PLOS ONE: Pequeña molécula R1498 como un inhibidor de la quinasa bien tolerado y activo por vía oral para el tratamiento del carcinoma hepatocelular y cáncer gástrico a través de Orientación de la angiogénesis y la mitosis Pathways

Extracto

Las proteínas quinasas desempeñan papeles importantes en el desarrollo y progresión del tumor. Un montón de inhibidores de la quinasa han entrado en el mercado y mostrar beneficios clínicos prometedores. Aquí mostramos el descubrimiento de una molécula pequeña novela, bien tolerado, por vía oral inhibidor de quinasa activa, R1498, mayormente dirigida tanto a las vías angiogénicas y mitóticas para el tratamiento del carcinoma hepatocelular (CHC) y el cáncer gástrico (CG). Una serie de ensayos bioquímicos y basados ​​en células indicó que el clúster de destino quinasa de R1498 incluido Aurora quinasas y VEGFR2 et al. R1498 mostró
moderada inhibición del crecimiento in vitro en un panel de células tumorales con IC50 de gama micromol. La vivo
eficacia antitumoral en de R1498 se evaluó en un panel de GC y HCC xenoinjertos en una comparación paralela con otro inhibidor sorafenib multicinasa. R1498 demostró eficacia y perfil de toxicidad superior sobre sorafenib en todos los modelos de ensayo con > inhibición del crecimiento tumoral del 80% y la regresión del tumor en algunos xenogratfts. El potencial terapéutico de R1498 también se destacó por su eficacia en modelos de xenoinjertos derivados de tres GC tumorales primaria humana con una tasa de regresión del tumor 10 a 30%. R1498 ha demostrado inhibir de forma activa la actividad de la aurora un in vivo
, y disminuir la vascularización de los tumores. Por otra parte, R1498 presenta buena in vivo
la exposición y la ventana terapéutica en los estudios farmacocinéticos y de búsqueda del intervalo de dosis. Tesis evidencias indican que R1498 es un bien tolerado, activo por vía oral inhibidor potente, quinasa de múltiples objetivos con un perfil antiangiogénico y antiproliferativo único, y ofrecen una gran confianza para el desarrollo adicional para la terapia de HCC y GC

Visto:. Zhang C, Wu X, Zhang M, Zhu L, Zhao R, Xu D, et al. (2013) de moléculas pequeñas R1498 como un inhibidor de la quinasa bien tolerado y activo por vía oral para el tratamiento del carcinoma hepatocelular y cáncer gástrico a través de Orientación de la angiogénesis y la mitosis Caminos. PLoS ONE 8 (6): e65264. doi: 10.1371 /journal.pone.0065264

Editor: Claude Prigent, Institut de Génétique et Développement de Rennes, Francia |

Recibido: 22 Febrero, 2013; Aceptado: April 23, 2013; Publicado: 5 Junio ​​2013

Derechos de Autor © 2013 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Los proveedores de fondos tenido ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses: Todos los autores son empleados o ex empleados de Roche R & D Center (China), excepto Taiping Chen. , que es un empleado de una empresa CRO llamado Crown Bioscience Inc. Beijing, china. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.

Introducción

Las proteínas quinasas sirven como dianas para la intervención terapéutica en el cáncer, que está validado y probado por la aplicación exitosa y amplia de inhibidores de proteína quinasa en múltiples tipos de cáncer, ya sea como agente único o en regímenes de combinación. Sin embargo, como una enfermedad heterogénea causada por mutaciones acumulativas de múltiples genes en lugar de impulsado por único mutante quinasa, cánceres que tienen una buena respuesta a la terapia de agente único son muy limitados. Además, la resistencia adquirida de los tumores se ayudan rápidamente evadir de la quimioterapia, a continuación, la recaída. La señalización aberrante en los cánceres de complejo atrae el desarrollo de estrategias que se dirigen a múltiples vías biológicas relacionadas con la biología del tumor, como la proliferación, la metástasis y la anti-apoptosis. Una estrategia implica combinaciones racionales de drogas. Por ejemplo, la combinación de la VEGF dirigido anticuerpo monoclonal con la quimioterapia convencional ha demostrado significativa ventaja en la supervivencia en los cánceres de mama, colon y pulmón [1]. Otra estrategia es el desarrollo de los compuestos que cubren múltiples mecanismos dentro de un único agente. Este enfoque tiene varias ventajas potenciales sobre estrategias de combinación, incluyendo la simplicidad de la vía de desarrollo, la velocidad del mercado, y una menor superposición de efectos secundarios. En la actualidad, el sorafenib inhibidor multicinasa se utiliza como tratamiento de primera línea para el CHC avanzado y metastásico con la mejora de la mediana de supervivencia de 7,9 meses (grupo placebo) a 10,7 meses [2]. Sin embargo, el tratamiento con sorafenib resultados en mejoras estadísticamente significativas, pero clínicamente leves, en la supervivencia global, tiempo hasta la progresión y la tasa de control de la enfermedad [3]. Mientras tanto, la terapia tradicional basada en cisplatino sigue siendo ampliamente utilizado en la práctica clínica para GC avanzado y metastásico. Para HER2 /neu adenocarcinomas gástricos, trastuzumab en combinación con quimioterapia prolonga la supervivencia global media de 11,1 meses (quimioterapia sola) a 13,8 meses [4]. Aunque los métodos de diagnóstico companioned se ha establecido para pacientes objetivo pantalla, trastuzumab no tiene actividad en un gran subconjunto de pacientes portadores de alto nivel de HER2 /neu con el motivo de ser identificado [5]. Teniendo en cuenta la alta mortalidad de HCC y GC y los regímenes terapéuticos actuales con resultado limitado, aún hay gran necesidad médica no satisfecha para ambos tipos de cáncer.

angiogénesis terapia del cáncer basada incluyendo anti-VEGFR-2 de anticuerpos, pequeñas moléculas contra VEGFR -2 señalización [6], [7], y la proteína quimérica VEGFR [8], se ha demostrado ser una estrategia eficaz para el tratamiento de varios tipos de cáncer. Además, la eficacia de los inhibidores multicinasa sunitinib y sorafenib parcialmente se atribuiría a la señalización de VEGF bloquea [9]. Sin embargo, un número de pacientes son intrínsecamente resistentes o desarrollan resistencia a la terapia anti-antiangiogénico después de varios ciclos de tratamiento [10], [11]. Por lo tanto, se espera que los ensayos clínicos que combinan inhibidores angiogénicos y medicamentos con mecanismo alternativo de acción para mejorar la eficacia o superar la resistencia al tratamiento antiangiogénico [12]. Ha sido ampliamente reconocido que la sobreexpresión de Aurora quinasas en varios tipos de cáncer está involucrado en el proceso de tumorigénesis [13], [14]. Aurora inhibidor de la quinasa VX-680 fue capaz de inhibir el crecimiento de células cancerosas de manera efectiva in vitro
y in vivo
, y posteriormente se introdujeron en los ensayos clínicos, lo que sugiere que las Aurora quinasas son objetivos druggable [15] .

a la luz de las evidencias acumulativas de la angiogénesis y Aurora quinasas en el cáncer y sus valores terapéuticos probados por los inhibidores de moléculas biológicas y pequeñas, descubrimos un inhibidor de quinasa, R1498, que afectó sustancialmente las vías clave de la angiogénesis y mitosis. R1498 tiene perfil único de inhibición de la quinasa, de alta potencia, y el buen perfiles farmacocinéticos y toxicocinéticos, todas estas apoyar el desarrollo clínico adicional.

Materiales y Métodos

Ética Declaración

El uso y cuidado de animales de experimentación fue aprobado por el Comité Institucional de cuidado de animales y el empleo (IACUC), Roche R & D Center (República Popular china). Crown Bioscience, una empresa de servicios CRO comprometido a proteger la privacidad de los pacientes y seguir todos los principios éticos de las materias derivadas del paciente, recogido muestras tumorales humanas recién desechados, con el IRB (Comité hospital local equivalente) de aprobación y los requisitos de consentimiento de los pacientes. Todas las líneas celulares se adquirieron de ATCC, EE.UU., o Shanghai Institutos de Bioquímica y Biología Celular de la Academia China de Ciencias

Los compuestos

R1498 (pureza > 98%). Se sintetizó por Roche R & D Center (República Popular china). Para los ensayos enzimáticos y in vitro
ensayos basados ​​en células, R1498 se disolvió en DMSO como 0,01 mol /L solución de reserva. Para los estudios en animales, R1498 se disolvió en 1% de Klucel EF /0,1% de agua polisorbato 80 /0,09% metilparabeno /0,01% propilparabeno, la solución se prepara sobre una base semanal. Sorafenib fue sintetizado por Roche R & D Center (China) y disuelto en Cremophor EL /etanol (50:50, Sigma) para preparar un /solución de 5 mg ml de solución madre, en embalaje flexible, y se almacena a temperatura ambiente. Esta solución madre estaba recién preparada cada 3 días. soluciones de dosificación finales se prepararon el día de utilización por dilución de la solución madre con agua esterilizada.

Líneas Celulares

Todas las líneas celulares de American Center típica Collection (ATCC) y el banco celular, Shanghai Institutos de Bioquímica y biología celular, Academia de Ciencias de china se mantuvieron a 37 ° C con 5% de CO _{2 atmósfera húmeda en medio de crecimiento recomendar por los vendedores y se sometió a in vitro
ensayos entre pasajes 8~15 , las líneas de células para estudios con animales fueron entre los pasajes 5~10. de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) obtenido de Allcells (Emeryville, CA) se mantuvo en EGM-2 (Lonza, Allendale, NJ) con suplementos de crecimiento de células endoteliales y 10% de suero bovino fetal (Invitrogen, Carlsbad, CA).}

Ensayo de proliferación celular

Cada línea celular se sembró en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos (Corning, NY) a una densidad predeterminada en 180 l de medio completo, que se adjunta durante la noche y tratados por el compuesto para otro 72 marido. A continuación, el medio se desechó y se reemplazó con 10% CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Japón) en medio completo, a continuación, se incubaron las placas durante 2 h más. El OD _{450 se midió con Spectramax 190 espectrofotómetro (MDS, Sunnyvale, CA). Una absorbancia de fondo de DO en blanco se sustrajo de todos los pocillos. Entonces tasa de inhibición (IR) se determinó con la fórmula siguiente:. IR (%) = (OD DMSO-DO compuesto) /OD DMSO × 100%}

En inducida por VEGF ensayo de proliferación de HUVEC, las HUVEC suspendidas en 170 l EGM-2 con 0,5% de SFB se sembraron y se incubaron durante la noche. Después de que las células unidas, 10 l 1 mg /ml de VEGF 165 (R & D Systems, Minneapolis, MN) humana recombinante se añadió a cada pocillo junto con soluciones de compuesto de 20 l preparados en EGM-2 con 0,5% de FBS. El ensayo de CCK-8 como anteriormente se utilizó para la determinación de la viabilidad celular.

Ensayos de quinasa

La afinidad de R1498 contra 402 quinasas se determinó por KINOMEScan® (Ambit Biosciences, San Diego, CA) y los datos se presentan como valores constantes de disociación (Kd) [16]. La inhibición de la actividad quinasa de Aurora quinasas y VEGFR2 se caracteriza además por Z'-Lyte ensayos de actividad quinasa bajo concentraciones de ATP correspondiente.

HUVEC Tubo Formación Ensayo

ensayo de formación de tubo HUVEC se realizó como se se informó anteriormente [17]. En pocas palabras, Matrigel ™ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) se descongeló a 4 ° C durante 3~4 h. se añadieron 100 l de líquido Matrigel ™ para preenfriado placa de cultivo tisular de 96 pocillos, y la placa se incubó a 37 ° C, 5% de CO _{2 atmósfera humidificada durante 1 h para solidificar Matrigel ™. El HUVECs se cultivaron en EGM-2 con 0,5% de FBS durante la noche, y se sembró en 90 l EGM-2 con 0,5% de FBS a una densidad de 2,2 × 10 ^{5 células /ml en el Matrigel ™ placa recubierta. Las células se trataron por el compuesto o la cantidad equivalente de DMSO. La placa se incubó a 37 ° C, 5% de CO 2 atmósfera húmeda durante 7 h, a continuación, la morfología celular fue capturado con el microscopio de contraste de fase (IX71, Olympus, Hamburgo, Alemania).}}

Western Blot

lisado celular se preparó en tampón RIPA y se cuantificó mediante el método del ácido bicinconínico (BCA) (Pierce, Rockford, IL). Treinta microgramos de proteína por muestra se cargó en un gel de SDS NuPAGE® Novex 4~12% (Invitrogen). La proteína fue trasladado por un dispositivo de transferencia en seco iBlot® (Invitrogen) a membranas de nitrocelulosa. Después de bloquear la unión no específica con TBS /Tween 20 (0,1%) (TBS /T) que contiene leche desnatada al 5% durante 1 h a temperatura ambiente, la membrana se incubó en fosfo-Aurora A (Thr288) (C39D8) anticuerpo monoclonal de conejo ( Cell Signaling Technology, CSTij9, Beverly, MA) o fosfo-histona H3 (Ser10) anticuerpo policlonal de conejo (CSTϊ1) (1:1000 en TBS /T que contiene 3% de albúmina de suero bovino (BSA), y se agitó suavemente en 4 ° C durante la noche. la membrana se lavó con TBS /T tres veces para eliminar el anticuerpo no unido, luego se incubó con el anticuerpo secundario (de cabra conjugado con HRP anti-IgG de ratón o IgG de cabra anti-conejo, 1:10000, Kangchen Biotech, Shanghai, china) durante 1 hora a temperatura ambiente, respectivamente. Las bandas de proteínas se visualizaron con un aumento de quimioluminiscencia (ECL) kit (Pierce, Rockford, IL).

inmunofluorescencia

Las células sembradas en la cámara portaobjetos se fijaron en 4% de paraformaldehído a temperatura ambiente, luego se permeabilizaron con 0,15% de Triton-X100 en TBS y se bloquearon en 3% de BSA en TBS /T. Los anticuerpos primarios (fosfo-Aurora a (Thr288) (CSTĵ7), fosfo -Histone H3 (Ser10) (CSTϊ1) y MPM2 (anti-fosfo-Ser /Thr-Pro) Millipore-368) se incubaron con portaobjetos en una cámara húmeda a 4 ° C durante la noche. Los anticuerpos secundarios con Alexa Fluor ™ 488 IgG de cabra anti-conejo (H + L) o Alexa Fluor ™ 594 de cabra anti-IgG de ratón (H + L) (Invitrogen) se aplicaron, respectivamente, durante una hora después de que los portaobjetos se lavaron con TBS a fondo. Después se retiraron los anticuerpos no unidos, los portaobjetos se secaron y se montaron con medio de DAKO antifide de montaje. Las imágenes fueron capturadas con IX71 debajo de los filtros de excitación y emisión apropiados.

Citometría de Flujo

contenido de ADN se midió con un citómetro FACS-Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA) y la distribución del ciclo celular se calculó como se describe anteriormente [18].

tubulina in vitro
polimerización ensayo

in vitro
ensayo de polimerización de tubulina se realizó tal como se describe anteriormente [18 ]

individual farmacocinético de dosis (SDPK) Estudio

El uso y cuidado de animales de experimentación fue aprobado por Institucional cuidado de animales y el empleo, Roche R &. D Center (República Popular china). ratones desnudos macho (peso corporal: 19 a 24 g) fueron utilizados en el estudio SDPK. Antes del estudio farmacocinético, los animales fueron asignados al azar a los grupos de muestreo (3 animales por punto de tiempo). Diez ratones adicionales se utilizaron para blanco plasma recogido para las curvas de calibración. Los ratones se mantuvieron en ayunas durante la noche antes de la administración oral.

Las muestras de sangre se recogieron mediante punción retro-orbital a antes de la dosis y 0,033, 0,083, 0.25,0.5, 1, 2, 4, 6, 8, y 24 horas después de la dosis. Las muestras de plasma y la formulación de dosis se almacenaron a -20 ° C hasta el bioanálisis. El sistema de adquisición de datos y control se ha creado usando el software Analyst 1.4 de ABI Inc. Las concentraciones en el plasma por debajo del límite de cuantificación (LOQ = 1 ng /ml) fueron designados como cero. El análisis de los datos farmacocinéticos se realizó utilizando los módulos de análisis no compartimentales en WinNonlin v5.2 Professional (Pharsight, EE.UU.) .La biodisponibilidad se calculó como F (%) = (Dosis _{iv × AUC po (0-∞)) /(dosis po × AUC iv (0-∞)) * 100%. Para la rata, perro y mono SDPK, las muestras de sangre se recogieron de punción de la vena yugular.}

xenoinjerto Estudio de Eficacia con las líneas celulares y los tumores derivados de los pacientes

El uso y cuidado de animales de experimentación fue aprobado por institucional Cuidado de Animales y el empleo, Roche R & D Center (República Popular china). Las células tumorales se inocularon en el flanco derecho de ratones BALB /C nu /nu
ratones desnudos hembra (5~6 semanas, 16~18 g, obtenidos a partir de chino-británica SIPPR /BK Lab. Animal Ltd, Shanghai, China) a una densidad óptima basada en nuestro propio estudio de validación. Después se estableció el tumor y alcanzó 100~150 mm ^{3, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en diez ratones por grupo y recibieron tratamiento de acuerdo al programa. El crecimiento del tumor se registró tres veces a la semana con la medición de la longitud (L) y la anchura (W) por el calibrador, y calculado como volumen tumoral (TV, mm 3) = 0,5 * L * W * W (mm) . La inhibición del crecimiento tumoral se calculó como TGI% = (1- (volumen tumoral del grupo de tratamiento en el primer volumen del tumor día-media del grupo de tratamiento en el día final media) /(volumen medio del tumor del grupo de control en la primera el volumen del tumor día-media del grupo control en el día final)) x 100%. La regresión del tumor de ratón individual se definió -. El volumen del tumor al final era menor que el volumen del tumor cuando se inició el tratamiento}

En modelos de tumores primarios humanos, los tejidos tumorales gástricas humanas frescas se implantaron directamente en diabéticos no obesos y inmunodeficientes (NOD-SCID) combinada severa en las 5 horas después de la cirugía con 5 mm ^{3 fragmentos de establecer modelos de xenoinjertos de tumores primarios. Cada modelo de tumor se verificó por al menos tres in vivo
pasos en serie para demostrar la estabilidad de injerto. Los tumores de los pasajes 4-7 se inocularon por vía subcutánea con trocares en los flancos derecho de ratones BALB C nu /nu ratones nude /hembra (5~6 semanas, 16~18 g). El tratamiento se inició cuando el volumen del tumor alcanzó 100~150 mm 3. El protocolo de medición y operación del tumor fue el mismo que el modelo de tumor línea celular derivada.}

La inmunohistoquímica

Las 8 micras incluidos en parafina de tejido tumoral diapositivas preparadas a partir de tumores de in vivo
eficacia estudios se calentaron en un horno seco a 60 ° C durante 1 hora, a continuación, desparafinaron y hidrolizados por Leica Autostainer XL ST5010 a temperatura ambiente. La recuperación del antígeno se llevó a cabo en 95~99 ° C en tampón de citrato (0,01 M, pH 6,0) calentado por un horno de microondas médica en 92-98 ° C durante 5 min, después se enfrió hasta la temperatura ambiente. Entonces reactivo peroxidasa de bloqueo (DAKO, DK-2600, Glostrup Dinamarca) se aplicó para inactivar la peroxidasa endógena. Los portaobjetos se incubaron en suero de bloqueo durante 20 min, luego se cubre con 100 l de fosfo-Aurora A (Thr288) (C39D8) mAb de conejo (CSTij9, 1:200 en TBS /T) o anticuerpo policlonal de conejo anti CD31 humano ( Santa Cruz Biotech, sc-8306, Santa Cruz, CA, EE.UU.; 1:200 en TBS /T) a 4 ° C durante la noche, después se incubaron en 100 l DAKO Envision + /HRP, conejo /ratón después de ser lavado a fondo con TBS. Cien microlitros de solución de sustrato cromogénico (DAB) se aplicaron a los portaobjetos y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 min. Los portaobjetos se aclararon de forma abundante con agua del grifo durante 15 minutos. Contratinción y la deshidratación se llevó a cabo por XL ST5010 a temperatura ambiente. Por último, los portaobjetos se montaron con Permount medio de montaje (Fisher Scientific, Miami, FL).

Dosis Rango de información y de estudio toxicocinética

dosis aplicadas y toxicocinética estudio se llevó a cabo en ratas y Beagle perros basado en in vitro
metabolitos identificación. ratas Wistar (macho: 3, hembra de 3 en cada grupo, desde Vital Río, Beijing, China) se mantuvieron en ayunas durante la noche, y luego recibió artículos de prueba como 0, 6,25, 50 y 100 mg /kg dos veces al día por sonda oral durante un 14 -día régimen continuo. observación de la motilidad se aplicó en una base diaria para encontrar la dosis máxima tolerancia para los animales. Los animales se sacrificaron el d14, y la siguiente observación toxicología se llevaron a cabo incluyendo los cambios del peso corporal, la observación clínica, autopsia general, la química de la hematología y la histopatología. En el día 1 y día 14, las muestras de sangre se obtuvieron mediante punción yugular de todos los animales (si vivo, utilizando tubos de EDTA-K2). Las muestras se mezclaron suavemente y se colocan en húmedo hielo picado hasta la centrifugación, que se llevó a cabo inmediatamente. Las muestras se centrifugaron durante aproximadamente 15 minutos a 4 ° C 2700 rpm. El plasma resultante se separó, se transfirió a tubos de polipropileno claras marcadas de forma exclusiva y se congelaron inmediatamente sobre dióxido de carbono sólido (hielo seco) hasta que fue transferido a aproximadamente -80 ° C. Cada animal se sangró a los siguientes puntos de tiempo: aproximadamente 5 min, 15 min, 30 min, 1, 2, 4, 8 y 24 horas después de la primera dosis en el día específico. Las concentraciones de fármaco en el plasma se determinaron por LC-MS /MS. El análisis farmacocinético se realizó utilizando el software WinNonlin (Versión 5.2, Pharsight Corporation, CA, EE.UU.), y los parámetros farmacocinéticos se calcularon utilizando un método modelo no compartimental.

perros Beagle (aproximadamente 8-10 meses, desde Beijing Marshall Biotecnología Co. Ltd., Beijing, china) se sometieron al protocolo de estudio como se describe anteriormente. Cada grupo tiene un macho y una hembra de perro, la dosis de artículo de ensayo fueron: 0, 1, 7,5 y 15 mg /kg, respectivamente. El uso y cuidado de animales de experimentación fue aprobado por Institucional Cuidado de Animales y el empleo, Roche R &. D Center (China)

Análisis de Datos y Estadística

Se utilizó la prueba t independiente para los datos continuos se aplicó el análisis y la χ2 test para datos categóricos. Los datos se consideraron significativas cuando los valores de P < 0,05.

Resultados

1. Caracterización de R1498 como un inhibidor multicinasa

Pyrazolobenzodiazepine analógico R1498, con un andamiaje basado en la fusión de una benzodiazepina y el anillo de pirazol (Figura 1A), fue identificado previamente como un débil CDK2 (CDK2) inhibidor [19]. Esta molécula mostró la naturaleza de un inhibidor de multicinasa cuando analizamos la biblioteca inhibidor de quinasa. El perfil de inhibición de la quinasa R1498 (1 M) se caracterizó por medio de la concentración de ATP KINOMEScan® en torno a la Km de cada quinasa. El porcentaje de inhibición de R1498 es más del 80% contra el 39 quinasas fuera de 402 quinasas, incluyendo 359 quinasas de tipo salvaje y mutantes 43 quinasa (Figura S1). A continuación se determinaron las constantes de disociación (Kd) de 39 quinasas de golpe, y las quinasas con Kd < 0,2 M se muestran en la Figura 1B. La mayoría de los éxitos potenciales pertenecen a la familia de la tirosina quinasa (TK) y familia AGC. Además, el ensayo de Z-Lyte se llevó a cabo para más determinación de la actividad de inhibición de quinasa de R1498. Los resultados mostraron que las CI50 de R1498 fueron 25 ± 6, 67 ± 4, 167 ± 13 nM frente a VEGFR2, Aurora quinasa A y B, respectivamente (Figura 1C). Entonces nuestro estudio se centró en las vías anti-angiogénicos y anti-mitóticos mayormente afectados por R1498
.

Un panel de 16 líneas celulares de cáncer, incluyendo hepatocarcinoma, cáncer gástrico y líneas de células de carcinoma nasofaríngeo, se utilizó para determinar la in vitro
anti-proliferación de la capacidad de R1498. La mayoría de las líneas celulares se establecen a partir de los cánceres de Asia, como los cánceres prevalentes asiáticos son nuestro enfoque. El hepatocarcinoma y el panel de la línea celular de cáncer gástrico fueron más sensibles al tratamiento con R1498 que las líneas celulares de cáncer nasofaríngeo. Los IC50 medias globales fueron 7,81, 7,55 y 30,07 mu M, que corresponde a epatocellular carcinoma, cáncer gástrico, y líneas de células de carcinoma nasofaríngeo, respectivamente. La sensibilidad de las líneas celulares derivadas de población asiática (BEL-7402, QGY-7701 y QGY-7703) fue comparable a la sensibilidad de Hep3B que era de raza caucásica (Figura 1D).

2. R1498 Inhibe Aurora quinasas e induce la detención del ciclo celular

inhibición de la quinasa Aurora de R1498 fue visualizado por inmunofluorescencia en la línea celular de cáncer gástrico SGC-7901. sitios de fosforilación directos fosfo-Aurora quinasa A (T288) y fosfo-histona H3 (S10) se usa para indicar la actividad de la quinasa de Aurora A y B, respectivamente [20], [21]. Fosfo-Ser /Thr-Pro proteína mitótica monoclonal(MPM2) se utilizó como un marcador mitótico (rojo) para células mitóticas etiquetado. Aurora quinasa A (T288) fosforilación se produce en el centrosoma de células mitóticas (verde). Después de que las células se trataron con 5 mM MR1498 durante 24 h, los focos verde Aurora A T288 en células mitóticas se hizo más débil o desapareció (Figura 2A, panel superior), que muestra que la actividad de Aurora quinasa A se redujo tras el tratamiento R1498. La fosforilación de la histona H3 (S10) se localiza principalmente en los centrómeros de células mitóticas. Después de que las células se trataron con R1498, el H3 fosfo-histona (S10) se redujo drásticamente (verde). Esta observación sugiere que la actividad de Aurora quinasa B también se dejó caer en el tratamiento R1498. Estos resultados de inmunofluorescencia fueron confirmados por Western blot. Como se muestra en la Figura 2B, la fosforilación de fosfo-Aurora quinasa A (T288) y H3 fosfo-histona (S10) disminuyó de una manera dependiente de la concentración en el tratamiento agudo por R1498.

La inhibición de Aurora quinasas A y B produce diferentes cambios fenotípicos en el ciclo celular. Supresión de la aurora un arresto fase G2 del ciclo celular inducida [22], mientras que la inhibición de Aurora quinasa B, ha causado al poliploidía en las células debido a endoduplication sin citocinesis [15]. Después de que las células fueron tratadas con 10 mM R1498, tanto SGC-7901 (células de cáncer gástrico) y BEL-7402 (células de carcinoma hepatocelular) mostró G2 /M detención de fase y la acumulación de células poliploides. Para BEL-7402, las células distribuyendo en G2 /M fases aumentaron de 25,6% a 57,0%, mientras tanto, las células con > 4 el contenido de N de ADN aumentó de 6,7% a 17,6%. SGC-7901 fue más sensible, con el G2 /M población aumentó de 25,2% a 75,5%, y las células poliploides aumentó del 3,1% al 21,6% (Figura 2C). estabilizador de microtúbulos (por ejemplo, taxol) y desestabilizador (por ejemplo colchicina) causará detención en la fase G2 /M también. Para entender si R1498 es un reactivo de microtúbulos dirigidos, in vitro
ensayo de polimerización de tubulina se llevó a cabo en. Los datos mostraron que R1498 ni estabilizado ni desestabilizó la polimerización de microtúbulos, incluso en la concentración de R1498 alta (40 mM) in vitro
(Figura 2D), lo que sugiere que la detención del ciclo celular G2 /M no fue causada por la perturbación de los microtúbulos del citoesqueleto. En conjunto, estos datos sugieren que R1498 inhibió la Aurora quinasas A y B en las células y produjo los cambios fenotípicos en las células.

3. R1498 antagoniza el progreso angiogénesis de células endoteliales humanas

La angiogénesis se inicializa por la secreción de factor de crecimiento angiogénico de las células tumorales y, a continuación proliferan las células endoteliales, la migración y los tubos de forma de los vasos en las respuestas a la estimulación de VEGF. Para abordar la especificidad de R1498 antagonizar el crecimiento de células endoteliales estimulada por VEGF, las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs) se expusieron a dos estímulos diferentes, VEGF y FBS, en el tratamiento de R1498 durante 72 h. Bajo las condiciones de cultivo que contienen VEGF o FBS, HUVECs mostró respuesta diferente a R1498. Los IC50 fueron 89 y 2064 nM para VEGF y FBS, respectivamente; éstos sugirieron que R1498 antagoniza el crecimiento HUVEC impulsada por VEGF más potente que la de FBS (Figura 3A). En ensayo de formación de tubo HUVEC, después de 8 horas de exposición a R1498, HUVECs formó un menor número de mallas de tubos intactos que en los grupos tratados con DMSO (Figura 3B). R1498 no afectó a la proliferación de HUVEC bajo esta condición de tratamiento (datos no mostrados).

4. R1498 suprime el crecimiento de xenoinjertos de cáncer humano

Las propiedades farmacocinéticas con una sola dosis de R1498 en múltiples especies fueron determinadas. El tiempo de vida media (T1 /2) y la biodisponibilidad oral (BA Oral%) favorece estudio más eficacia en ratón desnudo (Tabla S1) con un programa de alimentación forzada oral dos veces al día. Se empleó un grupo de xenoinjertos, incluyendo el cáncer gástrico asiática, hepatocarcinoma y el cáncer nasofaríngeo para la comparación entre R1498 y otro inhibidor sorafenib multicinasa (Figura 4, Tabla S2). Sorafenib está aprobado como tratamiento de primera línea para el hepatocarcinoma [2], y está en ensayo clínico de terapia combinatoria para el cáncer gástrico avanzado [23]. La comparación paralela constaba de inhibición del crecimiento tumoral, regresión y cambios de peso corporal de los animales con una dosificación de 25 mg /kg, dos veces al día por vía oral. En todos los xenoinjertos ensayados, R1498 mostró mejor tasa de inhibición del crecimiento tumoral (TGI%) sobre sorafenib. Para hepatocarcinomas, el TGI% de los R1498 es 10-19% más de TGI% de sorafenib, para el cáncer gástrico, 2-12% sobre TGI% de sorafenib. La tasa de regresión del tumor también se incorporó como otro punto final terapéutico. En el panel hepatocarcinoma, se observó regresión tumoral en BEL-7402 modelo, 8/10 (80%) animales tenían de regresión en el grupo de R1498, mientras que 1/10 (10%) de los animales tenía regresión en el grupo de sorafenib (Figura 4, BEL-7402) . Para el panel de cáncer gástrico, MGC-803 y xenoinjertos SGC-7901 tenían la misma tasa de regresión en respuesta a los artículos de prueba: 5/10 (50%) para R1498, y 2/10 (20%) de sorafenib (Figura 4, SGC -7901; y el cuadro S2). Sobre la base de los criterios de valoración de eficacia de los 7 modelos probados, R1498 tiene una mejor eficacia que sorafenib bajo el mismo programa de tratamiento. Por otra parte, R1498 mostró buena eficacia en un xenoinjerto de carcinoma nasofaríngeo, el TGI% de R1498 (90%, 25 mg /kg, dos veces al día, por sonda oral) era superior sobre estándar de ciclofosfamida cuidadosamente (60%, cada 10 días, inyección intraperitoneal) (Figura 4, CNE-2). Los cambios de peso corporal, que se registraron en todos los modelos para la comparación de la toxicidad mostraron que el ratón desnudo mostró más tolerable para R1498 durante todo el tratamiento en BEL-7402, SGC-7901 y CNE-2 modelos, aunque el aumento de peso corporal disminuyó ligeramente de 10 días después tratamiento (Figura 4, Tabla S2). Sin embargo, sorafenib causada caída continua del peso corporal del animal. Para ratón tratado con sorafenib en modelos BEL-7402 y SGC-7901, el porcentaje de pérdida de peso corporal supera el 15% en el día de terminación. Como se muestra en la Tabla S2, R1498 mostró un menor impacto sobre el peso corporal del ratón de sorafenib hizo, lo que sugiere que R1498 llevó a cabo un mejor perfil de seguridad.

5. R1498 regula a la baja fosforilación de Aurora A y Vascular densidad en Tumor
se utilizaron

fosforilado Aurora A (T288) y CD31 en tumores de estudio de eficacia para la determinación del efecto en el blanco de R1498. La masa tumoral cosechado a partir del estudio de xenoinjerto BEL-7402 se preparó en diapositivas incluidas en parafina y se sometió a inmunohistoquímica para la visualización de CD31 humana fabricante de la angiogénesis y Aurora quinasa A la actividad marcador de fosfo-Aurora A (T288). En los tumores BEL-7402, la tinción CD31 de los grupos de tratamiento R1498 disminuyó de una manera dependiente de la dosis, lo que sugiere la vascularización de los tumores se inhibió (Figura 5A). La actividad de Aurora quinasa A también se redujo tras el tratamiento R1498, que se refleja en la tinción más débil de los tumores fosfo-Aurora A (T288) en R1498 tratados (Figura 5B).

gástrica modelo de xenoinjerto de tumor primario derivado Humano se utilizó para predecir la eficacia de la traducción clínica. Los tejidos cancerosos de tres pacientes con cáncer gástrico individuales fueron arraigado en el ratón, y xenoinjertos delineados diferentes curvas de crecimiento in vivo
. Los xenoinjertos mostraron impacto diferente sobre los cambios en el peso corporal de los anfitriones. Los ratones se trataron con R1498 (25 mg /kg) para el periodo indicado, la final TGI% alcanzó 73,6 ~ 91,6%, con tasas de regresión 10~30%. Los cambios de peso corporal limitados sugieren que el tumor teniendo ratones fueron bien asimilado a R1498 (Figura 6).

6. R1498 tiene buen perfil farmacocinético (PK) y la ventana terapéutica

SDPK indicaron que las propiedades de biodisponibilidad y la vida media aceptables de R1498 entre ratón desnudo, ratas y perros (Tabla S1). microsomas de hígado agrupados fueron utilizados para predecir los principales metabolitos en diferentes especies. Ratas y perros beagle con metabolitos de microsomas similares de humano fueron utilizados en el estudio de dosis máxima tolerante (MTD) para determinar la ventana terapéutica entre las exposiciones eficaces y tóxicos (Tabla S4). Las ratas hembras y machos mostraron respuesta diferente a las dosis escaladas de R1498.

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