PLoS ONE: SIRT3 Parantaa Glykolyysi ja proliferaation SIRT3 ilmentävien mahasyövän Cells

tiivistelmä

SIRT3 on keskeinen NAD ^{+ - riippuvainen proteiini deasetylaasin mitokondrioissa nisäkässolujen, toimiva estää solujen vanhenemista ja transformaatio säätelemällä mitokondrioiden metabolisen homeostaasin. Kuitenkin SIRT3 on myös todettu ilmaista joissakin ihmisen kasvaimissa; sen rooli näissä SIRT3-ilmentäviä tuumorisoluja on selvitetty. Tämä tutkimus osoitti, että ilmentyminen SIRT3 nostettiin ryhmässä mahalaukun syövän solujen verrattuna normaaliin mahalaukun epiteelisolujen. Vaikka SIRT3 ilmentymistasot lisääntynyt mahakasvaimen kudoksiin verrattuna viereiseen ei-kasvainkudoksessa SIRT3 positiiviset syöpäsolut olivat useammin havaita suoliston tyyppi syöpien kuin hajanainen tyyppi syöpien, mikä osoittaa, että SIRT3 liittyy alatyyppejä mahalaukun syöpä. Yliekspressio SIRT3 edistää solujen lisääntymistä ja parannettu ATP sukupolven, glukoosin sisäänoton, glykogeenin muodostumista, MnSOD aktiivisuus ja laktaatin tuotantoa, jotka inhiboivat SIRT3 pudotus, mikä osoittaa, että SIRT3 on rooli ohjelmoimalla bioenergetiikan mahalaukun kasvainsoluissa. Tarkempi analyysi paljasti, että SIRT3 vuorovaikutuksessa ja deasetyloidulle laktaattidehydrogenaasi A (LDHA), keskeinen proteiini säätelyssä anaerobisen Glykolyysivaiheen, parantaa LDHA aktiivisuutta. Konsistenssi, klusterin glykolyysin liittyvien geenien voimistussäädellään SIRT3 yli-ilmentäviä mahalaukun kasvainsoluja. Näin ollen, sen lisäksi, että hyvin dokumentoitu SIRT3 välittämää mitokondrion homeostaasin normaaleissa soluissa, SIRT3 voi lisätä glykolyysin ja proliferaatiota in SIRT3 ilmentäviä syöpäsoluja.}

Citation: Cui Y, Qin L, Wu J, Qu X, Hou C, Sun W, et al. (2015) SIRT3 Parantaa Glykolyysi ja proliferaation SIRT3 ilmentävien Mahalaukun syöpäsoluja. PLoS ONE 10 (6): e0129834. doi: 10,1371 /journal.pone.0129834

Editor: Xianglin Shi, University of Kentucky, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 16 huhtikuu 2015; Hyväksytty: 13 toukokuu 2015; Julkaistu: 29 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 Cui et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä tutkimus oli osittain tuettu National Natural Science Foundation of China, Key Program (30930105), National 12-5 Tukisopimusvaihtoehdot projekti tiede and Technology of China (2012BAH30F03), National Natural Science Foundation of China (31070740), The 985 ja 211 Projects Xi'an Jiaotong University (JKL), ja National Cancer Institute RO1 apurahan CA152313-01-A1 (JJL).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Sirtuins, perheen NAD ^{+ - riippuvaista histonideasetylaaseja (HDAC: t) nisäkkäiden solut ovat osallisina monenlaisia ​​fysikaalisten prosessien kuten solun selviytymisen, apoptoosin, aineenvaihdunta, stressistä, ikääntymiseen ja pitkäikäisyys [1,2]. Niistä seitsemän Sirtuin jäsentä (SIRT1-7), SIRT3 on paras tunnettu mitokondrion Sirtuin, toimiva säännellä mitokondrioiden osallistuvien proteiinien oksidatiivinen fosforylaatio, rasvahappojen hapettumista, ureakiertoa, ja antioksidantti vastaus [2-9]. Useat tutkimukset ovat korostaneet roolia SIRT3 aineenvaihdunnassa ja homeostaasin normaaleissa soluissa ja paljasti uudet tavoitteet ja substraatteja SIRT3 riippuvaisen deasetyloitumisen [10]. Kim et ai raportoi, että SIRT3 on keskeinen mitokondrioita proteiinia, ja puute on SIRT3 ilmaisun liittyy lisääntynyt mitokondrioiden DNA-vaurioita ja vanheneminen, sekä lisääntynyt mahdollisuus Ras-indusoitua solun muuntaminen ja SIRT3-välitteisen MnSOD aktivointi edistää mitokondrioiden homeostaasin [11,12]. Tukemiseksi, ihmisen alkion munuaisen 293-solut (HEK293) soluilla on lisääntynyt SIRT3 ilmentymistä oksidatiivisen stressin, mikä johtaa deasetyloinnin ja aktivointi MnSOD [13]. SIRT3 uskotaan toimivan tuumorisuppressorigeenin ja sillä on keskeinen rooli parantaa solun homeostaasin vanhenemista vastaan ​​ja karsinogeneesiin.}

Kuitenkin jotkut kasvainsolut osoittavat ilmentymisen SIRT3 ja mahdollinen rooli SIRT3 näissä kasvainsoluissa , varsinkin sen mahdollisuudet suhteen aggressiivinen fenotyypin, on kiistanalainen [14]. SIRT3 ilmaisu on pienempi tai havaitsematon joukko ihmisen syövissä, mukaan lukien rintasyöpä, glioblastooma, paksusuolen syöpä, ja osteosarkooma, eturauhas- ja munasarjasyövät [11,15,16]. SIRT3 indusoi kasvun pysähtymisen ja apoptoosin selektiivisen vaiennettu Bcl-2 in HCT116-soluissa moduloimalla JNK2 signalointireitille [17]. Lisäksi, SIRT3 on raportoitu lisäävän herkkyyttä ihmisen leukemiasolujen kemoterapian mahdollisesti indusoimalla mitokondrioiden-välitteisen apoptoosin [18]. Toisaalta, SIRT3 ilmentyminen havaitaan myös lisättävä, suusyövän, paikallisiin imusolmukkeisiin rintasyöpä, ruokatorven syöpä, ja kilpirauhasen karsinoomat; ja lisääntynyt SIRT3 liittyy korkeampi pahanlaatuisen fenotyypin ja vaimennussäätely SIRT3 parantaa kasvaimen herkkyys syövän hoidossa [19-23]. Nämä tulokset hälytys eri roolia SIRT3 tietyissä kasvaimissa, jotka on selvitetty.

Syöpäsolut ovat metabolisesti aktiivisia ja kuluttaa enemmän solujen polttoainetta kuin normaalit solut. Kuitenkin syöpäsolut rele lähinnä ATP synteesiä aerobinen Glykolyysivaiheen, ominaisuutta kutsutaan Warburg vaikutus [24]. Tällainen aerobinen Glykolyysivaiheen uskotaan suojella syövän solut muodostavat oksidatiivisen stressin jälkeen mitokondrio hengitys on tärkein solunsisäisten ROS [25]. Laktaattidehydrogenaasi A (LDHA) on entsyymi ohjaamiseksi toisikseen välillä pyruvaattia ja L-laktaattia käänteisesti viimeisessä vaiheessa anaerobisen glykolyysin [26]. Esto LDHA vähentää Tuumorigeenisuustutkimuksissa lisääntynyt mitokondrioiden hapenkulutusta ja laski mitokondrion kalvon potentiaalia [26] ja yleistä solujen ATP-tuottamista ja glykolyysiin [27].

Tässä tutkimuksessa tutkimme mahdollista roolia SIRT3 maha- syöpäsolut ilmentävät SIRT3. Expression of SIRT3 oli yhdistetty aggressiivinen kasvua, joka välittyy SIRT3-deasetyloitu ja aktivoitu LDHA, parantaa glykolyysin ja ilmaisun ryhmä glykolyysin liittyvien geenien. Näin SIRT3-LDHA-välitteisen Glykolyysivaiheen aineenvaihdunta voi olla potentiaalinen terapeuttinen kohde hoitoon syöpäsolut ilmentävät SIRT3.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja kulttuuri

Ihmisen mahasyövän solulinjoja MGC-803, HGC-27, SGC-7901 [28] ja AGS [29] ja ihmisen immortalisoitu mahalaukun epiteeli- solulinjan GES-1 [30] pidettiin RPMI-1640-alustassa (Invitrogen), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini /streptomysiiniä, ja niitä viljeltiin 37 ° C: ssa ilmakehässä 5% CO2: a.

Immunosaostus ja western blot

Subkonfluentit solut hajotettiin, ja lysaatit inkuboitiin proteiini A /G -agaroosihelmien plus suositeltu määrä vasta-aineita joko SIRT3 (Cell Signaling Technology) tai LDHA (Santa Cruze) 4 ° C: ssa yön yli. Näytteet sentrifugoitiin, ja erotettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja sähköllä nitroselluloosakalvoille. Kun oli salvattu 5% rasvatonta maitoa TBST, kalvoja inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineen kanssa 4 ° C: ssa yön yli, jota seuraa inkubaatio sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan RT: ssä. Proteiinit kohteisiin tehtiin näkyväksi ECL havaitseminen kit (Thermo Fisher).

immunohistokemia määritys

Patologiset dioja mahasyövän viereisten normaaleissa kudoksissa analysoitiin immunohistokemiallisesti määritys suoritettiin seuraten valmistajan ohjeita. Polymer Detection Kit varten immunohistokemian analyysiä hankittiin Zhongshan Golden Bridge Biotechnology. Lyhyesti, parafiini osat poistettiin vaha ja uudelleen hydratoitu etanolia (100%, 90% ja 75%). Leikkeitä inkuboitiin 3% H _{2O 2 huoneenlämpötilassa 10 minuuttia ja sitten tukitaan ei-immuuni vuohen seerumia huoneenlämmössä 15 minuutin ajan. Sitten leikkeitä inkuboitiin ensisijaisen vasta-aineen SIRT3 (Cell Signaling Technology) 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen anti-kani sekundääristä vasta-ainetta inkuboitiin 15 minuutin ajan RT: ssä. Sitten leikkeitä inkuboitiin DAB detektioreagenssi 2 minuuttia kussakin, vastavärjättiin hematoksyliinillä ja dehydraded etanolissa (90% ja 100%). Leikkeitä asennettu ja värjäys analysoitiin alla mikroskoopilla.}

Plasmidin rakentaminen ja solujen transfektio

SIRT3 koko cDNA syntetisoitiin käyttäen RT-PCR kokonais-RNA uutettu GES-1 soluja malli (alukkeita: 5 'CCGCGGTACCATGGCGTTGTGGGGTTG 3' ja 5 'CCGCTCTAGACTATTTGTCTGGTCCATCAAGC 3'). CDNA kloonattiin sitten pcDNA3.1 + (Invitrogen). PGPH1 /GFP /Neo-SIRT3-shRNA plasmidi kohdistaminen ihmisen SIRT3 (5 'CTTGCTGCATGTGGTTGAT 3') ja ohjaus- shRNA plasmidi saatiin GenePharma. Tavoitteena on tuottaa vakaa transfektantit, AGS ja SGC-7901-solut transfektoitiin käyttäen Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen) ja vakaa transfektantit valittiin 400ug /ml G418 (Gibco).

Solulisääntyminen ja kyky muodostaa klooneja määritys

proliferaatiomäärityksessä, solut maljattiin 6-kuoppalevyllä 2 x 10 ^{4 solua /kuoppa. Solujen lisääntyminen laskettiin päivinä 2, 4, 6, ja 8 jälkeen pinnoituksen. Sillä kyky muodostaa klooneja määritystä, solut maljattiin 6-kuoppalevyn monipuolinen solujen määrä ja viljeltiin 14 päivää ja pesäkkeet värjättiin sitten kristallivioletilla, ja pesäkkeiden lukumäärä (> 50 solua /pesäke) laskettiin seuraavan vakiintuneista menetelmistä [31].}

mittaus glukoosin, laktaatin ja glykogeenin

fenolipunaista väliaine on käytetty viljellä soluja 6-kuoppalevyllä 24 tunnin ajan ja glukoosin sisäänoton ja laktaatti sukupolven mitattiin käyttäen Glukoosikoe Kit ja maitohappo Kit (Jiancheng biotekniikan instituutti). Suhteelliset arvot normalisoitiin solujen määrä kuhunkin kuoppaan. Cellular glykogeenin tasot havaittiin käyttäen glykogeenin Assay Kit (BioVision). Lyhyesti, 1 x 10 ^{6 solua homogenisoitiin 200 ui vettä jäällä, ja homogenaatit keitettiin 5 minuutin ajan entsyymien inaktivoimiseksi ja sentrifugoitiin 13000 rpm: llä 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa liukenemattoman materiaalin poistamiseksi. Glykogeenin tuotanto mitattiin OD-arvo 570 nm: ssä.}

mittaus ATP tuotannon

Cellular ATP ja ROS mitattiin kuten aiemmin on kuvattu [32]. -Soluja viljeltiin 6-kuoppaisen levyn erilaisten käsittelyjen jälkeen, hajotettiin ja solu-ATP-tasot mitattiin ATP Bioluminescence Assay Kit (Sigma). Mittaamiseksi glykolyysi-välitteisen ATP-tuottamista, soluja käsiteltiin 2 uM rotenone 24 tuntia ennen mittauksia.

mittaus ROS

Cellular ROS: n syntyminen määritettiin 5- (ja 6-) karboksi-2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diasetaatti (DCFDA) menetelmällä käyttäen mikrolevyn spektrometri (Thermo Fisher) 488 nm: ssä /530 nm: n aallonpituudella.

MnSOD aktiviteetti

Soluja viljeltiin 6-kuoppaisen levy lyysattiin ja MnSOD aktiivisuus määritettiin WST-8 menetelmiä käyttäen MnSOD iinianalyysikitissä (Beyotime) seuraten valmistajan ohjeita.

tuumorigeenisyyden määrityksissä nude-hiirissä

SGC7901-soluja (7,5 x 10 ^{6) SIRT3 yliekspressio tai pudotus suspensoitiin 0,1 ml: aan PBS ja ympätään joko kupeeseen 5 viikkoa vanhoja BALB /c kateenkorvattomiin nude-hiirissä, ja klo 28 päivänä istutuksen jälkeen, jolloin maksimaalinen kasvaimen (~ 1500 mm 3) saavutti kontrolliryhmässä, kokeet lopetettiin ja kaikki kasvaimet kustakin ryhmästä leikattiin ja punnittiin. Kokeellinen menettely liittyy eläinkokeita tehtiin noudattaen vakiintuneiden ohjeiden; Instituutioannissa Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) Xian Jiao Tong-yliopiston erikseen hyväksynyt tämän tutkimuksen (pöytäkirjax181).}

Laktaattidehydrogenaasi määritys

laktaattidehydrogenaasiaktiivisuuden määritettiin vakiintuneiden protokollaa mittaamalla vähennysvauhti absorbanssin aallonpituudella 340 nm, jotka johtuvat NADH: n hapettumiseen [27]. Lyhyesti, soluja viljeltiin 10 cm: n maljoilla ja homogenisoitiin PBS: ssä jäillä. Homogenaatteja lisättiin puskuriin, joka sisälsi 6,6 mM NADH: ta, 30 mM natriumpyruvaattia ja 0,2 M Tris-HCl, pH 7,3 ja sekoitetaan. Inkuboidaan seosta 5 minuuttia saavuttaa lämpötilan tasapainottumisen ja sitten tallentaa lasku absorbanssin 340 nm: ssä.

SIRT3 in vitro
deasetylointi määritys

Ihmisen SIRT3 rekombinantti entsyymi ( BPS) inkuboitiin L-laktaattidehydrogenaasin naudan sydämestä (Sigma) reaktiopuskurissa (50 mM NaCl, 4 mM MgCI _{2, 10 mM NAD ^{+, 50 mM DTT: tä, 50 mM Tris, pH 8,0) /ilman SIRT3 inhibiittoria nikotiiniamidi (NAM, 10 mM) 37 ° C: ssa 1,5 tunnin ajan, ja sitten reaktiot käytettiin LDHA aktiivisuuden määritys kuin edellä kuvattiin.}}

Reaaliaikainen PCR

kokonais-RNA eristettiin käyttäen TRIZOL-reagenssia (Invitrogen), jota seuraa käsittely fenoli /kloroformilla ja saostamalla 2-propanolilla. Kokonais-RNA-pelletti pestiin sitten 75% etanolilla ja suspendoitiin uudelleen veteen. RNA alistettiin käänteistranskriptioon kanssa PrimeScript RT-PCR Kit (Takara) ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR-analyysi mielenkiinnon kohteena olevien geenien suoritettiin käyttäen SYBR PremixExTaq II -kittiä (Takara) seuraten valmistajan ohjeita. Data normalisoitiin tasoa γ-tubuliinin.

Immunofluoresenssikoe

AGS soluja kylvetään peitinlevylle on 6-kuoppalevyllä fiksoitiin 4% paraformaldehydillä 10 minuutin ajan ja blokattiin 1% BSA: lla 1 tunnin ajan RT: ssä. Soluja inkuboidaan primaaristen vasta-aineiden SIRT3 ja LDHA 4 ° C: ssa yön yli, jonka jälkeen inkuboitiin fluoresenssi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan RT: ssä. Counterstaining suoritettiin DAPI käyttämällä immunofluoresenssilla Kit (Beyotime). Solut kiinnitettiin ja kuvattiin laserkeilauksen -konfokaalimikroskoopilla.

Tilastollinen

Tulokset esitetään keskiarvona ± SE vähintään kolmen erillisen kokeen. Tilastollinen analyysi suoritettiin parittomalla kaksisuuntaisella Studentin t-testiä, ellei toisin mainita. P
< 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

SIRT3 ilmentymistä mahasyövässä soluissa

SIRT3 on hyvin määritelty säätelyssä mitokondrioiden homeostaasin anti-ikääntyminen ja anti-muunnos. Viime aikoina eri tuloksia raportoidaan, jonka kohteena SIRT3 välittämiä solun esto ja proliferaatiota, mikä johtaa kiista sen roolit syövissä [19,20]. Voit selvittää mahdollinen rooli SIRT3 mahasyövän, ilmaus SIRT3 havaittiin 4 mahasyövän solulinjoissa AGS, SGC-7901, MGC-803, HGC-27 ja ryhmä mahasyövän kasvaimen kudokset. Huomasimme, että SIRT3 proteiini tasot olivat koholla kaikki 4 mahasyövän solulinjoissa verrattuna kuolemattomaksi mahalaukun epiteelin GES-1-soluissa (AGS, 1,9-kertaiseksi, SGC-7901, 1,5-kertainen, MGC-803, 2,0-kertainen, ja HGC -27, 1,8-kertainen verrattuna GES-1-solut) (kuvio 1A). Mukaisesti, mRNA tasot SIRT3 näissä solulinjoissa oli myös kasvanut (AGS, 2,6-kertainen, SGC-7901, 1,7-kertainen, MGC-803, 2,5-kertainen, HGC-27, 2,2-kertainen) verrattuna GES- 1-soluissa (kuvio 1 B).

immunohistokemia analyysi kasvaimen ja viereisen ei-kasvain normaaleissa kudoksissa ryhmästä mahasyövän potilailla osoitti, että SIRT3-positiiviset solut olivat usein havaittavissa kasvainkudoksissa kuin normaaleissa kudoksissa. Tulokset osoittivat, että 55,1% kasvaimen kudokset (7% normaalista kudosten) oli korkea (vahva positiivinen), 41,4% kasvaimen kudokset (28% normaalista kudoksesta) oli keski- korkean tason (heikko positiivinen), kun taas 3,5% kasvaimen kudokset ja 64% normaalista kudoksesta oli negatiivinen SIRT3 ilmaisu (kuvio 1C ja 1D, S1A kuvassa). Mielenkiintoista, SIRT3 ilmaisun suoliston kasvaimen tyyppi kudosten (15 tapausta; 93,3% vahva positiivinen ja 6,6% heikko positiivinen) oli huomattavasti korkeampi kuin hajanainen tyyppi kasvain kudosten (14 tapausta; 14,3% vahva positiivinen, 78,6% heikko positiivinen ja 7.1 % negatiivinen) (kuvio 1C ja 1E, S1B kuvassa). Nämä tulokset viittaavat siihen, että SIRT3 ilmentyminen lisääntyy joissakin kasvaimissa verrattuna niihin liittyvien normaaleista kudoksista ja SIRT3 ilmentyminen voi olla vaihdella yksittäisissä kasvaimia, joita on tutkittava tarkemmin.

SIRT3 tasot ovat yhteydessä solujen lisääntymistä

Sitten loimme SIRT3 yli-ilmentymisen ja knockdown solulinjoissa käyttämällä AGS ja SGC-7901-soluissa. Ilmentyminen SIRT3 vakaassa transfektanttien varmistettiin Western blot. Yliekspressio SIRT3 lisääntynyt solujen kasvun, kun taas SIRT3 pudotus esti solun kasvua sekä mahalaukun syövän solulinjoissa (kuvio 2A). Edelleen, yliekspressio SIRT3 laukeaa enemmän pesäkkeen muodostumista kuin ohjaus transfektoituja soluja, jotka oli vastoin vain vähemmän pesäkkeitä, jotka on muodostettu SIRT3 knockdown-soluja (kuvio 2B).

edelleen merkityksen määrittämiseksi SIRT3 kasvaimen muodostumisessa kyky, me ruiskutetaan SIRT3 yli-ilmentymisen ja pudotus SGC-7901 solut paljaiden hiirien kylkiin ja kasvaimen kasvun annettiin 28 päivän ajan inokulaation (S2 kuvassa). Keskimääräinen paino kasvainten peräisin SIRT3 yli-ilmentävät solut oli 0.7079g, huomattavasti suurempi kuin keskimääräinen kasvaimen paino ohjaus (NC), p
= 0,015, (kuvio 2C, vasen paneeli). Sen sijaan, keskimääräinen paino kasvaimia, jotka ovat peräisin SIRT3 knockdown-soluja oli 0.0588g, huomattavasti pienempi kuin salatulta shRNA ohjaus soluja (Scr) (0.2033g; p
= 0,009) (kuvio 2C, oikea paneeli) . Keskimääräinen tilavuus kasvainten peräisin SIRT3 yli-ilmentävät solut nostettiin kuin kontrollista soluista (NC) (kuvio 2C, vasen paneeli ylös oikeassa yläkulmassa). Päinvastoin, keskimääräinen tilavuus kasvainten kasvavat SIRT3 pudotus soluista oli dramaattisesti pieni verrattuna kontrollista soluista (SCR) (kuvio 2C, oikea paneeli ylös oikeassa yläkulmassa).

Tehostettu Glykolyysivaiheen vuonna SIRT3 ilmentävät mahasyövän solut

sitten ihmettelevät, miten matkapuhelinverkon bioenergetiikan voitaisiin muuttaa SIRT3 yliekspressoivia mahalaukun syöpäsoluja. SIRT3 yliekspressio dramaattisesti lisääntynyt glukoosin oton (1,4-kertaisesti AGS ja 1,9-kertaisesti SGC-7901), kun taas SIRT3 knockdown laski glukoosin oton (noin 40% sekä AGS ja SGC-7901) (kuvio 3A ja 3B). Yhdenmukainen rakenteessa glukoosin käyttö, SIRT3 yli-ilmentävät solut olivat kohonneeseen laktaatin eritystä (1,2-kertaisesti AGS ja 1,3-kertaisesti SGC-7901), kun taas SIRT3 knockdown solut olivat vähentyneet laktaattitasoja erityksen (55% AGS ja 45 % in SGC-7901) (kuvio 3C ja 3D). Olemme myös havainneet, että glykogeenin muodostusta kasvatti merkittävästi SIRT3 yli-ilmentymisen (1,5-kertaisesti AGS ja 1,3-kertaisesti SGC-7901), ominaisuus nopea kasvu kasvainsolun [33], kun taas vähentää SIRT3 taintumisen (40% AGS ja 70% vuonna SGC-7901) (kuvio 3E ja 3F).

SIRT3 on osoittautunut mukana deasetylaation globaalin aineenvaihdunnan entsyymien ja ylläpito pohjapinta ATP-tasot soluissa sekä normaali- kunnossa ja sairauksiin [1 , 2]. Solun totaali ATP ja glykolyysiin ATP sukupolvi havaittiin AGS ja SGC-7901-soluissa joko SIRT3 yliekspressio tai SIRT3 knockdown. Kokonaismäärä solun ATP-tasot olivat lisääntyneet SIRT3 yliekspressoivat soluissa (noin 1,3-kertainen molemmissa solulinjoissa), mutta laski SIRT3 pudotus soluissa (noin 75% molemmissa solulinjoissa) verrattuna NC tai Scr ohjaus soluissa (kuvio 4A ja 4B) . Sitten käsitellyt solut kanssa rotenone estävän oksidatiivinen fosforylaatio, ja testattu ATP generation Glykolyysivaiheen. Kuten on esitetty kuviossa 4C ja 4D, SIRT3 yliekspressio johti kasvuun Glykolyysivaiheen ATP tuotannossa (1,4-kertaisesti AGS ja 1,6-kertaisesti SGC-7901), kun taas SIRT3 knockdown johtanut merkittävään väheneminen Glykolyysivaiheen ATP tuotanto (20% in AGS ja 40% SGC-7901) verrattuna NC tai Scr ohjaus.

SIRT3 säätelee homeostaasiin ROS mahalaukun syöpäsoluissa

useammat todisteet tukevat että lisääntynyt ROS taso on kriittinen ominaisuus syöpäsoluissa, mikä tekee syöpäsolujen herkempiä ylimääräisiä ROS stressiä [34]. Täällä huomasimme, että yli-ilmentyminen SIRT3 laski ROS tasoilla 70% ja 80% vuonna AGS ja SGC-7901-soluissa, kun taas esto SIRT3 ilmaisun lisääntynyt ROS tasoilla (1,4-kertaisesti AGS soluissa ja 1,6-kertaisesti SGC-7901-soluissa) vastaavasti (kuvio 5A ja 5B). Suostumuksella kirjallisuudessa osoittaa SIRT3 deasetyloi ja aktivoi MnSOD (11, 12), mahalaukun syöpäsolujen MnSOD aktiivisuus tehostui SIRT3 yli-ilmentymisen (1,4-kertaisesti AGS soluissa ja 1,2-kertaisesti SGC-7901-soluissa), mutta vähennetään SIRT3 taintumisen (50% AGS soluissa ja 65% vuonna SGC-7901-solut) (kuvio 5C ja 5D), mikä viittaa siihen, että SIRT3 voi suojaavat soluja oksidatiivisen stressin aiheuttama vaurio välistä tasapainoa solunsisäisten ROS tehostamalla MnSOD aktiivisuus mahan syöpäsoluja.

SIRT3 deasetyloi ja aktivoi LDHA

LDHA avainasemassa kasvaimen aloittamista, huolto ja etenemiseen. Esto LDHA toiminnan lohkojen tuumorigeenisyyteen ja syövän etenemistä [26,27] ja LDHA aktiivisuutta voidaan säädellä asetylointi /deasetylaation muutos [35]. Pohdimme, onko SIRT3 osallistuu säätelyyn LDHA toimintaa. Huomasimme, että mahalaukun syöpäsolujen LDHA aktiivisuus lisääntyi merkitsevästi SIRT3 yli-ilmentävät solut, kun taas vähentynyt SIRT3 pudotus soluissa verrattuna NC tai Scr säätökennoja erikseen ilman havaittavaa muutosta LDHA proteiinin taso vakaana transfektanteista (kuvio 6A). Immunovärjäys tulokset osoittivat, että LDHA ja SIRT3 olivat yhdessä lokalisoitu sytoplasmassa (kuvio 6B), ja yhteistyö IP analyysi joko LDHA tai SIRT3 vasta-paljasti, että SIRT3 pystyy vuorovaikutuksessa LDHA (kuvio 6C). Lisäksi taso LDHA asetylointi on vähentynyt SIRT3 yli-ilmentää soluissa, mutta kasvoi SIRT3 pudotus-soluissa (kuvio 6D). Edelleen, in vitro
LDHA aktiivisuuden määritys suoritettiin käyttäen kaupallisia ihmisen rekombinantti SIRT3 ja naudan sydän L-laktaattidehydrogenaasin osoitti, että LDHA aktiivisuus lisääntyi läsnäolo SIRT3 reaktiossa, joka purettiin lisäämällä SIRT3 estäjän , nikotiiniamidi (kuvio 6E). Tunnistaa mahdolliset SIRT3 deasetylaatiolla sivusto (t) LDHA etsittiin tietokannasta ja totesi, että K5, K14, K57, K81, K118, K126, K222 ja K318 ovat mahdollisia asetylaatio sivustoja LDHA, ja edellinen tutkimus kertoo, että K5 asetylaatio /deasetylaatiolla oli sekaantunut säätelyssä LDHA toimintaa [35]. Sitten teimme LDHA aktiivisuuden määritys käyttäen lysiiniä 5 ja lysiiniä 318 asetylointi matkivat (K5Q /K318Q) tai deasetylaatiolla matkivat (K5R /K318R) mutantti LDHA, ja totesi, että kumpikaan K5 eikä K318 vaadittiin SIRT3 välittämää LDHA aktivointi (S3 kuvassa). Tarkempi yksilöinti SIRT3 välittämän LDHA deasetyloitumisen kaipaa.

SIRT3 ylössäätelee geenien solujen aineenvaihduntaan

luonnehtivat molekyyli- allekirjoitus SIRT3-LDHA välittämää bioenergetiikan mahalaukun syöpäsoluissa, mittasimme liittyvien geenien ilmentymistä glukoosin kuljetusta ja glykolyysin. Tiedot kuviossa 7A ja 7B osoitti, että yli-ilmentyminen SIRT3 vuonna AGS tai SGC-7901 indusoi ilmentymistä HK2 (1,47-kertaisesti AGS soluissa, 1,3-kertaisesti SGC-7901-soluissa), MCT4 (2,3-kertaisesti AGS soluissa, 1,34 kertainen in SGC-7901-solujen) ja Glut1 (1,55-kertaisesti AGS soluissa, 1,38-kertaisesti SGC-7901-solujen) mRNA tasolla testattiin reaaliaikaisella PCR: llä. Päinvastoin, SIRT3 pudotus vähentynyt ilmentyminen geenin HK2 76%, MCT4 73% ja Glut1 62% vuonna AGS-soluissa, kun taas HK2 80%, MCT4 62% ja Glut1 74% in SGC-7901-soluja. Lisäksi, kun SIRT3 yliekspressoitui, MCT1 mRNA-tasolla nostettiin AGS soluissa 1,6-kertaisesti, mutta ei SGC-7901-soluissa, ja silloin, kun SIRT3 oli pudotus, MCT1 laskettiin 59%: in AGS ja 65%: iin SGC-7901-soluja vastaavasti.

keskustelu

Tämä tutkimus antaa näyttöä siitä, että SIRT3 ilmaistu joissakin syöpäsoluissa, kuten mahasyövän soluja, voidaan yhdistää parannetun aggressiivisuus by SIRT3 välittämä bioenergetiikkaa kautta deasetylaatiolla ja aktivointi LADH. Vaikka kertynyt todisteita osoittaa, että SIRT3 avainasemassa suojaa normaalien solujen vanhenemista vastaan ​​ja pahanlaatuisiksi, sen tehtävä jo transformoiduissa soluissa, kuten kasvainsoluissa, jotka ilmentävät SIRT3 on tutkittu [19]. Puute SIRT3 vuonna MEF johtaa genomin epästabiilisuuden ja tiheä solun välittämä transformaatio Ras lisääntynyt määrä kasvaimen muodostumisen ja ikääntyminen, mikä viittaa siihen, että SIRT3 on tarpeen ehkäisyssä solujen vanhenemista ja syövän syntymistä [11,15]. Lisäksi, puute tai alempi ilmentymisen SIRT3 havaitaan useissa ihmisen syövissä ja SIRT3 taso liittyy herkkyys syöpäsolujen kemo- ja sädehoidon [11,15,16]. Kuitenkin SIRT3 näkyy myös yliekspressoituvan ihmisen syövissä ja liittyy terapia vastus [19,21,36]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että SIRT3 voi kohdistaa erilaisia ​​proteiineja normaalin ja syöpäsolujen, ja että SIRT3 ilmentyminen voidaan vaihdella eri syöpätyyppien, kuten nykyiset tulokset osoittavat, että suoliston tyyppi mahasyövän ilmaisee korkeampaa SIRT3 kuin diffuusi tyyppinen mahasyöpä.

on yleisesti hyväksytty, että kasvainsolut kuluttaa enemmän soluenergiaa tukemaan nopeaa kasvua ja lisääntymistä kuin normaalit solut käyttäen Glykolyysivaiheen pääasiallisena lähteenä ATP sukupolven sijasta oksidatiivisen fosforylaation [24] . Nykyisissä tutkimuksessa osoitimme, että mahalaukun syöpäsolujen SIRT3 vuorovaikutuksessa ja deasetyloi LDHA aiheuttaen LDHA toimintaa; ja SIRT3 yli-ilmentyminen johtaa lisääntyneeseen solun ATP-tuottamista ja MnSOD toiminta rinnastettavissa alentunut solun ROS tasolla, mikä osoittaa lisääntyneen oksidatiivisen scavenger kyky SIRT3 mahdollisesti kautta deasetylaatiolla välittämän MnSOD entsyymin aktivoitumisen. Lisääntyvä todistusaineisto osoittaa, että SIRT3 tarvitaan ylläpitämiseksi solujen ja mitokondrioiden homeostaasin kautta säännellään mitokondrioita aineenvaihduntaa ja solujen redox massakeskiön suojaten soluja vastaan ​​oksidatiivisen stressin kautta säädellään ROS sukupolvi, kriittinen mekanismi ikääntyminen, syövän ja sydänsairauksien [1,2, 37]. SIRT3 voi deasetyloida ryhmä mitokondrioiden tavoitteiden osallinen säätää sekä Glykolyysivaiheen ja solujen oksidatiivista stressiä. Äskettäin SIRT3 on havaittu pystyä deasetyloida ja lisätä pyruvaattidehydrogenaasin aktiivisuutta syöpäsoluissa, mikä voi lisätä sekä mitokondrioiden bioenergetiikan ja glykolyysin [38]. Yhteisymmärryksessä, nykyinen tutkimus osoittaa, että SIRT3 voivat deasetyloida ja aktivoida LDHA joita voidaan käyttää sekä mitokondrioiden hengitykseen ja glykolyysin. Toisaalta, SIRT3 voi deasetyloida ja sen jälkeen aktivoida muita mitokondrioita substraattien, kuten MnSOD [11,12], Foxo3 [39] ja IDH2 [9] sitomiseksi ROS tuotettu oksidatiivinen fosforylaatio, solujen suojaaminen hapettumista [40] . Sopusoinnussa myös näiden havaintojen tässä tutkimuksessa, huomasimme, että yli-ilmentyminen SIRT3 lisää MnSOD aktiivisuutta, mikä saattaa olla yksi syy vähentyneen solun ROS tasolla tiiviimmässä solun aineenvaihduntaan kunnossa.

LDHA, perheenjäsenenä laktaatin (LDH), on havaittu olemassa glykolyyttisiä soluissa ja lokalisoitu mitokondrioita lisäksi sytosoliin [41], ja pääasiallisesti katalysoimaan välinen pyruvaatin ja laktaatin [42]. LDHA on osoitettu olevan keskeinen rooli aerobinen Glykolyysivaiheen ja tuumorigeenisyystesti pahanlaatuisissa soluissa [26,27]. Syöpäsoluissa, LDHA nopeasti kuluttaa pyruvaatti tuotettu glykolyyttisen reitin, joka johtaa lisääntyneeseen aerobinen laktaatin [26]. Esto LDHA indusoi ROS tuotanto, vähenee solujen ATP-tasot ja estää glykolyysin, tämän vuoksi se estää solujen kasvua ja laukaisee solukuoleman syöpään [27]. Joka koostuu näihin raportteihin, huomasimme, että SIRT3 voivat olla vuorovaikutuksessa ja aktivoida LDHA. Vuonna SIRT3 yli-ilmentävät solut, LDHA asetylointi väheni suurentunut LDHA entsyymin aktiivisuutta. Vaikka tarkkaa mekanismia aiheuttaen SIRT3 välittämää LDHA asetusta on tutkittu tarkemmin, nämä tulokset osoittavat, että LDHA ohjattu Glykolyysivaiheen polku, joka kiihdyttää kasvaimen bioenergetiikan voidaan vaikuttaa SIRT3 ekspressiotasoja.

Nykyinen tutkimus osoitti myös, että ilmaus ryhmä geenejä, kuten MCT1, MCT4, HK2 ja Glut1, tunnetaan keskeinen sääntelyviranomaisten energia-aineenvaihdunnan syövän myös lisääntyneet SIRT3 yliekspressoivia mahalaukun syöpäsoluja, jotka osoittavat mahdollisen roolin SIRT3 parantamisessa Glykolyysivaiheen kasvainsoluissa. HK2 katalysoi fosforylaation glukoosin glukoosi-6-fosfaatti on ensimmäinen askel glykolyysin [43]. Glukoosinkuljettajaproteiini (GLUT) ohjaa glukoosin solukalvon läpi, joka toimii ensimmäinen nopeutta rajoittava vaihe glukoosin aineenvaihduntaa [44]. MCT1 ja MCT4 jäsenet monokarboksylaatit (kuten laktaatti ja pyruvaatti) kuljettajaa perhe, ovat myös mukana kasvun Glykolyysivaiheen kasvaimet [45]. Yhdessä nämä tulokset viittaavat mahdolliseen vuorovaikutukseen SIRT3 ja joukko Glykolyysivaiheen liittyvien geenien signalointi kasvaimen aggressiivinen kasvu, jota on tutkittava tarkemmin.

Vaikka siis SIRT3 on hyvin tunnettu mitokondrion homeostaasin vastaan ​​solu ikääntyminen ja transformaatio, ilmentyminen SIRT3 kasvainsoluissa liittyy parannettu lisääntymistä ja aggressiivinen kasvu mahalaukun syöpäsoluja. SIRT3 vuorovaikutuksessa ja aktivoi LDHA, mikä lisää glykolyysin ja ATP-tuottamista, mikä yhdessä lisääntyneen mitokondrioiden antioksidantti MnSOD aktiivisuutta ja laski solunsisäinen ROS taso (hypoteettinen malli on ehdotettu kuviossa 7C). Täten kasvua stimuloiva tehtävä SIRT3 osoittaa potentiaalinen kohde kasvainten kanssa SIRT3 ilme.

tukeminen Information
S1 kuviossa. Tyypillinen patologinen liukuu määrittämiseksi SIRT3 ilmentymistä ihmisen mahasyövän yksilöitä.
A, parafiiniin upotetut ihmisen mahasyövän ja yhdistetty viereisen patologisesti normaalin kudosnäytteiden altistettiin immunohistokemian värjäys SIRT3 vasta-aineella (ruskea) ja sen jälkeen ytimet vastavärjäämiseksi hematoksyliinillä ( blue; kukin kasvain näytettiin viereisten normaaleista kudoksista yhdessä rivissä 20 × ja 40 ×). B, edustavat kuvat SIRT3 ilmaisun suoliston ja hajanainen tyyppisiä mahasyöpä. Mittakaava, 50 pm.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0129834.s001
(TIF)
S2 Kuva. Yliekspressio SIRT3 edistää kasvaimen taakkaa in vivo.
SGC-7901-solujen SIRT3 yli-ilmentyminen (A) tai pudotus (B) ihon alle injektoitiin oikeaan kylkeen nude-hiirillä, joilla suhteellinen ohjaus soluja (NC tai Scr) vasempaan kylki. Ksenograftikasvaimissa leikattiin irti ja punnittiin 28. päivänä soluinokulaation. Kuvia oikea paneeli osoitti ksenograftikasvaimissa in vivo lopussa kokeen. Kuvat osoittivat kasvaimen kasvua hiirissä.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0129834.s002
(TIF)
S3 Fig.

• PLoS ONE: imusolmukemääritysmenetelmä etäpesäke, Unique Independent ennustetekijä Early mahasyövän
• PLoS ONE: tunnistaminen ja karakterisointi CXCR4-Positive mahasyövän Stem Cells