gástrico modula la distribución del ciclo celular y la migración celular a través de la regulación de sonic hedgehog, PI
3K MAPK y las vías de señalización en cáncer gástrico
Abstract
Antecedentes
ZIC1, un factor de transcripción vital con dominios de dedo de zinc, se ha implicado en el proceso de desarrollo neural. Anteriormente puso de manifiesto que ZIC1 puede funcionar como un supresor tumoral en el cáncer gastrointestinal. Sin embargo, aún se desconoce la participación ZIC1 mecanismo molecular subyacente en la progresión tumoral.
Métodos Francia El papel de ZIC1 sobre la proliferación celular y la migración se examinó. Los resultados se evaluaron la regulación de Sonic hedgehog (Shh), fosfoinosítido 3-quinasa (PI 3K) y la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) vías después de la expresión ectópica de ZIC1 en células de cáncer gástrico señalización.
la sobreexpresión de ZIC1 contribuye a la inhibición de la migración proliferación celular y la distribución del ciclo celular en el cáncer gástrico. La modulación de G1 /S de control por ZIC1 está mediada principalmente a través de la regulación de las quinasas dependientes de ciclina (p21 Waf1 /Cip1, p27 Kip1 y ciclina D1). Además, ZIC1 puede inactivar el nivel de phospholated Akt y Erk1 /2, y transcriptionally regular sonic hedgehog (Shh) de señalización, lo que conduce a regular la expresión de p21 Waf1 /Cip1 y ciclina D1. Por último, hemos identificado sistémicamente Zic1 objetivos de abajo por el análisis de microarrays de ADNc y reveló que 132 genes están regulados hacia abajo y 66 genes están regulados hasta después de la transfección con ZIC1 en células de cáncer gástrico. Estos genes candidatos desempeñan papeles críticos en la proliferación celular, el ciclo celular y la motilidad celular.
Conclusiones
sobreexpresión de Zic1 resultados en la inactivación de Shh, PI 3K y MAPK vías de señalización, así como la regulación de múltiples objetivos de abajo que son esenciales para el desarrollo y progresión de cáncer gástrico. ZIC1 sirve como una posible diana terapéutica para el cáncer gástrico.
Palabras clave
ZIC1 de Sonic hedgehog ciclo de la célula del tumor supresor de fondo
ZIC1, uno de los cinco genes de la familia ZIC, está involucrado en una variedad de procesos de desarrollo, incluyendo la neurogénesis y miogénesis [1, 2]. Recientemente, se ha documentado ZIC1 para participar en la progresión de los tumores humanos, incluyendo meduloblastoma, cáncer de endometrio, neoplasias mesenquimales y cánceres liposarcoma [3-6]. Hemos demostrado previamente que el gen ZIC1 es downregulated significativamente en los tejidos de cáncer gástrico y líneas celulares en comparación con la de los tejidos gástricos normales. Además, ZIC1 sirve potencialmente como un supresor de tumores mediante la inhibición de la proliferación celular en células de cáncer gástrico y de colon [7, 8]. Como un importante factor de transcripción, ZIC1 es esencial para la regulación de la señalización de Hedgehog (Hh), proteína morfogenética ósea (BMP), y Notch vías de señalización en el desarrollo neural [2, 9]. Sin embargo, poco se sabe acerca de cómo ZIC1 regula las vías de señalización y sus objetivos de abajo relacionados en la progresión del cáncer.
El cáncer gástrico es la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo [10, 11]. señalización Hh es una de las vías de señalización oncogénicas clave implicados en la carcinogénesis gástrica [12, 13]. Sonic hedgehog (Shh), un miembro de la familia Hh de mamífero [14], se ha demostrado que tanto upregulated en tejidos de cáncer gástrico por en ensayo de hibridación in situ y esencial para la progresión del cáncer gástrico [13, 15]. vía de señalización Hh es activado por Shh de unión con el Patched (Ptch) - Smoothened (Smo) membrana de receptor complejo [16]. La activación de Shh promueve la diferenciación de células de cáncer gástrico y la proliferación. Se ha informado de que ZIC1 podría reducir la expresión de PTCH1
y Shh
genes en el tejido neural durante el desarrollo del cerebro anterior [17]. En contraste, la evidencia ha mostrado que la Shh reprime la expresión de ZIC1 durante el desarrollo del tubo neural [18]. Sin embargo, la influencia de ZIC1 en la vía de señalización Hh en el cáncer gástrico sigue siendo desconocido.
ZIC1 también regula numerosos objetivos, incluyendo la ciclina D1, p27, Wnt1 y Wnt7a durante el desarrollo neural en explantes ectodérmicas de Xenopus y modelos de ratones mutantes [9, 19, 20]. Estamos particularmente interesados en los reguladores del ciclo celular importantes para la proliferación de células cancerosas y la diferenciación. Hemos demostrado anteriormente que la sobreexpresión de ZIC1 puede alterar transición G1 /S en células de cáncer gástrico [8]. Varios mecanismos de quinasas dependientes de ciclinas (CDK) están involucrados en la regulación de G1 /S de control en los cánceres humanos [21]. Durante la transición de G1 a la fase S, la ciclina D que forma complejos activos con CDK4 es hasta reguladas en el cáncer gástrico [22, 23]. La pérdida de inhibidores de quinasas dependientes de ciclinas tales como p21 Waf1 /Cip1 y p27 1 Kip promover la actividad CDK2 y regular la transición G1 /S [12, 24]. Estudios recientes han demostrado que la mutante ZIC1 o fuerza sobreexpresión de ZIC1 regula la expresión de p27 Kip 1 en ratones tejidos de cerebelo y células de liposarcoma [3, 20]. Curiosamente, la vía de señalización Shh regula negativamente p21 Waf1 /Cip1 y ciclina D1 en una manera dependiente de GLI1 [16, 25]. Sin embargo, si ZIC1 puede Interacción con la vía de Shh en la regulación de la distribución del ciclo celular no se ha definido. La elucidación de esta red de señalización puede proporcionar más información sobre el papel de ZIC1 en el cáncer gástrico.
En nuestro estudio, hemos demostrado que la sobreexpresión de ZIC1 suprime la migración celular y la invasión de cáncer gástrico, así como altera la distribución del ciclo celular. ZIC1 puede regular a la baja transcripcionalmente la señalización de Shh y suprimir el nivel de phospholated Akt y Erk, por lo tanto conduce a la regulación del regulador del ciclo celular quinasas p21 Waf1 /Cip1, p27 Kip1 y ciclina D1 en células de cáncer gástrico. También se identificaron varios objetivos de abajo Zic1 importante en células de cáncer gástrico mediante el análisis de microarrays de ADNc.
: Resultados de la ZIC1 inhibe la proliferación, la migración y la invasión de células de cáncer gástrico
Para determinar el efecto de ZIC1 sobre la proliferación celular, se realizó análisis de la viabilidad celular mediante ensayos de MTS en células de cáncer gástrico. líneas celulares de cáncer gástrico (AGS, MKN28, BGC823 y SGC7901) fueron transfectadas con pcDNA3.1-ZIC1 o pCDNA3.1 vector vacío. La eficiencia de la transfección fue confirmada por RT-PCR y Western blot, respectivamente (Figura 1A). Los resultados mostraron que el número de células viables se suprimió significativamente por la expresión ectópica de ZIC1 en una observación de 5 días en BGC823 células (Figura 1B). La supresión de la proliferación celular por ZIC1 fue consistente con nuestras observaciones anteriores en AGS y células de cáncer gástrico MKN28, así como las células de cáncer de colon [7, 8]. Figura 1 ZIC1 suprime la proliferación celular y la migración en el cáncer gástrico. (A) Las líneas celulares de cáncer gástrico (AGS, MKN28, BGC823 y SGC7901) fueron transfectadas establemente con pcDNA3.1-ZIC1 o pCDNA3.1 vector vacío. Los niveles de expresión de ZIC1 ARNm y proteínas se llevaron a cabo por RT-PCR (diagrama superior) y Western blot (bajo el diagrama). GAPDH y β-actina se utilizaron como controles internos. (B) La viabilidad de las células de la línea celular de cáncer gástrico (BGC823) se determinó por ensayo de proliferación celular MTS. El asterisco indica la significación estadística (** p < 0. 01). (C) la migración celular se evaluó mediante modificado Boyden transwell ensayos de cámaras después de incubación durante 16 h. Las células que migraron a la parte inferior de la membrana se tiñeron con DAPI. (D) El número de células migratorias visibles (media ± S.D.) se estimó contando cinco campos de alta potencia al azar (magnificación × 400). Estos experimentos se realizaron por triplicado. Se muestran los datos representativos. El asterisco indica la significación estadística (*** p < 0,001).
Además, se determinó el papel de ZIC1 en la migración celular y la invasión en el cáncer gástrico. ensayos de migración celular y la invasión se realizaron en Transwell migración y sistemas de ensayo de invasión de Matrigel recubiertos, respectivamente. Hemos observado que la re-expresión de ZIC1 suprimió significativamente la migración de células en AGS, BGC823 y SGC7901 líneas celulares de cáncer gástrico (p < 0,001) (Figura 1C, D). Además, re-expresión de ZIC1 muestra una actividad significativamente menor de invasión celular en comparación con los transfectantes vacías de vectores en células AGS (P < 0,05) (archivo adicional 1: Figura S1). Estos datos sugieren que la expresión ectópica de ZIC1 suprime la migración de células de cáncer gástrico y la invasión.
ZIC1 altera las distribuciones del ciclo celular y regula la expresión de las quinasas dependientes de ciclina en células de cáncer gástrico
Para comprender mejor los mecanismos subyacentes a la inhibición de la la proliferación celular por la sobreexpresión de ZIC1, se evaluaron las distribuciones del ciclo celular en células de cáncer gástrico. Se observó una mayor proporción de células en la fase G1 en AGS (42,74%) y SGC7901 (54,03%) líneas celulares después de la sobreexpresión de ZIC1. Sin embargo, en las células transfectadas con un vector de control, la proporción se redujo tanto en AGS (32,66%) y SGC7901 (47,00%) y la proporción de células en fase S fue relativamente aumentado (Figura 2A). Es bien aceptado que la p21 (también conocido como p21 Waf1 /Cip1) y p27 (también conocido como p27 KIP1), dos principales inhibidores de quinasa dependientes de ciclina, se requieren para el abandono durante la entrada a la fase S [26]. La activación de la ciclina D1, sin embargo, es principalmente responsable de la regulación de la transición de fase G1-S [23]. Hemos demostrado que el nivel de expresión de la proteína ciclina D1 se redujo, mientras que p21 y p27 se indujeron notablemente en células de cáncer gástrico transfectadas con pCDNA3.1-ZIC1 en comparación con los transfectantes pCDNA3.1 vector vacío (Figura 2B). También se evaluó la distribución de la apoptosis celular en pcDNA3.1-ZIC1 o transfectantes vector pcDNA3.1 en células AGS y MKN28, pero no se observaron diferencias obvias de la apoptosis de las células (archivo adicional 2: Figura S2). Por lo tanto, estos resultados apoyan que la sobreexpresión de ZIC1 altera las distribuciones del ciclo celular mediante la regulación de quinasas dependientes de ciclina p21, p27, así como ciclina D1 en células de cáncer gástrico. Figura 2 ZIC1 altera la distribución del ciclo celular mediante la regulación de p21, p27 y ciclina D1 en células de cáncer gástrico. (A) las distribuciones del ciclo celular se detectaron mediante análisis de citometría de flujo en AGS y SGC7901 células después de la transfección transitoria con pCDNA3.1-ZIC1 o pCDNA3.1 vector vacío por 24 h. (B) Los niveles de expresión de p21, p27 y ciclina D1 se determinó por transferencia de Western. β-actina se detectó como control de carga. valores de densitometría se expresan como factor de cambio en comparación con los valores de control de vector pcDNA3.1 normalizado a 1. (C) Los niveles de expresión de phospholated Akt y Erk1 /2, así como Akt total y Erk1 /2 se examinaron por transferencia Western.
MAPK y PI 3K vías juegan un papel vital en la regulación de quinasas del ciclo celular. Se evaluó la expresión de los principales efectores aguas abajo de estas dos vías, Erk1 /2 y Akt, después de la introducción de manera estable pCDNA3.1-ZIC1 a AGS, MKN28, BGC823 y SGC7901 células de cáncer gástrico (Figura 1A). Se encontró que los niveles de fosforilación de Erk1 /2 y Akt se suprimieron dramáticamente por la sobreexpresión de ZIC1 en todas las líneas celulares anteriormente ensayadas (Figura 2C). Estos resultados sugieren que la regulación de la distribución de células-cylce por ZIC1 puede ser mediada a través de PI 3K y las vías de MAPK y su corriente abajo quinasas dependientes de ciclina p21, p27 y ciclina D1 en el cáncer gástrico.
ZIC1 suprime la expresión de sonic hedgehog (Shh) en células de cáncer gástrico
caracterización molecular ha demostrado que ZIC1
tiene dominios de dedos de zinc y podría contrarrestar con GLI1 mediante la unión a secuencias ricas en GC [2]. GLI1 es un objetivo corriente abajo de hedgehog (hh) vía de señalización que es esencial para el desarrollo del cáncer gástrico y la progresión [9, 27]. La hipótesis de que la vía de señalización Hh puede estar implicada en la regulación de ZIC1 del ciclo celular cáncer gástrico y la migración celular. Para abordar esta cuestión, hemos examinado la expresión de Sonic hedgehog (Shh), un miembro clave de la familia Hh, en células de cáncer gástrico después de la sobreexpresión de ZIC1. Se encontró que el re-expresión de ZIC1 reduce eficazmente la expresión de Shh en BGC823 y SGC7901 líneas celulares mediante análisis de transferencia Western (Figura 3A). Además, el análisis de RT-PCR demostró que el nivel de transcripción de Shh también es downregulated significativamente en células de cáncer gástrico transfectadas con ZIC1 con relación a los transfectantes vector vacío (p < 0,01) (Figura 3B) (archivo adicional 3: la figura S3). . En conjunto, nuestros resultados sugieren que ZIC1 puede regular transcripcionalmente la expresión de Shh en células de cáncer gástrico. Figura 3 ZIC1 inhibe la expresión de Sonic hedgehog (Shh). (A) La expresión de la proteína Shh fue analizada por Western blot en BGC823 y SGC7901 células establemente transfectadas con pcDNA3.1-ZIC1 o pCDNA3.1 vector vacío. (B) El nivel de expresión de ARNm de Shh se determinó mediante análisis cuantitativo de RT-PCR en tiempo real. El nivel relativo de expresión se expresó como cambio veces (media ± SEM) en comparación con pCDNA3.1 vector vacío normalizado a 1.
Hedgehog (Hh) vía de señalización está implicada en la regulación ZIC1 de ciclo celular y la migración celular en el cáncer gástrico
células para determinar el efecto de Shh en las distribuciones del ciclo celular, hemos tratado de examinar los efectos del inhibidor farmacológico de la señalización Hh en la expresión de p21 y ciclina D1. AGS, BGC823 y SGC7901 líneas celulares de cáncer gástrico fueron tratados con ciclopamina (10 mM), un alcaloide esteroideo que interactúa directamente con Smo para inhibir la señalización de Hh [28], o el control de DMSO durante 24 h. Hemos observado que el nivel de expresión de p21 fue notablemente hasta reguladas, mientras que la ciclina D1 regulada hacia abajo después de las células tumorales se trataron con ciclopamina (Figura 4A). De nota, el bloqueo de la vía de señalización de Shh mediante la administración de ciclopamina no afecta a los niveles de expresión de mRNA en ZIC1 BGC823 y SGC7901 células por ensayos de RT-PCR (Figura 4B). La expresión ausente o bajo de ZIC1 mRNA en células de cáncer gástrico se meditaba principalmente por el promotor de la metilación del ADN como hemos descrito previamente [8]. Figura 4 vía de señalización Hh está implicado en la expresión de p21, ciclina D1 y la regulación de la migración celular. AGS, BGC823 y SGC7901 células de cáncer gástrico fueron tratados con ciclopamina (10 mM), un alcaloide esteroideo que interactúa directamente con Smo para inhibir la señalización de Hh, o el control de DMSO durante 24 h. (A) Los niveles de expresión de p21 y ciclina D1 se determinó por transferencia de western en AGS, BGC823 y SGC7901 células. (B) El nivel de expresión de ARNm ZIC1 se examinó mediante RT-PCR convencional. (C) la migración celular se evaluó mediante modificado Boyden transwell ensayos de cámaras. Las células que migraron a la parte inferior de la membrana se tiñeron con DAPI. (D) El número medio de células migratorias visibles (media ± S.D.) se calculó en cinco campos de alta potencia al azar (× 400). El asterisco indica significación estadística (*** p < 0,001).
También se evaluaron los efectos de la señalización de Shh sobre la migración de células de cáncer gástrico. Como se muestra en la Figura 4 SGC7901 líneas celulares de cáncer gástrico C y D, AGS, BGC823 y mostró disminución significativa en la migración celular después de la administración con ciclopamina (10 M) durante 24 h (p < 0,01). En conjunto, estos resultados demuestran que ZICI puede modular los reguladores del ciclo celular y la migración celular a través de la señalización de Shh en células de cáncer gástrico.
Perfil de expresión génica cambios por la expresión ectópica de ZIC1
Para determinar sistemáticamente objetivos de abajo ZIC1, se realizó un oligonucleótido de microarrays Affymatrix en MKN28 células de cáncer gástrico con o sin pCDNA3.1-ZIC1. Utilizando un punto de corte de > 1,5 veces para la significación estadística, un microarray reveló que 132 genes están regulados hacia abajo, mientras que 66 genes están regulados por la expresión exógena de ZIC1 (representante genes se muestra en la Figura 5A). Muchos de los genes se ha informado que desempeñan papeles críticos en la proliferación celular, el ciclo celular y la migración de células de acuerdo con el análisis funcional de genes (http:.. //Www GeneCards org) (Figura 5B). Por ejemplo, dos reguladores del ciclo celular clave TP53INPI
y CDKN2B
se encuentran para ser desregulado en las células transfectadas con MKN28 pCDNA3.1-ZIC1. Nuestros resultados indican que ZIC1 regula potencialmente múltiples genes aguas abajo implicadas en la tumorigénesis gástrico. Figura 5 Gene cambios en el perfil de expresión después de la expresión ectópica de ZIC1. (A) Los perfiles de expresión de genes en pCDNA3.1-ZIC1 o vector pcDNA3.1 transfectantes estables vacíos se analizaron por cDNA microarray en MKN28 células. genes representativos se ilustran en el lado derecho de la imagen mapa de calor utilizando un punto de corte > 1,5 o < -1,5 Veces como una diferencia significativa ,. (B) los genes implicados en el ciclo celular, la proliferación celular y la migración de células de acuerdo con el análisis funcional de genes (http:.. //Www GeneCards org) se presentan. veces el cambio relativo se expresó con relación de pcDNA3.1-ZIC1 versus control pCDNA3.1. (C) la comprensión sistémica de vías para ZIC1 regulación de la señalización y los genes diana en el desarrollo y progresión del cáncer gástrico.
Discusión
La creciente evidencia ha demostrado que ZIC1 está implicado en la progresión de varios tumores [3-8] . Parece que ZIC1 se expresa de forma aberrante en ciertos tipos de cáncer y funciones diferencialmente como un supresor de tumor o un gen oncogénico. Por ejemplo, se informó de la expresión ZIC1 a ser baja o ausente en líneas de células gastrointestinales y cáncer de pulmón, y se encontró que para suprimir la proliferación de células de cáncer gastrointestinal [7, 8, 29]. En contraste, se encontró que la sobreexpresión de ZIC1 en liposarcoma para promover la proliferación celular y la invasión [3]. Nosotros y otros han demostrado que las modulaciones epigenéticos incluyendo la metilación del ADN y la remodelación de la histona, y las mutaciones genéticas pueden contribuir a sus patrones de expresión diferencial en cáncer [3, 4, 7, 8]. Se está convirtiendo en claro que como un factor de transcripción de dedo de zinc, ZIC1 puede modular múltiples genes aguas abajo en el tejido neural, cáncer colorrectal y liposarcoma células [2, 3, 7, 9]. Sin embargo, poco se sabe acerca de la función ZIC1 mecanismo subyacente en el desarrollo y progresión del cáncer gástrico. Subrayando las principales vías y objetivos de abajo regulados por ZIC1 puede facilitar nuestra comprensión de su papel en la tumorigénesis. Aquí, hemos demostrado que la sobreexpresión de Zic1 como resultado la inhibición significativa de la supervivencia celular y el deterioro de la migración celular. ZIC1 suprime las vías de señalización de Shh, PI3K y MAPK que son críticos para la regulación de la distribución del ciclo celular y la migración celular en el cáncer gástrico. Por otra parte, ZIC1 inhibe quinasas del ciclo celular reguladoras, p21, p27 y ciclina D1, lo que conduce a G1 /S de tránsito del ciclo celular en células de cáncer gástrico. ZIC1 suprime la vía de señalización de Shh que es fundamental para la regulación de la distribución del ciclo celular y la migración celular en el cáncer gástrico.
MAPK y PI 3K vías desempeñan papeles críticos en la proliferación celular, la diferenciación, y la progresión en una variedad de cánceres humanos [30]. Recientemente, también se informó de que la activación de ambas vías son esenciales para inducir la entrada del ciclo celular [30, 31]. Durante este proceso, la ciclina dependiente de los inhibidores de quinasa p21, p27 y ciclina D /E participan en la regulación de p53 inducida por la detención del ciclo celular [24, 32]. La activación de MAPK y su aguas abajo quinasa-Erk no sólo podría conducir a la inducción de la ciclina D1 y pasar a través de G1 /S de control, sino también la acumulación de p21 que inhibe complejos de ciclina E /CDK2 para bloquear la entrada en fase S [30] . PI vía 3K /Akt podría inactivar los factores de GSK3-beta y transcripción FOXO, por tanto, inhibe la ciclina D1, mientras que inducen p27 y p21 en la regulación de la entrada del ciclo celular [31]. Hemos demostrado que la re-expresión de ZIC1 desactivan efectivamente la Akt fosforilada y Erk1 /2 en AGS, MKN28, BGC823 y SGC7901 líneas celulares de cáncer gástrico. En este sentido, el p21 inhibidor de CDK1 fue activado, mientras que la ciclina D1 inactiva, después de la sobreexpresión de ZIC1 en las células de cáncer gástrico. Aunque los resultados deben ser validados en estudios futuros, nuestros datos miroarray han revelado que otros componentes clave de los reguladores del ciclo celular quinasa incluyendo TP53INPI Opiniones y CDKN2B
, están desreguladas con la expresión forzada de ZIC1 en un MKN28 celular de cáncer gástrico individuo línea (Figura 5 A y B). Por lo tanto, proponemos que regula ZIC1 G1 /S de tránsito principalmente a través de PI 3K MAPK y las vías y quinasas regulador del ciclo celular aguas abajo en células de cáncer gástrico.
Otro hallazgo importante en nuestro presente estudio es que ZIC1 regula transcripcionalmente Sonic hedgehog (Shh) de señalización en células de cáncer gástrico. Aparte de su papel central en la regulación de la morfogénesis de la glándula gástrica en el estómago humano, la señalización de Shh también está implicada en la patogénesis del cáncer gástrico [16, 33]. Shh es frecuentemente activa en adenocarcinomas gástricos avanzada y se asocia con comportamiento agresivo tumor [13, 15, 33]. Estudios anteriores han demostrado que la señalización de Shh promueve la motilidad e invasividad de las células de cáncer gástrico a través de TGF-β-ALK5-Smad3 vía [34]. Shh señalización también podría regular la expresión de p21 y ciclina D1 en una vía dependiente de Gli [16, 25]. Hemos observado que la inhibición de la señalización de Shh mediante la administración con ciclopamina suprime AGS, BGC823 y SGC7901 migración celular de cáncer gástrico, y regula la expresión de p21 y ciclina D1 (Figura 4). Estos resultados son consistentes con estudios se informó anteriormente [25, 34]. Por lo tanto, hemos puesto de manifiesto que ZIC1 juega un papel importante en la progresión del cáncer gástrico mediante la regulación de la vía de señalización de Shh.
ZIC1 puede regular los genes diana en ambas maneras secuencia-específicos e independientes [9]. ZIC1 podría regular la expresión transcripcional de objetivos, incluyendo ciclina D1, p27, Wnt1 y Wnt7a, y modular Notch y BMP vías de desarrollo neuronal [2, 9]. ZIC1 podría contrarrestar GLI mediante la unión a secuencias ricas en GC, y suprimir la expresión de la secuencia dirigida genes informadores de unión de GLI-[9, 35]. Se identificaron varios genes diana potencial ZIC en células de cáncer gástrico mediante el análisis de microarrays. Estos objetivos están estrechamente relacionados con el ciclo celular, la proliferación celular y la migración (Figura 5B). La asociación entre la ZIC y las dianas moleculares podría ser una pista para entender la perspectiva potencial de las proteínas ZIC en la progresión del cáncer gástrico.
Conclusiones
Resumiendo, se propone un modelo que representa los caminos por los cuales ZIC1 contribuye al cáncer gástrico progresión (Figura 5C). La sobreexpresión de resultados Zic1 en la supresión Hedgehog (Hh) de señalización y de los objetivos que incluyen p21, p27 y ciclina D1. Como factor de dedo de cinc de la transcripción, ZIC1 también modula potencialmente la expresión transcripcional de los genes diana uniéndose directamente a secuencias ricas en GC [2], por lo que funciona como un supresor de tumores por inhibición de la proliferación celular, la migración celular y la invasión en el cáncer gástrico.
Métodos cultivo de células y
tratamiento
Las líneas celulares de cáncer gástrico humano (AGS, MKN28, BGC823 y SGC7901) se obtuvieron a partir de Riken gene Bank (Japón) y American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU. ). Todas las líneas celulares se cultivaron en medio RPMI 1640 (Invitrogen, CA, EE.UU.) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y se incubaron a 5% de CO 2, 37 ° C y humedad 95%. líneas celulares de cáncer gástrico (AGS, BGC823, y SGC7901) fueron tratados con 10 mM de ciclopamina (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.) en DMSO durante 24 horas. Una concentración equivalente de vehículo (DMSO) se utilizó como control.
Cell transfección
AGS, MKN28, BGC823 y SGC7901 células se cultivaron durante 24 h en una placa de 6 pocillos y se transfectaron con pCDNA 3.1-ZIC1 o pCDNA 3.1 vector vacío usando Fugene HD (Roche) según las instrucciones del fabricante. Después de 48 h, los transfectantes se seleccionaron de forma continua en medio RPMI 1640 que contiene G418 (200 a 400 mg /ml) (Merck, Alemania) durante 14 días.
RT-PCR y análisis en tiempo real PCR cuantitativa
ARN total ( 1 g) se extrajo usando el reactivo Trizol (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante y se transcribió inversamente en ADNc con M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit (Takara, Japón). Los niveles de transcripción de ZIC1 y Shh se determinaron por RT-PCR convencional con Takara Taq polimerasa (Takara, Japón) o PCR cuantitativa (QRT-PCR) en tiempo real con el kit de mezcla SYBR Green Master (Takara, Japón) en un ABI 7500 sistema de PCR. Los cebadores utilizados para ZIC1 eran F: 5'-AAACTGGTTAACCACATCCGC y R: 5'-CTCAAACTCGCACTTGAAGG. Shh eran F: 5'-GTAAGGACAAGTTGAACGCTTTG y R: 5'-GATATGTGCCTTGGACTCGTAGTA. Gliceraldehído-3-; deshidrogenasa phosohate (GAPDH) se utilizó como control interno. Los niveles de transcripción se expresan como 2 -ΔΔCt valores y variación relativa de la expresión pliegue se normalizaron a GAPDH. Ensayo de viabilidad celular
La viabilidad celular se detectó con un ensayo de proliferación celular no radiactivo con 3- (4,5- dimetiltiazol-2-il -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenilo) -2 H-tetrazolio (MTS) reactivos (Promega, Madison, EE.UU.)). células transfectadas estables se colocaron en placas en 96 pocillos (2000 células /pocillo) durante 6 h, 24 h, 72 h y 120 h. La absorbancia se midió a 490 nm después de 1 h de incubación con CellTiter 96 Aqueous One Solution reactivo.
Ciclo celular y análisis de apoptosis de las células
distribuciones del ciclo celular se detectaron mediante citometría de flujo análisis. Las células transfectadas con pCDNA3.1-ZIC1 o pCDNA3.1 vector vacío se cosecharon y se lavaron con PBS. El ADN celular se tiñó con solución de tinción del ciclo celular que contiene yoduro de propidio (PI) a 4 ° C en la oscuridad. del ciclo celular se determinó utilizando un FACS Calibur y se analizaron con el software ModFitLT (Phoenix, EE.UU.). apoptosis
celular se realizó utilizando FITC Anexina V Apoptosis Detección Kit II (BD Pharmingen) por citometría de flujo análisis. Las células transfectadas transitoriamente se suspendieron en Anexina V tampón de unión. A continuación, se añadieron soluciones FITC anexina V y PI en secuencia. Después de la incubación durante 15 minutos, las células teñidas fueron analizadas por citometría de flujo FACScan flujo (Becton Dickinson, EE.UU.). Los ensayos de migración celular y la invasión
migración celular se evaluó mediante el ensayo de Boyden modificada transwell cámaras (extracción de testigos, EE.UU.). Brevemente, las células fueron cultivadas en medio libre de suero durante 24 h y 5 × 10 4 Las células se sembraron a la cámara superior en 300 l de medio que contiene 5% de FBS. Después de 16 h de incubación, las células no migratorias en la cámara superior se retiraron cuidadosamente con un hisopo de algodón. Las células migraron fueron teñidas con DAPI solución de tinción. El número de células se contaron al azar en cinco campos (× 400 aumentos).
Invasión celular se realizó en un Millipore de 24 pocillos recubierta con Matrigel BD. Después de inanición en medio libre de suero durante 24 h, 1 × 10 5 células se sembraron a la cámara superior en 300 l de medio que contenía FBS al 5%, mientras que la cámara inferior se llenó con 600 l de medio de cultivo con 15% FBS. Después de haber sido incubadas durante 30 h, las membranas se incubaron con las manchas de la célula de la solución (Millorpore, EE.UU.). La mezcla de colorantes se lavó por Extraction Buffer y se transfirió a un pozo 96 para la medición colorimétrica a 560 nm.
Análisis de transferencia de Western
proteínas totales se extrajeron a partir de células utilizando la radio-inmunoprecipitación tampón de lisis de ensayo suplementado con inhibidor de proteasa. Los lisados se resolvieron en 6-12% minigeles SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore, Bedford, MA). Las membranas se bloquearon en 5% de leche con TBST y se incubaron en 4 ° C durante la noche con anticuerpos siguientes: ZIC1 (1: 500; Abcam), fosfo-Akt (1: 1000; Cell Signaling), Akt (1: 500; Abcam), fosfato ERK1 /2 (1: 1000; Cell Signaling), Erk1 /2 (1: 1000; Cell Signaling), p21 Waf1 /Cip1 (1: 1000; Cell Signaling), p27 Kip1 (1: 500; Epitomics), ciclina D1 (1: 1000; Cell Signaling) y Shh (1: 1000; Cell Signaling). De acuerdo con ello, los anticuerpos secundarios acoplados a peroxidasa de rábano picante (HRP) se visualizaron usando una quimioluminiscencia con Las-4000 Imaging System (Fujifilm, Japón). Las densidades relativas de proteínas se cuantificó con el software Image J. y normalizado a ß-actina. (1: 2500, Multisciences Biotech)
cDNA microarray análisis
ARN total fue aislado de las células MKN28 que transfectadas establemente con pCDNA3.1 -ZIC1 o pCDNA3.1 vector vacío, y se transcribe a invertir cDNA. Las muestras marcadas se hibridan con todo Agilent genoma humano contiene más de 41.000 sondas (http:.....? //www NCBI NLM NIH gov /geo /consulta /cgi acc acc = GSE38924). Los datos de microarrays se analizaron utilizando el software de extracción de características de Agilent. Hemos seleccionado un factor de cambio ≥1.5 o ≤ -1.5 como una diferencia significativa se realizó.
El análisis estadístico
t
de Student para comparar los datos de dos independientes, mientras que se utilizó Chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher para analizar las variables categóricas. Un corte de p < 0,05 se aplicó para la significación estadística.
Notas
Jing Zhong, Shujie Chen contribuyeron igualmente a este trabajo.
Declaraciones
Reconocimiento comentario El proyecto fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (30900676, 81071961), Programa de Investigación básica Nacional de China (973 programas) (2012CB945004) y Ciencia y Tecnología de los proyectos clave de la provincia de Zhejiang en China (2009 C03012-3). Los autores agradecen al Prof. Tianhua Zhou y el Prof. Guo Lei útil para sugerencias y discusión;
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