La inmunización con la inmunodominante Helicobacter suis ureasa subunidad B induce una protección parcial contra la infección por H. suis en un ratón model

La inmunización con la inmunodominante Helicobacter suis
ureasa subunidad B induce una protección parcial contra H. suis
infección en un modelo de ratón
Resumen
Helicobacter gratis (H.
) suis
es un patógeno porcino y gástrico humano. Estudios previos en ratones mostraron que un H. suis
infección no da lugar a una inmunidad protectora, mientras que la inmunización con H. suis
lisado de células enteras (lisado) protege contra una infección experimental posterior. Por lo tanto, se realizó la electroforesis en gel bidimensional de H. suis
proteínas seguido por inmunotransferencia con sueros combinados de H. suis
- infectados ratones o ratones inmunizados con lisado. Se observó una débil reactividad frente a H. suis
proteínas en el suero después de la infección. Los sueros de los ratones de lisado inmunizados, sin embargo, mostró inmunorreactividad contra un total de 19 puntos de proteínas que se identificaron utilizando LC-MS /MS. El H. suis
ureasa subunidad B (UreB) mostró reactividad más pronunciado contra sueros de ratones inmunizados lisado y no se detectó con sueros de ratones infectados. Ninguno de los sueros combinados detecta H. suis
activación de neutrófilos-proteína A (NAPA). La eficacia protectora de la vacunación intranasal de ratones BALB /c con H. suis
UreB y Napa, tanto de forma recombinante expresada en Escherichia coli
(rUreB y rNapA, respectivamente), se comparó con la de H. suis
lisado. Todas las vacunas contenían choleratoxin como adyuvante. La inmunización de ratones con rUreB y lisado indujo una reducción significativa de H. suis
colonización en comparación con no vacunados H. suis
infectados por los controles, mientras rNapA no tuvo efecto protector significativo. Probablemente, una combinación de las respuestas locales Th1 y Th17, complementada por las respuestas de anticuerpos juegan un papel en la inmunidad protectora contra las infecciones
H. suis.
Introducción
Helicobacter
(H.
) suis
es un patógeno propagación en todo el mundo, colonizando principalmente cerdos. Una infección con esta bacteria Gram-negativa se ha asociado con las úlceras de la mucosa no glandular gástrica [1, 2] y causa gastritis y la disminución de la ganancia de peso diaria [3] en los cerdos. H. suis
también los no-Helicobacter pylori Helicobacter
especie más frecuente en los seres humanos que sufren de trastornos gástricos [2] y los cerdos pueden servir como una fuente de H. suis
infecciones para los seres humanos [2, 4 ]. El control de H. suis
infecciones por terapia a base de antibióticos no se recomienda debido en parte a un aumento del riesgo de desarrollar adquirido resistencia a los antibióticos en H. suis
cepas y en las bacterias que pertenecen a la microbiota porcino normal [5]. Por lo tanto, la inmunización contra H. suis
puede representar una alternativa valiosa. Hasta ahora, sin embargo, pocos estudios se han ocupado de la vacunación contra este patógeno porcino y zoonótica.
Estudios previos en un modelo de ratón mostraron que un
infección por H. suis no da lugar a una inmunidad protectora, mientras que la vacunación basado en homóloga (H. suis
) o heterólogo (H. bizzozeronii
o H. cynogastricus
) lisado de células completas indujo una reducción o incluso desaparición completa de la colonización gástrica por H. suis
[6]. Sin embargo, el uso de este tipo de vacunas tiene inconvenientes, incluyendo el laborioso cultivo in vitro de H. suis
, que se traduce en dificultades para producir antígeno suficiente. Además, los lisados ​​de células enteras pueden contener tanto antígenos protectores y antígenos supresores de protección [7]. Una vacuna eficaz subunidad podría ser una alternativa útil para el control de las infecciones por H. suis
. Immunoproteomics es un enfoque adecuado para la rápida identificación de proteínas candidatas para la vacunación y se ha aplicado para estudiar y desarrollar vacunas de subunidades para una amplia gama de patógenos [8].
Era el objetivo del presente estudio para seleccionar H. suis
proteínas que podrían inducir inmunidad protectora contra H. suis
infección. Por lo tanto, H. suis
proteínas reconocidas por los sueros de ratones inmunizados con H. suis
lisado de células enteras y protegidos contra la infección se identificaron mediante el uso de la electroforesis bidimensional (2D) en gel seguida por inmunotransferencia y LC-MS /SRA. Sera de suis
H. - infectados ratones también fueron incluidos, ya que una infección no da como resultado la protección. Sobre la base de este análisis, el inmunorreactiva H. suis
subunidad B de la ureasa (UreB) fue seleccionado para realizar más pruebas in vivo. Como control se incluyó la H. suis
proteína activadora de neutrófilos A (NAPA), que ha sido previamente descrito como un posible factor de virulencia [9], pero no fue reconocido por los sueros de ratones inmunizados con lisado de células enteras. Posteriormente, la eficacia protectora contra un H. suis
infección de ambas vacunas de subunidades se evaluó y se comparó con la de H. suis
lisado en un modelo estandarizado ratón.
Materiales y métodos Cepa bacteriana

En todos los experimentos, H. suis
cepa 5 (HS5, GenBank: ADHO00000000) se utilizó. Esta cepa fue aislada de la mucosa gástrica de un cerdo de acuerdo con el método descrito por Baele et al. [10].
Animales
Una semana antes de la iniciación de los experimentos, de cinco semanas de edad de patógenos específicos ratones exento hembra BALB /c se obtuvieron a partir de un criador autorizado (Harlan, Horst, Países Bajos). Los animales se alojaron en virutas de madera esterilizado en parte superior del filtro jaulas. Ellos fueron alimentados con una dieta comercial en autoclave (TEKLAD 2018S, Harlan) y recibieron agua ad libitum
autoclave. Todos los experimentos con animales de laboratorio fueron aprobados por el Comité de Atención y Ética Animal de la Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de Gante.
Immunoproteomics de H. suis
de dos dimensiones electroforesis en gel (2D-PAGE)
HS5 se cultivó como se ha descrito anteriormente [11]. Las bacterias fueron cosechadas por centrifugación (5.000 g
, 4 ° C durante 10 min) y se lavaron cuatro veces con solución salina equilibrada de Hank (HBSS). Las proteínas totales (proteínas solubles e insolubles) se extrajeron en dos pasos usando el kit de extracción secuencial ReadyPrep ™ (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Con el fin de obtener buenos resultados en 2D-PAGE, los homogeneizados se trataron con aditivos adecuados (5 mg de cóctel inhibidor de la proteasa, 1 l de ADNasa I, 1 l de ARNasa A, 10 inhibidores de la fosfatasa mu l PP2 y PP3 (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemania) ). Por último, se determinó la concentración de proteína usando el RC DC
ensayo de proteínas (Bio-Rad) y las proteínas se almacenaron a -70 ° C hasta su uso posterior. Un total de 100 g de proteínas HS5 se rehidrataron en tampón de rehidratación l 200 (urea 7 M, 2 M thioureum, 2% CHAPS, 0,2% anfolito portador pH3-4, 100 mM de ditiotreitol (DTT) y azul de bromofenol). Las muestras se absorben pasivamente en un ReadyStrip (11 cm, pH 3 a pH 10, Bio-Rad) y se centra isoeléctrico se llevó a cabo en una Cámara Protean IEF (Bio-Rad) como se describe anteriormente [12]. Después de isoelectroenfoque, las tiras se equilibraron durante 15 min en 1,5% de DTT en tampón de equilibrado (50 mM Tris HCl, pH 8,8 6M urea, 20% de glicerol, 2% SDS), seguido por otro de equilibrado en 4% yodoacetamida en tampón de equilibrio. La electroforesis en gel se llevó a cabo en un TrisHCl SDS-PAGE 10% usando 150 V durante 30 min, seguido de 200 V durante 1 h. Dos geles se corrieron en paralelo: uno se tiñó con tinción Sypro® Rubí Gel de proteínas (Bio-Rad) mientras que el otro se utilizó para inmunotransferencia (véase la transferencia Western se describe a continuación). Antes de la tinción, los geles se fijaron en MeOH al 10%, ácido acético 7%. Después de la tinción, H. suis
proteínas se visualizaron utilizando el sistema de imágenes VersaDoc (Bio-Rad) mezclas de suero
tres grupos de sueros de ratón se utilizaron en este estudio:.

Los sueros de los ratones inmunizados con H. suis
lisado de células enteras (de aquí en adelante como "ratones lisado inmunizados") (n
= 10). Estos animales se inocularon por vía intranasal dos veces con tres semanas de intervalo con 100 g HS5 lisado + 5 g toxina del cólera (CT) (Lista Biological Laboratories Inc., Madison, NJ, EE.UU.). HS5 lisado se preparó como se describe anteriormente pero sin la filtración final del sobrenadante [6]. Tres semanas después de la última inmunización, se recogió sangre y los sueros se agruparon. Este protocolo de inmunización se ha demostrado ser (parcialmente) de protección contra H. suis
desafío [6] y el efecto protector fue confirmado aquí en un experimento preliminar (datos no mostrados).

Sera de H. suis
ratones infectado con (en lo sucesivo, "ratones infectados") (n
= 10). Estos animales fueron inoculados por vía intragástrica con 200 l de caldo de Brucella a pH 5, que contiene 10 ^{8 recién preparados H. suis
bacterias [11]. Cuatro semanas después de la infección, se recogió sangre y los sueros se agruparon.}

Los sueros de los ratones de control negativo (n = 10
). Estos animales recibieron por vía intranasal HBSS dos veces con un intervalo de tres semanas seguido por inoculación intragástrica con 200 l de caldo de Brucella a pH 5 (4 semanas después de la última inmunización simulada). Después de cuatro semanas, se recogió sangre y los sueros se agruparon.
Todos los sueros fueron almacenados a -70 ° C hasta su uso posterior.
Western Blot Las proteínas fueron
electrotransferred a partir de geles a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad) como se describe en otra parte [12]. Las membranas se bloquearon en 5% de leche desnatada en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (tampón de bloqueo), se incubaron durante la noche (ON) con suero de ratón diluido (1/100 en tampón de bloqueo) a temperatura ambiente (RT), se aclararon en PBS con 0,3% Tween-20 (tampón de lavado) y se incubaron durante 1 h a TA con cabra estabilizado inmunoglobulina anti-ratón de G (IgG) con peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con (1/1000 en tampón de bloqueo, Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). Después de una etapa de lavado en tampón de lavado, la inmunodetección de las proteínas se realizó por detección de quimioluminiscencia usando sustrato Duración Supersignal West Dura Extended (Pierce). los patrones de proteínas fueron escaneadas y digitalizadas utilizando el sistema de imágenes VersaDoc. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
La digestión de proteínas en gel y la identificación por espectrometría de masa
en gel se llevó a cabo la digestión de las proteínas como se describe por Cheung et al. [13]. Antes de la espectrometría de masas de los péptidos aislados se separaron en una cromatografía líquida U3000 nano-alta resolución (HPLC) (Dionex, Sunnyvale, CA, EE.UU.) como se describe anteriormente [14].
Identificación de los péptidos se realizó utilizando un electrospray ionización cuadrupolo espectrometría de masas de tiempo de vuelo (ESI-Q-TOF) Ultima (Waters, Milford, MA, EE.UU.) como se describe anteriormente [14]. El análisis de datos se realizó contra el Helicobacter
proteína base de datos de NCBI (146 612 entradas), utilizando el motor de búsqueda en la casa de la mascota del demonio (2.3, Ciencia Matrix, Londres, Reino Unido). Una búsqueda tolerante de error se realizó con Carbamidomethyl (C) como la modificación fija. Carbamidomethyl (N-terminal) y la oxidación (M) se establecieron como variable modificaciones. Péptido masa tolerancia y la tolerancia de masas de fragmentos se fijó en 0,35 y 0,45 Da Da, respectivamente. Se permitió un máximo de dos miscleavages. Las proteínas únicamente se consideraron para ser anotado correctamente cuando la significación fue inferior a 0,05 (p
< 0,05) y al menos un péptido pasado los criterios rojas en negrilla necesarios de Mascot Daemon, lo que indica que al menos un péptido tenía rango 1 y un significado por debajo de 0,05.
Uno-dimensional electroforesis en gel (1D-PAGE) y transferencia Western de rUreB
1D-PAGE de 10 g recombinante H. suis
ureasa subunidad B (rUreB) se realizó como se describe por Van Steendam et al. [12]. análisis de preparación de Sera y Western blot se realizaron como se ha descrito anteriormente.
eficacia protectora de recombinante H. suis
proteínas en un modelo de ratón
Preparación de UreB recombinante
Un fragmento que codifica el H. suis
secuencia UreB (GenBank etiqueta locus HSUHS5_0285) se amplificó mediante PCR utilizando una polimerasa de pwo con la actividad de corrección de pruebas (Roche, Mannheim, Alemania) a partir del ADN de HS5 (cebador directo: 5 'ATG AAA AAA ATC TCT AGG AAA GAA TAT G -3 '; cebador inverso: 5'-CTA GTG ATG GTG ATG GTG ATG GAA CAA GTT GTA GAG TTG AGC-3') y se clonó en el vector de expresión de la proteína pET-24d. El rUreB se expresó en E. coli
cepa BL21 (DE3). Las células se lisaron por sonicación (5 veces durante 30 s) en tampón que contenía 50 mM Na.PO 4 pH 7, NaCl 0,5 M, DTT 1 M, 1% de Triton X-100 y 1 mM de PMSF. Después de la centrifugación (4 ° C, 20 000 g Opiniones de 30 min), rUreB se purificó de la fracción soluble usando la cromatografía de afinidad Ni-en tampón que consiste en 1 M NaCl, 50 mM PBS, 1% de Triton X-100, 250 mM de imidazol y 10% de glicerol (Su GraviTrap, GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Suecia), seguido por filtración en gel en una columna Superdex ™ 200 HR 16/60 (GE Healthcare Bio-Sciences AB). Después de la purificación, rUreB se analizó mediante SDS-PAGE y análisis de transferencia de Western usando anticuerpo anti-hexahistidina-tag monoclonal de ratón (Cell Factory Icosagen, Tartu, Estonia). El detergente Triton X-100 fue retirado de la rUreB purificada mediante el uso de detergentes Pierce columnas de eliminación de centrifugado (Pierce) siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración de proteína se determinó con el RC DC
ensayo de proteínas (Bio-Rad).
Preparación de Napa recombinante
La proteína se expresó en E. coli
sistema de expresión con Gateway ® Tecnología (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) como sigue. Un fragmento que codifica la secuencia de H. suis
activadora de neutrófilos proteína A (NAPA) (GenBank etiqueta locus HSUHS5_0014) se amplificó mediante PCR utilizando una polimerasa de Pwo con la actividad de corrección de pruebas (Roche) a partir del ADN de HS5 (cebador directo: 5 ' - CACCATG AAAGCAAAAACAGTTGATGTACTC -3 '; cebador inverso: 5' TTAAGCCAAACTTGCCTTAAGCATCC -3 ') y se clonó en el ™ /TEV /D-TOPO® vector pENTR y se transfiere en el vector de destino pDEST17 ™. El plásmido pDEST17-Napa seleccionada se transformó en el BL21-AI ™ E. coli
y posteriormente se cultivaron a 37ºC hasta una DO 600 de 0,6-1,0 en caldo Luria suplementado con 50 mg /ml de carbenicilina. Recombinante H. suis
Napa expresión (rNapA) fue inducida por la adición de 0,2% de arabinosa L-. Después de 4 h de incubación a 37 ° C, se recogieron y se resuspendieron en tampón de lisis de las células: 50 mM Tris HCl, 100 mM de NaCl, 1% Triton X-100, 0,2 mg /ml de lisozima, 20 mg /ml de DNAsa, inhibidor de proteasa 1 mM (Sigma) y 1 mM de MgCl 2. Las células se lisaron por sonicación (5 veces durante 30 s). cuerpos restos de células y de inclusión se aislaron mediante centrifugación a 4 ° C (20 000 g Opiniones de 30 min). Los cuerpos de inclusión se lavaron posteriormente dos veces basado en el siguiente protocolo: el sedimento se resuspendió en tampón de lisis frío, se sonicó 5 veces durante 30 s, seguido de centrifugación (4 ° C, 20 000 g Opiniones de 30 min). Los cuerpos de inclusión lavados se solubilizaron en tampón de unión, pH 8 (6 M de guanidina HCl, 20 mM Tris HCl, 0,5 M NaCl, 5 mM de imidazol, 1 mM de β-mercaptometanol) por la rotación suave durante 1 h a TA. El material insoluble se eliminó por centrifugación a alta velocidad a 4 ° C (100 000 g Opiniones de 30 min). rNapA se purificó a partir del sobrenadante clarificado en una columna de Ni-sepharose (Su GraviTrap, GE Healthcare Bio-Sciences AB) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. rNapA se eluyó con tampón de elución, pH 8 (urea 8M, 20 mM Tris HCl, 0,5 M NaCl, 0,5 M imidazol, y 1 mM de β-mercaptoetanol) y ON se dializó frente a PBS a 4 ° C. Después, rNapA se analizó mediante SDS-PAGE y la concentración de proteína se determinó utilizando RC DC
ensayo de proteínas (Bio-Rad).
Experimentos de inmunización e infección comentario El diseño experimental se resume en la Figura 1. Cinco grupos de 10 ratones se inocularon por vía intranasal dos veces con 3 semanas de intervalo, cada vez con 17,5 l de inóculo. En los grupos 1, 2 y 3 el inóculo consistía en HBSS con 5 mg CT, que contiene 30 g rUreB, 30 g rNapA y 100 g HS5 lisado, respectivamente. Grupos 4 (grupo inmunizados de manera simulada) y 5 (grupo control negativo) se inocularon con HBSS. Tres semanas después de la segunda inmunización intranasal, se recogió sangre por sangrado de la cola de cinco animales por grupo y una semana más tarde, todos los animales, excepto el grupo control negativo, se inocularon por vía intragástrica con 200 caldo l Brucella a pH 5 que contiene 10 8 H. suis
bacterias viables [11]. El grupo de control negativo se inoculó por vía intragástrica con 200 l de caldo de Brucella en pH5. Cuatro semanas después de la inoculación intragástrica, los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical después de anestesia con isoflurano (ISOFLO; Abbott, IL, EE.UU.). A partir de los animales sacrificados, se recogió sangre por punción cardiaca estéril, se centrifugó (1000 g
, 4 ° C, 10 min) y el suero se congeló a -70 ° C hasta su uso posterior. Los estómagos fueron extirpados y se diseccionaron a lo largo de la curvatura mayor. La mitad de los estómagos, incluyendo antro y fundus, se colocó inmediatamente en 1 ml de ARN Más tarde (Ambion, Austin, TE, EE.UU.) y se almacenó a -70 ° C para su posterior ARN y ADN-extracción. Una tira longitudinal del tejido gástrico se cortó desde el esófago hasta el duodeno a lo largo de la curvatura mayor para el examen histopatológico. Figura 1 Diseño experimental del estudio de vacunación. Por grupo de 10 ratones se inmunizaron por vía intranasal dos veces con 3 semanas de intervalo, cada vez con 30 g rUreB + 5 g de toxina del cólera (CT); 30 g rNapA + 5 g de CT, y 100 g HS5 lisado + 5 g CT (grupos 1, 2 y 3, respectivamente). Grupos 4 (grupo inmunizados de manera simulada) y 5 (grupo control negativo) se inocularon por vía intranasal con HBSS. Tres semanas después de la segunda inmunización, se recogió sangre de 5 ratones por grupo y una semana más tarde los ratones de los grupos 1, 2, 3 y 4 se inocularon por vía intragástrica con 108 H. suis viable
bacterias. Grupo 5 se inoculó por vía intragástrica con HBSS. Cuatro semanas después de la estimulación intragástrica, se sacrificaron los ratones.
Cuantificación de H. suis
en el estómago
Después de la descongelación, los tejidos del estómago se homogeneizaron (MagNAlyser, Roche, Mannheim, Alemania) en 1 ml de Tri Reagent® RT (MRC, Brunschwig Chemie, Amsterdam, Países Bajos) y el ADN se extrajo de la fase inter e orgánico de acuerdo con las instrucciones del Tri Reagent® RT fabricante. La carga bacteriana en el estómago se determinó utilizando el anteriormente descrito H. suis
específica cuantitativa en tiempo real PCR (qPCR) [5].
Análisis de estómago respuesta de citoquinas
Los niveles de expresión de IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-17 y TNF-α se evaluaron mediante qPCR utilizando ADNc sintetizados a partir de tejido del estómago como se describe anteriormente [15]. Los valores de ciclo umbral (Ct) se normalizaron a la media geométrica de los valores Ct de los genes de referencia después de lo cual se normalizaron los niveles de mRNA se calcularon utilizando el 2 -ΔΔCt método [16].
La medición de las respuestas de anticuerpos séricos mediante el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) Francia El detector de proteínas ™ Kit ELISA (KPL, Gaithersburg, MD, EE.UU.) se utilizó para evaluar rUreB-, rNapA-, y HS5 lisado de IgG específica en el suero. En resumen, 96 placas de fondo plano (Nunc MaxiSorp, Nalge Nunc Int., Rochester, NY, EE.UU.) se recubrieron con 2 mg /pocillo de rNapA purificada, 1 mg /pocillo de rUreB purificada, o 1 mg /pocillo de H. suis
proteínas de células enteras se diluyeron en tampón de recubrimiento l 100 (24 h, 4 ° C). Después de bloquear con 1% de albúmina de suero bovino en PBS, se añadieron 100 l de suero diluido 1/400 a cada pocillo. Después de lavado adicional, 100 l de HRP-anti-ratón marcada se añadió IgG (H + L) en una concentración final de 50 ng por pocillo. Cinco minutos después de la adición de 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) (ABTS) solución de sustrato de peroxidasa, se leyó la absorbancia a 405 nm (OD 405 nm).
Histopatológico examen
las tiras de tejido gástrico longitudinales se fijaron en 4% tamponada con fosfato formaldehído, procesado mediante procedimientos estándar y embebidos en parafina. Para la evaluación de la gastritis, hematoxilina - eosina (HE) secciones teñidas de 5 micras fueron ciegamente puntuación de acuerdo con el grado de la infiltración de linfocitos, células plasmáticas y neutrófilos, mediante una escala analógica visual similar al Sistema de Actualización de Sydney (en una escala de 0- 3) [17] con las siguientes especificaciones para cada puntuación de la gastritis: 0 = sin infiltración de mononucleares y /o células polimorfonucleares; 1 = leve infiltración difusa de mononucleares y /o células polimorfonucleares; 2 = infiltración difusa moderada de mononucleares y /o células polimorfonucleares y /o la presencia de uno o dos agregados inflamatorias; 3 = marcados infiltración difusa de mononucleares y /o células polimorfonucleares y /o la presencia de al menos tres agregados inflamatorias.
El análisis estadístico
normalidad y homogeneidad de varianza de los datos se analizaron mediante el uso de D'Agostino-Pearson y Shapiro Wilk prueba de normalidad. Las diferencias significativas en H. suis
colonización y la expresión de citoquinas mRNA entre los grupos se evaluaron mediante la realización de una vía análisis ANOVA. Se utilizó la prueba de comparación múltiple de Bonferroni como post-hoc cuando se evaluaron varianzas iguales. Se utilizó la prueba post-hoc de T3 de Dunnett cuando no se evaluaron los varianzas iguales. OD 405 nm niveles de ELISA y puntuaciones de inflamación histológicos se compararon por análisis de Kruskall-Wallis, seguido de una U de Mann-Whitney
prueba. Para las correlaciones entre las distintas variables, se calculó el coeficiente rho de Spearman (ρ
). GraphPad Prism5 de software (GraphPad Software Inc, San Diego, CA, EE.UU.) se utilizó para todos los análisis. Estadísticamente se consideraron las diferencias significativas entre los grupos en p
< 0.05.
Resultados
Immunoproteomics de H. suis
H. suis
proteínas se separaron en 2D-PAGE (Figura 2a). Después de 2D-inmunotransferencia con sueros agrupados de lisado inmunizados (Figura 2b) o H. suis
animales infectados (Figura 2C), se seleccionaron un total de 19 puntos de proteínas inmunorreactivas. Estos puntos fueron comparados con las manchas de proteínas que se podían ver en el paralelo 2D-PAGE (Figura 2a). Se observó poca reactividad contra H. suis
proteínas en el suero después de la infección en comparación con la alta reactividad frente a sueros de ratones inmunizados lisado. Cuando la transferencia se sondeó con un conjunto de sueros obtenidos de ratones de control negativo, no hay manchas de proteínas inmunorreactivas se detectaron específicos (archivo1 adicional). Spots de interés (n
= 19) se cortaron del gel, se digirió y se identifican por medio de análisis de LC-MS /MS. Los resultados detallados de estas proteínas se resumen en la Tabla 1. Los puntos de mayor reactividad (punto 1 a 5) fueron identificados como UreB. H. suis
chaperonina GroEL, que se ilustra como puntos 9 y 10 en la Figura 2a, mostró también una fuerte hibridación con los sueros de los animales inmunizados de lisado. Además, los sueros de ratones lisado inmunizados mostraron una fuerte reactividad contra la proteína accesoria de ureasa (Ureh) y la ureasa de la subunidad A (urea) (puntos 15 a 19), que fue menos pronunciado en el grupo infectado. reactividad débil contra el principal FlaA flagelina (puntos 11 a 13) estuvo presente en los dos borrones. Figura 2 H. suis perfil 2D-proteoma (A) y Western blots de un duplicado 2D-gel reaccionaron con sueros agrupados de ratones de lisado inmunizados (B) o de H. suis ratones infectado con (C). 100 g de extracto de proteína total de H. suis
se separó por 2D-electroforesis utilizando pH 3 a 10 lineal gradiente en la primera dimensión y 10% TrisHCl SDS-PAGE en la segunda dimensión. Las proteínas separadas fueron detectados por SYPRO®Ruby tinción de proteínas. Las áreas enmarcadas indican dónde antígenos inmunorreactivos se escindieron del gel y se sometieron a LC-MS /MS. proteínas identificadas se indican con los números de punto dado en la Tabla 1. Las cajas y los números en rojo fueron identificados como UreB. La posición del peso molecular (PM) se da a la derecha, y el pH se da en la parte inferior.
Tabla 1 inmunorreactiva proteínas de H. suis identificados por no.1 LC-MS /MS
Spot

nombre de la proteína
NCBI ID2
génica
PI3
MW3
No. péptidos coincidentes
la mascota score4
Cov. (%) 5
1 | ureasa subunidad B Opiniones EFX42254
ureB
5,97
62.967
117
1589
72
2
ureasa subunidad B Opiniones EFX42254
ureB
5,97
62.967
80
1042
58
treonil-ARNt sintetasa
EFX41598
THRS
6,34
69.315 página 7
186
60 página 3
ureasa subunidad B Opiniones EFX42254
ureB

5,97
62.967
80
903
46
4 de ureasa subunidad B Opiniones EFX42254
ureB
5,97
62.967
4
103 página 6 página 5
ureasa subunidad B Opiniones EFX42254
ureB
5,97
62.967
4 de 103 página 6 página 6
30S proteína ribosomal S1
EFX42427
rpsA
8,29
64.051
23
625
28
quinona-reactiva Ni /hidrogenasa Fe, subunidad grande
EFX41851
hydB
8,22
64.943
19
520
28
ureasa de H. heilmannii
AAA65722
8,86
25.844 página 8
258
26 página 7
proteína quimiotaxis metil-aceptar
EFX43528
7.1
48.907
35
905
50 página 8
factor de elongación G
EFX41637
Fusa
5.15
77.242
57
1066
55
9
Chaperonina GroEL
EFX42237
groEL
5,58
58.498
150
3085
78
10
Chaperonina GroEL
EFX42237
groEL
5,58
58.498
135
2647
73
ureasa subunidad B Opiniones EFX42254
ureB
5,97
62.967
43
682
41 página 11
flagelina A
EFX41982
flaA
7,77
54.232
29
756
47 página 12
flagelina A
EFX41982
flaA
7,77
54.232
57
1294
62 página 13
La flagelina A
EFX41982
flaA
7,77
54.232
46
1085
63
factor desencadenante
EFX42378
TIG

5.13
49.587 página 12
343
24 página 14
Hydrogenase expresión /proteína formación
EFX41790
HYPB
5,59
27.617
15
314
35
Nicotinate-nucleótido pirofosforilasa
EFX42191
NADC
6,46
30.591 página 11
219
25 página 7-alfa-hidroxiesteroide deshidrogenasa
EFX41880
6,62
28.246 página 6
186
24
Conservado hipotética proteína secretada
EFX42511
HDHA
5,84
28.011 página 5
174 página 19
proteína hipotética HSUHS5_0308
EFX42276
5,47
29.471 página 9
171
24
peroxiredoxina
EFX42277
5,84
25.811 página 7
107 página 19
15
ureasa proteína accesoria
EFX42255
Ureh
6,79
30.447
4 de 106 página 13
16
ureasa subunidad A
EFX42255
Urea
7,79
27.389
24
270
55
17
ureasa subunidad A
EFX42255
Urea
7,79
27.389
28
112
45
18
ureasa subunidad A
EFX42255
Urea
7,79
27.389
57
418
69 página 19
La ureasa subunidad a
EFX42255
Urea
7,79
27.389
75
568
73
1 mancha de proteína correspondiente a la posición en gel y borrones ( véase la Figura 2)
2NCBI
:.. Centro Nacional de Información sobre Biotecnología página 3 teórica punto isoeléctrico (pI) y el peso molecular (PM) página 4 por Helicobacter
datos, puntuaciones mayores de la mascota. de 40 son significativas (p
≤ 0,05).
5% de la secuencia de la proteína cubierta por los péptidos identificados.
Confirmación de la reactividad de suero contra rUreB
Desde el 2D-análisis, UreB mostró reactividad distinta con sueros de ratones lisado inmunizados, que no se observó en los sueros de ratones no inmunizados pero infectados. Con el fin de confirmar estos datos, se realizó un 1D-PAGE cargado con rUreB, seguido de inmunodetección con sueros de ratones infectados suis
lisado inmunizados y H.. 0.01. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

• Caracterización de la expresión génica perfiles para diferentes tipos de mastocitos agrupados de subregiones de estómago de ratón por un método de amplificación de ARN
• características clínico-patológicos y análisis de pronóstico de la clasificación de Lauren en el adenocarcinoma gástrico en China