El oscilador genético captura cambios en los patrones de crecimiento del microbioma intestinal

A pesar de toda la atención que ha recibido el microbioma humano durante los últimos años, Un aspecto de dicha investigación rara vez aparece en los titulares:la dificultad de observar cómo cambia con el tiempo en respuesta a diversos estímulos. El método de análisis más común es extraer bacterias de muestras fecales y luego secuenciar sus genomas. pero este enfoque, aunque mínimamente invasivo, pierde información crucial sobre dónde y cuándo ocurren los cambios bacterianos en el intestino, proporcionando a los científicos una imagen incompleta de la dinámica del microbioma.

Ahora, una nueva herramienta creada por investigadores del Instituto Wyss de Ingeniería de Inspiración Biológica de la Universidad de Harvard y la Escuela de Medicina de Harvard (HMS) proporciona una solución a este problema en forma de un conjunto de genes bacterianos que han sido diseñados para detectar y registrar cambios en la crecimiento de diferentes poblaciones de bacterias a lo largo del tiempo en las entrañas de ratones vivos con precisión unicelular, y puede servir como plataforma para diagnósticos y terapéuticos basados ​​en biología sintética para una variedad de aplicaciones en el intestino. El estudio se publica en Comunicaciones de la naturaleza .

Manteniendo el tiempo

El sistema utiliza un circuito genético oscilante, llamado represor, como una especie de reloj genético para medir el crecimiento bacteriano. El represor consta de tres genes bacterianos que codifican tres proteínas (tetR, cl, y lacI), cada uno de los cuales bloquea la expresión de una de las otras proteínas. Los genes están vinculados a un circuito de retroalimentación negativa, de modo que cuando la concentración de una de las proteínas represoras cae por debajo de cierto nivel, se expresa la proteína que había estado reprimiendo, que bloquea la expresión de la tercera proteína, y el proceso se repite de forma cíclica.

Cuando los tres genes se insertan en un plásmido y se introducen en bacterias, el número de ciclos de ciclo de retroalimentación negativa completados puede servir como un registro de cuántas divisiones celulares han sufrido las bacterias. Cada vez que las bacterias se dividen, las proteínas represoras presentes en su citoplasma se diluyen, por lo que su concentración cae gradualmente y desencadena la expresión de la siguiente proteína en el ciclo represor. Crucialmente, el ciclo represor se repite después de 15,5 generaciones de bacterias, independientemente de la rapidez o la lentitud con que crezcan las bacterias. Esto le permite actuar como una medida objetiva del tiempo, como un reloj o un reloj.

"Imagínese si tuviera dos personas usando dos relojes diferentes, y el segundero del reloj de una persona se movía dos veces más rápido que el de la otra persona, "explicó el primer autor David Riglar, Doctor., un ex postdoctorado en el Wyss Institute y HMS que ahora dirige un grupo de investigación como Sir Henry Dale Fellow en el Imperial College de Londres. "Si detuvo ambos relojes después de una hora, no se pondrían de acuerdo sobre la hora que era, porque su medición del tiempo varía según la velocidad del movimiento de la manecilla de segundos. A diferencia de, nuestro represor es como un reloj que siempre se mueve a la misma velocidad, así que no importa cuántas personas diferentes usen uno, todos darán una medición coherente del tiempo. Esta cualidad nos permite estudiar con mayor precisión el comportamiento de las bacterias en el intestino ".

Los investigadores acoplaron cada una de las tres proteínas represoras a una molécula fluorescente de diferente color, y desarrolló un flujo de trabajo de imágenes llamado RINGS (Inferencia de crecimiento basada en represores a nivel de una sola célula) para rastrear qué proteína se expresa en diferentes puntos de tiempo durante el crecimiento de la bacteria. "A medida que una colonia de bacterias crece hacia afuera, el circuito represor crea estos diferentes fluorescentes, firmas en forma de anillo de árbol basadas en qué proteína represora estaba activa en la única bacteria que inició la colonia, "dijo Riglar." El patrón de los anillos fluorescentes registra cuántos ciclos represores han ocurrido desde que comenzó el crecimiento, y podemos analizar ese patrón para estudiar cómo varían las tasas de crecimiento entre diferentes bacterias y en diferentes entornos ".

Usando ANILLOS, el equipo pudo rastrear con éxito las divisiones celulares en varias especies bacterianas diferentes cultivadas in vitro, y observaron que la duración del ciclo represor de las bacterias se mantuvo constante cuando se cultivaron en muestras extraídas de intestino de ratón (para simular un microambiente complejo) o expuestas a un antibiótico (para simular condiciones de estrés y patrones de crecimiento inconsistentes).

Seguimiento del cambio

Para evaluar el desempeño del represor in vivo, el equipo administró E. coli que contiene el circuito represor a ratones por vía oral, luego analizó las bacterias extraídas de muestras fecales. El represor permaneció activo hasta 16 días después de la introducción, mostrando que la expresión génica oscilatoria a largo plazo podría mantenerse en bacterias intestinales en mamíferos vivos. El análisis RINGS detectó con éxito cambios en los patrones de crecimiento bacteriano, y las bacterias cuyos circuitos represores se encontraban en diferentes etapas podrían "sincronizarse" dándoles a los ratones un compuesto en el agua de bebida que detuviera el ciclo represor en una etapa determinada.

Finalmente, los investigadores probaron la capacidad del represor para detectar diferencias en las tasas de crecimiento bacteriano que se han observado como resultado de la inflamación intestinal. A los ratones se les administró un compuesto inductor de inflamación, seguido de bacterias cargadas con represor. Después de 15 horas, El análisis de RINGS mostró que las bacterias de los ratones con inflamación tenían represores en una gama más amplia de fases en comparación con las bacterias de los ratones de control. sugiriendo que la inflamación produce un ambiente que genera inconsistencias en el crecimiento bacteriano, potencialmente conduciendo a desequilibrios en el microbioma intestinal.

Este represor nos permite sondear realmente las complejidades del comportamiento bacteriano en el intestino vivo, no solo en estados sanos y enfermos, pero también espacial y temporalmente. El hecho de que podamos volver a sincronizar el represor cuando ya está en el intestino, así como mantenerlo sin necesidad de administrar antibióticos selectivos, también significa que podemos estudiar el microbioma en un estado más natural con una interrupción mínima ".

Pamela Silver, Doctor., Autor correspondiente, Miembro principal de la facultad en el Instituto Wyss, Elliot T. y Onie H. Adams Profesor de Bioquímica y Biología de Sistemas en HMS

Además de comprender la dinámica del microbioma, el represor desbloquea el potencial de complejos, diagnósticos y terapéuticos basados ​​en biología sintética para el intestino humano. Las aplicaciones potenciales incluyen la creación de un sistema que está programado para iniciar una cascada de transcripción de genes en un cierto punto del ritmo circadiano, o un diagnóstico que registra cuánto tiempo ha transcurrido desde la detección de un biomarcador determinado.

"Esta investigación no solo resuelve un problema específico relacionado con el monitoreo de cambios dinámicos en la fisiología del microbioma dentro del intestino vivo, proporciona una plataforma que podría conducir a tipos completamente nuevos de diagnósticos e incluso terapias dependientes del tiempo ", dijo el director fundador de Wyss, Donald Ingber, MARYLAND., Doctor., quien también es el Profesor Judah Folkman de Biología Vascular en HMS y el Programa de Biología Vascular en el Boston Children's Hospital, así como profesor de bioingeniería en la Escuela de Ingeniería y Ciencias Aplicadas John A. Paulson de Harvard.

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