cáncer. Por lo tanto, 26S proteasoma es un objetivo de la terapia del cáncer atractivo. Aquí, encontramos que dos subunidades del proteasoma 26S, PSMC2 y PSMD13, dos estaban regulados hasta en MKN45 células que sobreexpresan NAIF1. PSMC2 y PSMD13 son subunidades del proteasoma 19S, que es la partícula de regulación (RP) de la proteasoma 26S. PSMC2 es una ATPasa mientras PSMD13 es un no-ATPasa. Algunos investigadores creen que la inhibición del proteasoma 26S puede conducir a la apoptosis de células de carcinoma, y ​​los inhibidores del proteasoma se podrían utilizar para tratar el cáncer [19] - [21]. Sin embargo, un estudio de Tan et al.
Sugiere que el factor de necrosis tumoral (TNF) -α activa el sistema de proteasoma 26S por hasta la regulación de los niveles de expresión de las subunidades del proteasoma 26S [22]. TNF-α es una citoquina bien conocida que puede inducir apoptosis en una variedad de células cancerosas, y ahora se utiliza en la clínica como un tratamiento regional de los sarcomas de tejidos blandos avanzado localmente y melanomas metástasis para evitar de las extremidades de amputación [23]. Al igual que TNF-α, NAIF1 también tiene la capacidad de inducir apoptosis, lo que implica que el proteasoma 26S puede estar involucrado en el proceso de apoptosis inducida por NAIF1
.

Nuestros datos también demuestran que dos proteínas, TXNRD1 y NDUFS1, son hasta reguladas por NAIF1. TXNRD1 regula el estado redox de los tioles de proteínas en células de mamífero, y funciones tanto en la promoción y la prevención del cáncer en diferentes tipos de carcinomas [24] - [27]. No se han realizado estudios para investigar el papel de TXNRD1 en el cáncer gástrico. En nuestra opinión, TXNRD1 puede participar en la represión de la génesis del cáncer gástrico o la sobre regulación de TXNRD1 puede ser un mecanismo de adaptación en respuesta al estrés oxidativo generado por la sobreexpresión de NAIF1. El gen NDUFS1 codifica una subunidad de 75 kDa Fe-S, que es una de las siete subunidades mitocondriales de complejo I [28]. Complejo I es la mayor de las enzimas de la cadena respiratoria y la deficiencia del complejo I es la principal causa de una serie de enfermedades mitocondriales congénitos, como el síndrome de Leigh [29]. Además, el 75 kDa de la subunidad del complejo I es un sustrato de caspasa, que está implicado en la vía de apoptosis mitocondrial. Se requiere la escisión de la caspasa de NDUFS1 para varios cambios mitocondriales asociadas con la apoptosis, incluyendo los niveles de ATP, la producción de ROS y la pérdida de integridad de la membrana de plasma y así sucesivamente [30]. Desde NAIF1 induce la apoptosis a través de la vía mitocondrial [8], que postula que la sobre regulación de NDUFS1 participa en el proceso de la apoptosis inducida por NAIF1
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TCP1-γ ha sido identificada como una chaperonina eucariótica en el citosol. La investigación anterior ha encontrado que TCP1-γ se expresa significativa en los tumores de carcinoma hepatocelular en comparación con los tejidos tumorales no malignas adyacentes apareados [31], [32]. Sin embargo, la relación entre TCP1-γ y el cáncer gástrico es todavía desconocida y se necesitan más estudios.

Por otro lado, se identificaron tres proteínas, 14-3-3ε, RNH1 y APOAIBP, que estaban abajo regulado en células que sobreexpresan MKN45 NAIF1. 14-3-3 es una familia de proteínas que consiste en proteínas multifuncionales que se unen y modulan las funciones de una amplia gama de proteínas celulares. Además, participan en diversos procesos biológicos, incluyendo la regulación del ciclo celular puesto de control, apoptosis, y el control del crecimiento celular [33]. han informado de varios estudios que la expresión 14-3-3ε se incrementa en el cáncer de pulmón, cáncer hepatocelular, cáncer de mama y carcinoma de células escamosas de la vulva [34] - [37]. La única excepción a este aumento de la expresión 14-3-3ε es en los tejidos gástricos cáncer, donde se disminuye la expresión [38]. Además, estudios previos han demostrado que la sobre regulación de 14-3-3ε puede evitar la apoptosis desencadenada-Bad en células endoteliales [39], y los fármacos antiinflamatorios no esteroideos-inflamatorios pueden inducir la apoptosis de las células del cáncer colorrectal mediante la supresión de 14-3- 3ε expresión [40]. Por otra parte, un estudio histopatológico informó que en 114 pacientes con carcinoma hepatocelular, la expresión elevada de 14-3-3ε se asoció significativamente con un alto riesgo de metástasis y la disminución de las tasas de supervivencia [35]. experimentos celulares confirmaron que el aumento de la expresión 14-3-3ε induce la migración celular de carcinoma hepatocelular y promueve la transición epitelio-mesenquimal (EMT) mediante la inducción de Zeb-1 y Caracol expresión [41]. Para concluir, 14-3-3ε es un oncogén notable que participa en el desarrollo de varios tumores y juega un papel importante en la apoptosis y la metástasis. Aquí, encontramos que 14-3-3ε es el regulado en las células que sobreexpresan MKN45 NAIF1, lo que sugiere que 14-3-3ε pueden estar involucrados en el proceso de la apoptosis inducida por NAIF1. Además, nuestros datos implica que además de inducir la apoptosis y la detención del ciclo celular, NAIF1 puede jugar un papel en la migración celular y la metástasis. Nuestros resultados demuestran que los niveles de expresión de proteínas de 14-3-3ε disminuyeron, mientras que se aumentaron los niveles de ARN. Estos resultados revelan que NAIF1 regula los niveles de expresión de 14-3-3ε después de la traducción. Nuestros datos muestran los niveles de expresión diferencial de 14-3-3ε son contrarias a Leal de [38], que puede ser debido a la diferencia entre las células y tejidos, o puede ser atribuido a la sesgo en la selección de la muestra.

RNH1 es una proteína citosólica que inhibe RNasas y forma heterodímeros de alta afinidad con ellos para desempeñar un papel controvertido en la angiogénesis [42]. Ha habido un aumento en los estudios de investigación para investigar la relación entre RNH1 y el cáncer.

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