Stomach Health > Vatsa terveys >  > Gastric Cancer > mahalaukun syöpä

PLoS ONE: miR-26a vaimentaa tuumorikasvun ja metastaasin mukaan kohdistaminen FGF9 mahasyövän

tiivistelmä

rooli miR-26a syöpäsoluissa näytti kiistanalainen aiemmissa tutkimuksissa. Tähän asti rooli miR-26a mahasyövän määrittelemätön. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että miR-26a voimakkaasti vaimentua mahasyövän (GC) kudoksiin ja solulinjoihin, ja sen ilmaisun tasot olivat yhteydessä imusolmuke etäpesäke ja kliiniseen vaiheeseen, sekä yleistä eloonjäämistä ja replase elinaika GC . Olemme myös havainneet, että ektooppinen ilmentyminen miR-26a inhiboi GC soluproliferaatiota ja GC etäpesäkkeiden in vitro
ja in vivo
. Olemme edelleen tunnistaneet uuden mekanismin miR-26a tukahduttaa GC kasvua ja etäpesäkkeiden. FGF9 on osoittautunut välittömänä kohteena miR-26a, käyttäen lusiferaasianalyysissä ja western blot. FGF9 yliekspressio miR-26a-ilmentäviä soluja voisi pelastaa hyökkäyksen ja kasvuhäiriöt Mir-26a. Lisäksi miR-26a ilmaisu korreloi käänteisesti FGF9 proteiinin tasot GC. Yhdessä meidän tiedot viittaavat siihen miR-26a toimii tuumorisuppressori GC kehitykseen ja etenemiseen, ja lupaava ennustetyövälineenä biomarkkereiden ja potentiaalia terapeuttisena kohteena GC.

Citation: Deng M, Tang Hl, Lu xh, Liu My, Lu Xm, Gu Yx, et ai. (2013) miR-26a vaimentaa tuumorikasvun ja metastaasin mukaan kohdistaminen FGF9 mahasyövän. PLoS ONE 8 (8): e72662. doi: 10,1371 /journal.pone.0072662

Editor: H. Sunny Sun, Institute of Molecular Medicine, Taiwan

vastaanotettu: 29 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 12 heinäkuu 2013; Julkaistu: 28 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Deng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Nature Scientific Foundation of China (81101526, 31100936) ja Guangzhou Medical College lääkäri Start Foundation (2012C11). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

miRNA endogeenisesti ilmaistaan, pienet ei-koodaavaa RNA: ita, jotka negatiivisesti säädellä geeniekspressiota hajottava kohde- mRNA: iden, esto käännöksen näiden mRNA: iden tai molempien [1]. miRNA ottaa osaa ratkaiseva solun prosesseissa, kuten stressin vastaus, kehittäminen, erilaistuminen, apoptoosi, ja leviämisen [2]. Altered miRNA ilmentymistä on raportoitu lukuisia syöpäsairauksia, mukaan lukien rinta- [3], [4], keuhkosyöpä [5], maksan [6], vatsa [7], paksusuolen [8], aivojen [9], leukemia [10], ja lymfooma [11]. Yhä useammat tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA voivat toimia onkogeenien tai tuumorisuppressorien, ja ne ovat usein väärin säädellystä kasvaimissa [12], [13]. Tältä osin onkogeenisiä miRNA usein voimistunut, kun taas kasvaimeen tukahduttamalla miRNA ovat vaimentua kasvaimissa. Esimerkiksi anna-7 on raportoitu ali-ilmentynyt keuhkosyövässä ja kohdistaa onkogeenisel- Ras [14], [15]. Olemme aiemmin raportoitu että miR-216B on voimakkaasti vaimentua nenänielun karsinooma ja vaimentaa kasvaimen kasvua kohdistamalla KRAS [16]. Sen sijaan, onkogeeninen miR-17-92 klusterin miRNA ilmentyminen li- sääntyy erilaisia ​​kasvaimen [17], ja panna täytäntöön ilmentymistä näiden miRNA on hyvin tutkittu Eμ-myc-siirtogeenisen hiiren mallia B-solujen lymfooma dramaattisesti kiihdyttää taudin puhkeaminen ja eteneminen [18]. Kuitenkin rooli miR-26a syöpäsoluissa näytti kiistanalainen, koska se on tuumorisuppressorina maksasolukarsinoomassa [19], rintasyöpä [20] ja nenänielun karsinooman [21], [22], mutta on onkogeenin gliooman [23 ] ja kolangiokarsinooma [24]. Tähän asti rooli miR-26 mahasyövän oli määrittelemätön.

Tässä tutkimuksessa tutkimme miR-26a ilmentymistä 40 pariksi normaalissa ja GC näytteitä kvantitatiivisella RT-PCR (qRT-PCR) analyysi . miR-26a havaittiin olevan voimakkaasti vaimentua GC kudoksiin verrattuna, että vierekkäisten normaali mahan kudoksissa. Tämä tulos vahvistettiin lisäksi in situ -hybridisaatiolla kudossiruina koostuu 126 tapausta GC kudosten ja 41 tapauksissa vierekkäisten normaaleissa kudoksissa. Lisäksi vähentynyt miR-26a liittyi huonoon ennusteeseen ja saattaisi itsenäisesti ennustaa yleistä (OS) ja replase-elinaika (RFS) mahasyövän. Funktionaaliset tutkimukset paljastivat, että miR-26a tukahdutetaan GC solujen kasvua ja etäpesäkkeiden kohdistamalla FGF9.

Tulokset

miR-26a on vaimentua Human mahasyövän

Käyttämällä qRT-PCR menetelmä, miR-26a tasot havaittiin 40 paria mahasyövän kudosten ja niiden yhteensovitettujen viereisiin kudoksiin, sekä mahan solulinjat. Niistä 40 potilasta, joilla mahalaukun syövän, noin 70% (28 potilasta 40: stä) Kasvainten paljasti enemmän kuin kaksinkertaisesti väheneminen miR-26a tasoa, jossa on 5,76-kertainen vähennys suhteessa viereisiin normaaleissa kudoksissa, mikä viittaa siihen, että vähentäminen miR -26A oli yleinen tapahtuma ihmisen GC (kuvio 1A). Lisäksi miR-26a ilmentyminen väheni kaikissa mahasyövässä solulinjoissa (MKN-28, SGC-7901, AGS, MGC-803, MKN-45, ja BGC-823) verrattuna ei-pahanlaatuisten mahalaukun solulinjaa GES-1 (kuvio 1B). Edelleen varmistamiseksi koskevat tulokset biologisen roolin miR-26a ihmisen mahasyövän, käytimme in situ hybridisaatio arvioida miR-26a ilmentymistä 126 GC ja 41 ei-kasvain kudosten kudossiruina (TMA). Tuloksista ilmeni, että ilmaisulla tulokset miR-26a merkittävästi vähentynyt GC verrattuna normaaleissa kudoksissa (kuvio 1 C). Seuraavaksi määritetään mahdolliset kliinis vaikutuksia muuttunut miR-26a ilme. Kliiniset näytteet jaettiin heikkoa ilmentymistä ja korkea ilmaisun perusteella ryhmiin miR-26a ilmentymisen tulokset suurempi tai pienempi kuin mediaani. Yhdenmukainen nämä tiedot ulos 41 koko tavanomaisen vatsa näytettä, 35 (85%) oli korkea ilmentyminen miR-26a. Sen sijaan 60% (76 126) mahalaukun karsinooma yksilöitä oli alhainen negatiivinen ilmaus miR-26a. 126 yksilöiden GC, 38 olivat negatiivisia imusolmuke etäpesäke, ja 45% näistä potilaista oli alhainen negatiivinen ilmaus miR-26a (taulukko 1). Kahdeksankymmentä-kahdeksan potilasta oli positiivinen imusolmuke etäpesäke, ja 67% heistä osoitti downregulation tai menetys miR-26a (taulukko 1). Lisäksi löysimme alhainen ilmentyminen miR-26a 37% ja 77% mahalaukun kasvaimet luokiteltu vaiheen I /II ja vaiheen III /IV (taulukko 1). Siksi miR-26a ilmaisu kääntäen korreloi imusolmuke etäpesäke ja kliinisessä vaiheessa ( P
= 0,019 ja P
< 0,001, tässä järjestyksessä). Kuitenkin miR-26a ei korreloinut iän, sukupuolen, solujen erilaistumiseen tai invaasio syvyys (T vaihe). Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-26a saattaa olla ratkaiseva merkitys GC etäpesäkkeitä ja etenemiseen.

Vähentynyt miR-26a korreloi Poor Clinical Ennuste

analysoimiseksi edelleen merkitystä miR-26a kliinisistä ennuste, Kaplan-Meier eloonjääminen analyysi tehtiin käyttämällä potilaan eloonjäämiseen ja uusiutumisen elinaika. Tulokset osoittivat, että potilailla, joilla on alhainen miR-26a ilme oli lyhyempi mediaani ja RFS kuin potilaat, joilla on korkea miR-26a lauseke (21,6 kuukautta vs. 39,0 kuukautta, P
< 0,001 OS; 15,2 kuukautta vs . 31,6 kuukautta, P
= 0,002 RFS, kuvio 1 D). Käytimme Coxin suhteellisen vaarat regressio arvioida tarkemmin yhdistyksen välillä miR-26a ilmaisun ja ennustetta. Vuonna univariate analyysi, imusolmuke etäpesäke, TNM ja miR-26a tasot olivat merkitsevästi yhteydessä OS ja RFS (taulukko 2, 3). Lopullinen Monimuuttuja malli osoitti, että kaiken kaikkiaan elinaika merkittävästi riippuvainen imusolmuke etäpesäke, TNM ja miR-26a tasoa (taulukko 2), ja uusiutumisen elinaika aika tekivät imusolmuke etäpesäke ja miR-26a tasoa (taulukko 3).

miR-26a vaimentaa GC Growth and Metastasis

panevat merkille käänteinen korrelaatio miR-26a tasoa ja etäpesäkkeiden, tutkimme vaikutus miR-26a uudelleen ilme maahanmuutto- ja hyökkäys kyvyt GC solulinjat. Kaksi GC solulinjoja (SGC-7901 ja AGS) suhteellisen alhainen perusilmennystä miR-26a (kuvio 1 B) infektoitiin joko miR-26a tai ohjaus lentivirus ja valitaan 5 mg /l puromysiiniä kaksi viikkoa. Seuraavaksi haavojen määritys ja siirtokuoppaan määritys tehtiin. Kuten odotettua, yliekspressio miR-26a suppressoi merkittävästi Solujen migraation ja invaasion kyvyt (kuvio 2A, B, kuvio S1).

vaikutuksen osoittamiseksi miR-26a GC kasvuun, teimme GC-solujen lisääntymisen määrityksessä. Lisääntyminen testi osoitti, että ektooppinen ilmentyminen miR-26a SGC-7901 ja AGS heikennettyjä soluproliferaatiota verrattuna ohjaus soluja (kuvio 2C). Lisäksi kohdunulkoinen miR-26a ilmaus estivät pesäkkeenmuodostusta kyky pehmeässä agarissa (kuvio 2D). Suoritimme sitten apoptoosia analyysi ja paljasti, että miR-26a yliekspressio SGC-7901 indusoi apoptoosia (kuvio 2E).

Seuraavaksi testasimme miR-26a voisi olla rooli kasvainten synnyssä käyttäen paljaan hiiren ksenografti malleja. Olemme havainneet, että yli-ilmentyminen miR-26a SGC-7901-soluissa merkittävästi tukahdutti kasvaimen kasvua nude-hiirissä (kuvio 3A, kuvio S2). Sitten SGC-7901-soluja infektoitiin joko miR-26a tai valvontaa lentivirsus injektoitiin häntälaskimoon nude-hiirten tutkia keuhkometastaasitestissä. Kuten on esitetty kuviossa 3B, huomattavasti pienempi määrä makroskooppisen keuhkometastaasien voitiin havaita miR-26a yli-ilmentävät solut kuin kontrollisolut. Nämä tulokset osoittavat, että miR-26a voi tukahduttaa GC kasvua ja etäpesäkkeiden.

miR-26a Suoraan tavoitteet ja Estää FGF9

ymmärtää, miten miR-26a tukahduttaa GC kasvua ja etäpesäkkeiden, käytimme kolme algoritmeja (Targetscan, Pictar ja Miranda) auttaa tunnistamaan miR-26a tavoitteet ihmisen syöpien. Näiden kohdegeenien, jotka ennustivat kaikki kolme algoritmeja (taulukko S1), FGF9 herättänyt huomiota heti, kun se on tuumorigeneesiin tai etäpesäkkeiden [26] - [28]. Olemme kloonattiin täyspitkä FGF9 3'-UTR osaksi lusiferaasireportteri- vektori. Lusiferaasianalyysi paljasti, että miR-26a suoraan sidottu FGF9 3'-UTR: n, ja jolla se vähensi huomattavasti lusiferaasiaktiivisuudet (kuvio 4A). Kuitenkin mutaatio oletetun miR-26a sivustoja 3'-UTR FGF9 kumotaan lusiferaasin vastata miR-26a (kuvio 4A). Suoraan vaikutuksen arvioimiseksi miR-26a on FGF9 ilmaisun, suoritimme western blot-analyysi. Kuten nähdään kuviossa 4B, lentivirus- indusoidun ektooppisen miR-26a dramaattisesti tukahdutti FGF9 proteiinin tasot SCG-7901 ja AGS soluja. Lisäksi knockdovvn miR-26a kautta transfektio anti-miR-26a, in GES-1-solujen määrä nousi FGF9 proteiinin tasoja (kuvio 4B; kuvio S1). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että FGF9 on suora alavirran kohde miR-26a GC-soluissa. Edellä esitetyt tulokset sai meidät tutkimaan, miR-26a tukahduttaa GC kasvua ja etäpesäkkeiden kautta tukahduttaa FGF9 ilme. Tätä tarkoitusta varten FGF9 uudelleen ilmaistu miR-26a-transfektoiduissa SGC-7901-soluja. In miR-26a-ilmentävien solujen uudelleen ilmentyminen FGF9 pelastettiin hyökkäyksen ja kasvuhäiriöt ja miR-26a (kuvio 4C, D, E). Lopuksi testasimme jos miR-26a ilmaisu korreloi FGF9 proteiinin tasot GC. Oli käänteinen korrelaatio FGF9 proteiinin tasot, esitetty immunohistokemiallisesti värjäämällä, ja miR-26a ilmentymistä arvioitiin in situ -hybridisaatiolla 126 GC kudosten TMA, kuten edellä on käytetty (kuvio 4F, Figure1C). Meidän havainnot osoittavat, että miR-26a on ominaisuuksia yhdenmukainen kasvaimia estävä toiminto. Kyky moduloida FGF9 pitoisuus saattaa selittää ainakin osittain, miksi miR-26a voi estää GC kasvua ja etäpesäkkeiden.

Keskustelu

miR-26a kuuluu miR-26 perhe, joka sisältää toisen jäsenen miR-26b, jotka molemmat talon identtinen sekvenssi lukuun ottamatta 2 eri nukleotidien kypsä miRNA. miR-26a on toiminnallinen miRNA joka on ansainnut aiemmassa tutkimuksessa [29]. Tiedetään, että miR-26a on merkittävä rooli kasvun, kehityksen ja solujen erilaistumista eri kudoksissa [29]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että miR-26a ilmentyminen epäjärjestykseen useissa ihmisen kasvaimissa [19], [22], [24], [30], [31]. Kuitenkaan mikään näistä tutkimuksista liittyy syöpään. Nykyisessä tutkimuksessa käytimme qRT-PCR ja ISH osoittamaan, että miR-26a tasoa mahasyövässä kudoksissa olivat merkittävästi alhaisemmat kuin ei-tuumorikudoksissa. Lisäksi miR-26a-tasot liittyvät kliinisessä vaiheessa ja läsnä imusolmukemetastaaseja. Kaplan-Meier selviytymisen analyysi osoitti, että potilailla, joiden ensisijainen kasvaimet näkyvät alhainen ilmentyminen miR-26a oli lyhyempi OS ja RFS GC. Lisäksi Coxin suhteellisen vaarat regressioanalyysi osoitti, että alennettu miR-26a kasvaimissa oli vahva ja itsenäinen ennustaja lyhyempiä käyttöjärjestelmän ja RFS. Perustuen array data, se oli aiemmin raportoitu, että yhdistelmä useista miRNA voivat olla käyttökelpoisia ennustetekijöitä markkereita mahasyövän [32], [33]. Lisäksi, yhden miRNA, kuten miR-218, voi olla prognostinen indikaattori [34]. Nämä miRNA on tutkittu vain joitakin mahalaukun syöpäpotilailla. Täällä miR-26a voivat olla käyttökelpoisia ennustetyövälineenä merkki ennustaa selviytymisen ja uusiutumisen mahasyövässä.

Tämä tutkimus osoitti, että ektooppinen ilmentyminen miR-26a GC soluissa heikentynyt muuttoliike, invaasio, proliferaatio ja pesäkkeen kasvua sekä aiheuttamaa apoptoosia. Lisäksi in vivo -tiedot osoittivat miR-26a esti kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden. Näiden in vitro ja in vivo -tiedot osoittivat lisäksi, että miR-26a toimii tuumorisuppressori mahasyövässä. Useat tutkimukset tukevat tuloksia. Esimerkiksi tämä miRNA on vähentynyt NPC kudoksissa ja voi vaimentaa solujen kasvua ja kasvaimen kehittymisen kohdentamalla EZH2 [22]. Maksasyövän myös näyttelyitä vähentynyt ilmentyminen miR-26a [19]. Systeeminen anto tämän miRNA hiirimallissa HCC käyttäen adeno-associated-virus (AAV) johtaa inhibitioon syöpäsolujen proliferaation induktio kasvainspesifisen apoptoosin, ja dramaattinen suoja taudin etenemistä ilman toksisuutta [35]. Kuitenkin useat viimeaikaiset tutkimukset paljastivat kasvaimia synnyttävän roolia miR-26a kasvaimia, kuten gliooman ja kolangiokarsinooma. Huse et al. kertoi, että miR-26a yliekspressoitiin korkealaatuisesta gliooman ja suoraan suunnattu PTEN [23]. Samoin, miR-26a havaittiin olevan yli-ilmentyneen ihmisen kolangiokarsinooma kudoksissa ja edistää kolangiokarsinooma kasvua aktivoimalla B-kateniinin [24]. Nämä kiistelty tulokset viittaavat siihen, että rooli miR-26a oli mahdollisesti kasvain spesifinen ja hyvin riippuvainen sen tavoitteet eri syöpäsoluja. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että PTEN [23], EZH2 [21], [22], SMAD1 [36], CDK6 ja sykliini E1 [37] ovat mahdollisia alavirran kohdegeenien miR-26a. Tässä tutkimuksessa FGF9, uusi suora ja toimiva kohteena miR-26a, tunnistettiin GC. FGF9, joka tunnetaan myös nimellä glial aktivoiva tekijä, on yksi 23 jäsentä erittäin konservoituneita FGF-perheen. Koska eritetty, glykosyloitu 26-kDa: n proteiinin, sillä on mitogeeninen vaikutus erilaisia ​​solutyyppejä [26]. FGF9 on osoitettu olevan osallisena erilaisissa syövissä, kuten munasarjan endomet- adenokarsinooma [26], maksasyövän [27] ja eturauhassyöpä [28]. Meidän tutkimuksissa olemme vahvistaneet, että FGF9 oli välittömänä kohteena miR-26a GC soluissa. Sen määrittämiseksi, onko miR-26a tukahduttaa GC kasvua ja etäpesäkkeiden kautta tukahduttaa FGF9 ilmaisun, huomasimme, että FGF9 yliekspressio voi pelastaa hyökkäyksen ja kasvuhäiriöt Mir-26a. Nämä tulokset viittaavat siihen, miR-26a estää GC kasvua ja etäpesäkkeiden osittain kohdentamalla FGF9.

Yhdessä havaitsimme downregulation miR-26a mahasyövän solujen ja osoitti, että miR-26a voi toimia itsenäisesti ennusta OS ja RFS. Olemme lisäksi havainneet, että miR-26a hallussaan teho tukahduttaa GC kasvua ja etäpesäkkeiden säätelemällä FGF9. Tulosten perusteella näyttää miR-26a toimii tuumorisuppressori GC ja lupaava ennustetyövälineenä biomarkkereiden ja potentiaalia terapeuttisena kohteena GC.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

mahalaukun epiteelisolujen linja GES-1 hankittiin Beijing Institute for Cancer Research (Peking, Kiina). GC solulinjat MKN-28, SGC-7901, AGS, MGC-803, MKN-45, ja BGC-823 saatiin Kiinan Academy of Medical Science (Peking, Kiina). Näitä soluja ylläpidettiin 37 ° C: ssa ilmakehässä, jossa 5% CO 2 RPMI-1640 (MGC-803, BGC-823, MKN-28, SGC-7901), DMEM (GES-1) tai F12 ( AGS) väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia, penisilliiniä ja streptomysiiniä (Gibco BRL, NY, USA). Kaikki transfektioissa käytetyt Lipofectamine 2000 ((Invitrogen, Carlsbad, USA)).

Kliiniset näytteet

Kaikki kudosnäytteitä, joita käytetään tässä tutkimuksessa kerättiin Hunan Kasvaimen Hospital (Changsha, Hunan, Kiina). Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta TET. Tutkimus hyväksyttiin eettisen komitean Guangzhou Medical University Health Authority. Kerääminen ja käyttö kudosten seurasi menettelyt, jotka ovat mukaisia ​​eettisiä standardeja muotoiltua Helsingin julistuksen.

kudosnäytteitä 40 mahasyöpäpotilaista (23 mies- ja 17 naisten; mediaani-ikä 59 vuotta; alue 40-84 vuotta) käytettiin kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n (qRT-PCR) analyysi. Resektoitiin syöpäkudokset (kasvain) ja pariksi vastaaviin normaaleihin maha- kudokset (Normaali) on välittömästi leikattiin, jäädytettiin nestemäisessä typessä ja pidettiin -80 ° C: ssa, kunnes RNA.

kudossiruina (TMA), joka koostuu 126 GC ja 41 viereisten normaali mahan kudoksissa, käytettiin in situ -hybridisaatiota varten. Mediaani-ikä mahasyövän potilaiden diagnoosi oli 57 vuotta (vaihteluväli 31-82). Mediaani seuranta-ajan yleisen (OS) ja uusiutumisen-elinaika (RFS) oli 22 kuukautta ja 15 kuukautta. Kaikki tiedot 126 GC näytteiden, kuten ikä, sukupuoli, kasvainpaikkaa, histologinen luokka, invaasio syvyys (T vaihe), kliinisessä vaiheessa, ja imusolmuke etäpesäke saatiin kliinisten ja patologisten kirjaa ja yhteenveto täydentävien taulukossa 2.

Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi

Kokonais-RNA uutettiin soluista käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, USA). Käänteistranskriptio ja qRT-PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen qSYBR vihreä PCR -kittiä (Qiagen, Germantown, USA) ja U6 snRNA käytettiin endogeenista ohjaus. Kertainen muutos määritettiin 2 -ddCt. Ct on murto syklin, jossa fluoresenssi kunkin näytteen kulkee kiinteän kynnyksen. DdCt laskettiin vähentämällä DCT vertailunäytteen (pariksi ei-kasvainkudoksessa kirurgisissa näytteissä ja GES-1 solun kuusi mahalaukun syövän solulinjat) päässä DCT kunkin näytteen. Sekvenssit spesifisiä alukkeita miR-26a ja U6 snRNA olivat 5'-CTTCAAGTAATCCAGGATAGGC-3 'ja 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3', vastaavasti.

In situ
hybridisaatio ja immunohistokemia

Detection of miR-26a in situ -hybridisaatiolla käyttäen DIG-leimattua lukittu nukleiinihappo (LNA) -pohjaisen koetin on spesifinen miR-26a (Exiqon, Vedbaek, Tanska) suoritettiin valmistajan ohjeiden ja U6 snRNA käytettiin positiivisena kontrollina. Brie fl y, kudos microarray dioja poistettiin parafiini, käsiteltiin proteinaasi K: n (5 min 2 ug /ml proteaasia K), pestiin PBS: ssä ja tämän jälkeen tukittiin endogeenisen peroksidaasin kanssa 3% H 2O 2. Hybridisaatio suoritettiin 52 ° C: ssa yön yli sen jälkeen, kun on lisätty 50 nM DIG-leimatun LNA-koettimien, jonka jälkeen tiukkuuden pesu SSC-puskureita. Kun oli salvattu (2%: lla lampaan seerumia ja 2 mg /ml BSA: lla PBS Tween-20) huoneenlämpötilassa, koetin kohde-kompleksin visualisoitiin käyttämällä anti-DIG-POD-vasta-ainetta, ja DAB monimutkainen.

immunohistokemia suoritettiin kudosten microarray osia käyttäen anti-FGF9-vasta-ainetta (Santa Cruz, CA, USA). Kompleksi visualisoitiin streptavidiini /peroksidaasi ja DAB monimutkainen, ja ytimet vastavärjättiin hematoksyliinillä. In situ -hybridisaatio ja immunohistokemia tuloksia tekee intensiteetti (0-4) ja prosenttiosuus värjäytymistä (0-100%). Suhteellinen ilmentyminen saadaan kertomalla intensiteetti prosenttiyksiköllä. Objektilasit analysoitiin kahden riippumattoman patologia.

rekombinanttivektori

Yhdistelmä lentiviruksien sisältävä miR-26a esiaste tai scramble sekvenssit hankittiin SunBio (Shanghai, Kiina). Lusiferaasin analyysi, täyspitkä FGF9 3'-UTR monistettiin ihmisen verestä genomisesta DNA: sta ja kloonattiin sitten alavirran alueelle tulikärpäsen lusiferaasin kasetti pMIR-REPORT sivektorissa (Ambion, Austin, TX, USA). Vastaava mutantti-konstrukteja, joissa ensimmäiset kuusi nukleotidia, jotka ovat komplementaarisia miR-26a siemen-alue mutatoitiin by mutageneesillä (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Jotta rakennettaisiin FGF9-ilmentävällä vektorilla, FGF9 ORF-cDNA hankittiin GeneCopeia (Rockville, MD, USA) ja subkloonattiin eukaryoottiseen ekspressiovektoriin pcDNA3.1 (+) (Invitrogen).

Luciferase Reporter Assay

miR-26a tai sekoituskoodin lentivirukset ja pMIR-3'UTR vektori kotransfektoitiin HEK-293T-soluihin. Renilla ja tulikärpäsen lusiferaasi toimintaa mitattiin Dual-lusiferaasireportterisysteemillä (Promega, Madison, WI) 24 h transfektion jälkeen. Firefly lusiferaasiaktiivisuudeksi normalisoida Renilla lusiferaasiekspressio jokaisesta näytteestä. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Western Blot

Western blotting suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [16]. Lyhyesti, proteiini lysaatit erotettiin 10% SDS-PAGE, ja sähkö-trophoretically siirrettiin PVDF (polyvinylideenidifluoridi) kalvo. Sitten membraania inkuboitiin hiiren vasta-ainetta vastaan, anti-FGF9-vasta-ainetta (Santa Cruz, CA, USA) ja sen jälkeen HRP (piparjuuren peroksidaasi) -leimattua vuohen-anti-hiiri-IgG: tä (Santa Cruz, CA, USA) ja kemiluminesenssilla. β-aktiini käytettiin proteiini-lastaus ohjaus.

proliferaatiomääritystä

Solut maljattiin 12-kuoppalevyille halutun solupitoisuuksilla. Solumäärät arvioitiin trypsiinikäsittely- solut ja suorittamalla analyysi käyttäen Coulter Counter (Beckman Coulter, Fullerton, USA) on ilmoitettu ajankohtina kolmena kappaleena.

Cell Migration ja Invasion Analyysit

Solun muuttoliike tutkittiin käyttäen haavan paranemista määrityksissä. Keinotekoinen "haava" on luotu konfluentin yksisolukerroksen, ja otettiin valokuvia käyttämällä käännettyä mikroskooppia (Olympus, Tokio, Japani) 24 tuntia.

solun invaasiomääritys,-solut ympättiin tyvikalvon matriisin läsnä insertti 24-kuoppaiselle viljelylevylle (EY matriisi, Chemicon, Temecula, CA), ja naudan sikiön seerumia lisättiin alempaan kammioon kemoattraktantti. Vielä 48 tuntia, ei-tunkeutuvat soluihin ja EY matriisi hellävaraisesti poistettiin pumpulipuikolla. Invasiiviset solut sijaitsee alemman puolen kammion värjättiin Crystal Violet, laskettiin ja kuvattiin.

Colony muodostumisen määritys

Six-kuoppaisia ​​levyjä peitettiin 0,6% agar-väliaineessa täydennetty 20% naudan sikiön seerumia. Solut (1 x 10 4) valmistettiin 0,3% agar ja ympättiin kolmena kappaleena. Sen jälkeen, kun levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa kahden viikon ajan, pesäkkeet laskettiin.

Apoptosis Analyysi

apoptoottiset solut arvioitiin anneksiini V-FITC: llä ja propi- jodivärjäyksen (BD, USA ) ja analysoitiin FACS Calibur väline (BD, USA). Kerätyt tiedot analysoitiin FlowJosoftware.

Hiiri ksenograftimallia

mahasyöpä malli nude-hiirissä rakennettiin edellä kuvatulla tavalla [25]. Arvioida rooli miR-26a kasvaimen muodostumisessa, SGC-7901-soluja infektoitiin miR-26a tai sekoituskoodin viruksia lisättiin ja ympättiin ihonalaisesti selän paljaiden hiirien kylkiin (5 kussakin ryhmässä). Kasvaimen koko mitattiin 5 päivän välein. 30 päivän kuluttua hiiret tapettiin, ruumiinavaus tehtiin ja tuumorit punnittiin. Kasvaintilavuudet määritettiin seuraavan kaavan A x B 2/2, jossa A on suurin halkaisija ja B on halkaisija kohtisuoraan A. Määrittämään miR-26a: n vaikutus kasvaimen etäpesäkkeitä, SGC-7901-soluissa tartunnan jossa miR-26a tai sekoituskoodin virusten injektoitiin häntälaskimoon nude-hiirten (6 kussakin ryhmässä). 45 päivän kuluttua, ruumiinavauksen tehtiin. Numerot mikrometastaaseihin keuhkoissa per HE-värjätty osio yksittäisistä hiiristä analysoitiin morfologian havainto. Kokeelliset protokollat ​​oli hyväksynyt Animal Research suojelun komitean Guangzhou Medical University. Standard eläinten hoito ja laboratorio- koskevia ohjeita noudatettiin.

Tilastollinen analyysi

Vertailut ryhmien välillä analysoitiin t-
testi ja x 2 testiä. Kokonaiselossaoloaika käyrät ja uusiutumisen vapaa käyrät piirrettiin käyttäen Kaplan-Meier menetelmä, jossa log-rank-testiä sovelletaan vertailuun. Survival mitattiin leikkauspäivänä. Muuttujat, joiden arvo on P
< 0,05 mukaan yhden muuttujan analyysiin käytettiin myöhemmissä Monimuuttuja-analyysissä, joka perustuu Coxin suhteellisten riskien mallia. Spearmanin korrelaatio testejä käytettiin arvioimaan pareittain lauseke korrelaatio miR-26a ja FGF9 GC kudoksissa. Kaikki erot olivat tilastollisesti merkitseviä tasolla P
≤0.05. Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen SPSS15.0 ohjelmistoa.

tukeminen Information
Kuva S1.
qRT-PCR mittasi miR-26a ekspressiotasot SGC-7901 ja AGS infektoimia soluja miR-26a lentivirus sekä GES-1-solut transfektoitu miR-26a estäjiä.
doi: 10,1371 /journal.pone .0072662.s001
(TIF) B Kuva S2.
qRT-PCR mittasi miR-26a ekspressiotasot kasvainkudosnäytteet uutetaan nude-hiiriin 30. päivänä kun syöpäsoluja injektion. Kaikki tulokset on esitetty keskiarvona ± SEM.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0072662.s002
(TIF)
Taulukko S1.
Target geenit, jotka ennustivat kaikki kolme algoritmeja (Targetscan, Pictar ja Miranda).
doi: 10,1371 /journal.pone.0072662.s003
(XLS) B Taulukko S2.
Ominaisuudet potilaalla on mahasyöpä.
doi: 10,1371 /journal.pone.0072662.s004
(DOC) B

Kiitokset

Kiitämme J Ma ja CK Wang niiden teknistä apua.

Other Languages