arvioiminen HER2 Citation: Matsusaka K, Ishikawa S, Nakayama A, Ushiku T, Nishimoto A, Urabe M, et al. (2016) Tumor Content Chart-avusteinen HER2 / Editor: Yves St-Pierre, INRS, CANADA vastaanotettu: 07 marraskuu 2015; Hyväksytty: 13 huhtikuu 2016; Julkaistu: 27 huhtikuu 2016 Copyright: © 2016 Matsusaka et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään. Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja. Rahoitus: Tämä työ tehtiin osana biopankin Japanin Project (http://www.src.riken.jp/english/project/person/), joka tukee opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede ja teknologia (http://www.mext.go.jp/english/), Japani virasto lääketieteelliseen tutkimukseen ja kehitykseen (http: //www.amed.go .jp /fi /), ja avustukset-in-Aid tieteellisen tutkimuksen (KAKENHI) päässä Japanin Society for Promotion of Science (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole. Mahalaukun syöpä on yksi yleisimmistä pahanlaatuisia kasvaimia ja kolmas johtava syöpään liittyvän kuoleman kaikkialla maailmassa [1]. Advanced tapauksissa ilman operatiivista väliintuloa on huono ennuste ja edellyttävät monitieteisiä hoitomuodot. HER2 on 185 kDa: n transmembraaninen glykoproteiini, joka on jäsen, epidermaalisen kasvutekijän reseptori perheen ja toimii tyrosiinikinaasireseptorin [2, 3]. Normaaleissa soluissa, HER2-proteiini toimii signaalin muuntimen aikana solujen lisääntymistä tai erilaistumista [4]; kuitenkin on onkogeenisiä ominaisuuksia, kun yliekspressoidaan. Tämä johtuu yleensä HER2 Jos potilaalla on leikattavissa syöpien, HER2 tila olisi tutkittava pienellä biopsianäytteestä. Kuten kuvattu uusimmat suositukset HER2 testaus rintasyövän American Society of Clinical Oncology (ASCO) /College of American patologi (CAP), immunohistokemia (IHC) ja /tai in situ -hybridisaatio (ISH) ovat standardin arviointimenetelmiä HER2 tila [19], mutta kummallakin on omat rajoituksensa. Esimerkiksi tehokkuutta HER2-IHC vaikuttavat useat tekijät, kuten formaliini fiksaatioprosessi, ja pisteytysjärjestelmä ei ole aina toistettavia erityisesti moniselitteisiä tapauksissa jolle ISH suositellaan [19-25]. Vuonna kirkas field HER2 Tässä tutkimuksessa käytimme mikrofluidistiikka-pohjainen digitaalinen PCR-tekniikalla (Biomark; Fluidigm, Cambridge, UK) [26] määrittää HER2 Twitter /CEP17 kopiomäärä suhde. Digitaalisessa PCR-DNA: jaetaan 770 kappaletta nanoliter reaktiokammioita, odotetun pitoisuuden 0-1 molekyylin per kammio. Kaksivärisenä kohde- ja viite geenit ovat samanaikaisesti PCR-monistettiin ja niiden kopio luvut on laskettu laskemalla kammiot positiivisia signaaleja. Tämä erittäin yksinkertaista menetelmää pystytty vertailemaan HER2 Ethics lausunto tutkimus hyväksyi Tokion yliopiston Institutional eettisen komitean. Kliiniset näytteet kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen kerättiin alla Tokion yliopiston Institutional suuntaviivat tutkimus ihmisen kudoksissa. Yhteensä 44 mahasyövän biopsianäytteistä 32 potilasta käsitellään rutiini formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettuja (FFPE) oli saatavilla analyysiä varten. Kaikki saatiin biopsianäytteet endoskooppisesti laitoksella Endoscopy ja Endoskooppinen Surgery. Neljä kirurgisista näytteistä, jotka oli resekoitu kirurgisesti laitoksella ruuansulatuskanavan leikkauksen, analysoitiin myös. Nämä näytteet fiksoitiin 10% neutraaliin puskuroituun formaliiniin. Kaikki tapaukset diagnosoitiin laitoksella patologian Tokion yliopiston sairaalan. Leikattiin paksuuteen 4 um käyttäen tavanomaisia histologisia tekniikoita; Näiden kerättiin objektilaseille ja käytetään hematoksyliini- eosiinilla (HE) värjäys, HER2-IHC, ja HER2 immunohistokemia immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin on FFPE kudokseen käyttäen Ventana BenchMark XT (Roche Diagnostics) kanssa 4D5 anti-HER2-vasta-aine. Värjäys intensiteetti ja kalvo immunoreaktiivisuus kuvioita arvioitiin käyttäen Dako pisteytysjärjestelmää mukaan ASCO /CAP suuntaviivat [19]. Ei solukalvojen värjäytyminen pisteytettiin 0; himmeä tai tuskin havaittava /keskeneräinen solukalvojen värjäytyminen pisteytettiin 1+; epätäydellisiä ja /tai heikko /kohtalainen kehän kalvon värjäytyminen pisteytettiin 2+; ja täysin ja erittäin kehän kalvon värjäytyminen pisteytettiin 3+. HER2- HER2 Voit purkaa DNA koepalanäytteistä, 10 leikesarjojen leikattu paksuus on 10 um pantiin lasipinnan HER2 -IHC ja HER2 Primer sarjaa vahvistamiseksi HER2 Koko slide kuva HE osiin, jotka olivat juuri ennen leikesarjojen DNA: n eristämiseksi, skannattiin käyttäen NanoZoomer (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japani). Tiedot tuotiin Definiens Tissue Studio 2.0 (http://www.tissuestudio.com) määritystä varten TCR. Valittu alue kirurgisista näytteistä skannattiin käyttäen BZ-710 mikroskooppi (Keyence, Osaka, Japani). Tiedot tuotiin Hybrid Cell Count ohjelmisto (BZ-H3C, Keyence). Tiedot että yksityiskohtainen solujen määrä tuotujen kuvien ja erottaa syöpä- ei-syöpäsolujen perustuu tuman koko on luotu automaattisesti Kokeet kehittämiseksi TC kaavioita Solulinjat. ohjaus kokeita, H522 keuhkosyöpä ja SK-BR-3 rintasyövän solulinjat saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). GM18997 Epstein-Barr-viruksella transformoituja lymfoblastoidisolulinjassa (LCL) saatiin Coriell Biorepository (https://catalog.coriell.org/). H522-soluja ja LCL viljeltiin Roswell Park Memorial Institute 1640 -alustaa (Nacalai Tesque, Kioto, Japani), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ja 1% penisilliini-streptomysiiniliuosta ( Nacalai Tesque). SK-BR-3-soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa /Hams F12 (Nacalai Tesque, Japani), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini /streptomysiiniä. Soluja viljeltiin 37 ° C: ssa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO 2. DNA uutettiin käyttämällä QIAquick DNA Mini Kit (Qiagen). FFPE H522, SK-BR-3, ja LCL Aikasolujen valmisteltiin HER2 Genominen DNA H522 ja SK -BR-3-soluihin ja LCL säädettiin pitoisuuteen 50 ng /ul. H522 ja LCL genomista DNA: ta sekoitettiin kahdeksassa vaiheissa seuraavassa Tilavuussuhteet: 8: 2, 7: 3, 6: 4, 5: 5, 4: 6, 3: 7, 2: 8, ja 1: 9 (H522 : LCL). SK-BR-3 ja LCL genomista DNA: ta sekoitettiin neljässä vaiheessa seuraavassa Tilavuussuhteet: 8: 2, 6: 4, 4: 6, ja 2: 8 (SK-BR-3: LCL). Tilastolliset analyysit Chi-squared testejä sovellettiin verrata määrä välillä HER2 kehittäminen TC kaavion digitaalista PCR datan HER2 Twitter /CEP17 suhde määritettiin perustuen kolme muuttujaa: TCR ja absoluuttinen kopio määrä HER2 Tässä tutkimuksessa, [ x Eq (1) edusti graafisesti TC kaavio, jossa [ r määritelty HER2 Molemmin puolin yhtälön (2) on jaettu [ Ax yhdistäminen kanssa yhtälöiden (1) ja (3), jolloin saatiin seuraavasti: (4) (5) Eq (5) oli edellytys vastaa [ B Twitter / Siksi kun Eq (6) oli tyytyväinen, HER2 Toisaalta, määritelmä HER2 yhtälön (7) on käsitelty samalla tavalla kuten yhtälöitä (2) - (5) ja ilmaistiin seuraavasti: (8) B Eq (8) oli edellytys vastaa [ B Twitter / Niinpä kun Eq (9) oli tyytyväinen, HER2 Kun yhtälöiden (6) ja (9) piirrettiin TC kaavion aluetta viivan yläpuolella kaartuu ylöspäin [ r [ x vertailu digitaalisen PCR ja HER2 validoitu teoreettinen Eq (1) ja TC kaavioon portaittain seos järjestelmä solulinjojen. EQ (1) saatiin käyttäen todellisia mitattuja arvoja [ suhteellinen kopio numerot HER2 H522 ja SK-BR-3 solujen genomi-DNA: ta sekoitettiin että LCL vaiheittain ja seokset analysoitiin digitaalisen PCR: llä. Vuonna H522-soluissa, HER2 Mahasyöpää kudosnäytteistä (n = 44) 32 potilasta analysoitiin digitaalisen PCR. HER2 Digital PCR tiedot ja TCR tapauskohtaisesti piirrettiin TC kaavion (kuvio 4), mukaan lukien tiedot for HER2 Teoreettisesti arvioidun [ B Twitter / Useita tapauksia arvioitiin kahdeksan potilasta (kuvio 4 ja S1 taulukko). Kaikki tapaukset, kunkin potilaan osoitti samat tulokset lautasen ja digitaalisen PCR paitsi Potilaan 24 (Pt-24); yksi viidestä tapauksesta ( ) oli positiivinen ja kaksi ( ja ) olivat negatiivisia molemmat mittaukset. Kaksi tapausta negatiivisia lautasen myönnettiin positiivinen (!) ja moniselitteisiä ( ) alueilla TC kaavion (taulukko 3 ja S1 taulukko). Kaikkiaan 22 HER2-IHC tapauksissa oli pistemäärä 2+ (taulukko 4), joka käsittää kolme positiivista, 15 negatiivinen, ja neljä moniselitteinen tapauksissa perustuu TC kaavio digitaalisen PCR. Positiiviset ja negatiiviset tulokset olivat täysin yhtäpitävät niiden kanssa HER2 kasvaimensisäisenä HER2 heterogeenisuus arvioitiin yhdistämällä HER2-IHC /-DISH ja digitaalinen PCR (kuvio 5, S1 Kuva ja S2 taulukko). Case_1, 2, ja 4 osoitti selvästi kasvaimensisäisenä heterogeenisuus koostuu HER2-IHC-positiivinen ja -negatiivinen vaurioista klusterin, kun taas Case_3 yleensä osoitti epäselvä HER2-IHC ilme kuvio. Tärkeää on, että HER2-positiiviset vauriot olivat pääsee mahalaukun in Case_1 (-2,-3), Case_2 (-1,-2), ja Case_4 (-4). Kaikki HER2-IHC /-DISH-positiivisten tapausten piirrettiin positiiviseen alueella. Kolme näytettä Case_3 (-1, -2, ja -3) osoittavat HER2-IHC (epäselvä) ja HER2 keskustelu tutkimus on ensimmäinen yrittää luokittelu mahasyövistä osaksi HER2 digitaalinen PCR-menetelmällä on sovellettu arviointiin kopioluvun virus [28], sikiön kromosomaalinen aneuploidia [29], ja onkogeenejä eri syöpä kudoksiin [30, 31]. Merkittävä ongelma, joka on voitettava, on korjauskerroin raakadatan mukaisen kasvaimeen sisällön yksilöt; mahasyöpä kudokset sisältävät yleensä suurempia määriä ei-syöpäsolujen infiltraatiota, esim. interstitiaalinen tai tulehdussolujen. Esillä olevassa tutkimuksessa käytettiin kuva-analyysi, jolloin saatiin puoliautomaattinen arvio kasvainsolun sisällön ja kehittänyt TC kaavion luokitella tietojen kolmeen luokkaan-ts. Vahvistetaan, ei-monistettiin, ja moniselitteisiä. Voisi olla mahdollista puhdistaa syöpäsolujen FFPE kudosleikkeiden mikropreparoinnilla mutta tämä on liian työlästä tavanomaisesta kliinisessä käytännössä, vaikka se on täsmällisempi teoriassa. Käyttämällä tätä lähestymistapaa koepalanäytteistä määrä HER2-IHC-moniselitteisiä tapausta (2 +) väheni 22 kuuteen, jolloin tarve vahvistuksen HER2 On lisäetuja digitaaliseen PCR. Ensinnäkin, se on helppo suhteessa ISH, joka vaatii taitoa ja on työvoimavaltaista, joka käsittää useita vaiheita. Toiseksi vähemmän tapauksia tarvitaan validointi kuin tarvitaan HER2
geenin monistaminen on olennainen osa terapeuttista päätöksenteon levinneen tai metastaattisen mahasyöpä. Yksinkertainen menetelmä on sovellettavissa pieniin formaliinikiinnitetyt, parafinoidut biopsianäytteistä on toivottavaa, koska lisänä tai korvikkeena nykyisin käytössä HER2 immunohistokemia ja in situ hybridisaatio protokollia. Tässä tutkimuksessa kehitimme mikrofluidistista-pohjainen digitaalinen PCR-menetelmän määrittämiseksi HER2
ja kromosomi 17 sentromeerin (CEP17) kopioida numeroita ja arvioimalla kasvaimen pitoisuussuhde (TCR). HER2 Twitter /CEP17 suhde määritetään kolme muuttujaa-TCR ja ehdoton kopio numerot HER2
ja CEP17-tutkimalla kasvainsoluja; vain suhde kaksi jälkimmäistä voidaan saada digitaalisen PCR: llä käyttäen koko näytettä ilman puhdistamiseksi kasvainsolujen. TCR määritettiin puoliautomaattinen kuva-analyysi. Olemme kehittäneet Tumor Content kaavio, joka on tasossa suorakulmakoordinaatit koostuu HER2
/CEP17 digitaalisen PCR tiedot ja TCR että rajataan monistettu, ei-monistettiin, ja moniselitteisiä alueilla. Soveltamalla tätä menetelmää, 44 kliinisen mahasyövän koepalojen luokiteltiin monistettiin (n = 13), ei-monistetaan (n = 25), tai epäselvät (n = 6). Vertailun vuoksi 11 näytteet olivat positiivisia, 11 olivat negatiivisia, ja 22 oli equivocally immunohistokemiallisesti. Siten meidän uusi menetelmä vähensi moniselitteisiä näytteiden 22-6, jolloin vältetään tarve vahvistuksen fluoresenssi- tai dual-anturi in situ < 30%: ssa tapauksista. Kasvain sisältö taulukkoon-avusteinen digitaalinen PCR-analyysi voidaan soveltaa myös useita sivustoja kirurgisesti resekoituun kudoksissa. Nämä tulokset osoittavat, että tämä analyysi on käyttökelpoinen vaihtoehto HER2 immunohistokemia syöpien, jotka voivat toimia perustana automaattiseen arviointiin HER2
tila.
CEP17 Digital PCR-analyysi mahasyövän biopsianäytteistä. PLoS ONE 11 (4): e0154430. doi: 10,1371 /journal.pone.0154430
Johdanto
geenimonistuksen, joka on raportoitu useita erilaisia pahanlaatuinen kasvain [5] mukaan lukien rintasyövän [6, 7], sylkirauhasten adenokarsinooma [8], virtsarakon syöpä [9] , ja mahasyövän [10]. HER2-yliekspressoivassa syöpien osuus 8% -31% kaikista tapauksista [11-15]. Vuonna Trastutsumabi mahasyövän tutkimuksessa trastutsumabi (Roche Diagnostics, Basel, Sveitsi) -a humanisoitu anti-HER2 monoklonaalinen vasta-kasvatti eloonjäämisaste HER2-positiivinen mahalaukun syövistä, kun sitä annetaan yhdessä kemoterapian [16], ja oli myös hyväksytty hoitoon rintasyövistä [17, 18]. Arvioiminen HER2 tila on siis olennainen osa mahalaukun syövän hoidossa.
dual-anturi ISH ( HER2
-DISH), HER2
ja kromosomi 17 sentromeerin (CEP17) kopioi numeroita voidaan havaita signaaleja alla valoa mikroskooppi koko alueen näytteen. Kuitenkin, vaikka tämä menetelmä on ylivoimainen herkkyys, se on kallista ja suhteellisen aikaa vievää.
ja CEP17 kopio numeroita käyttäen erilaisia alukesarjoilla. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli vahvistaa toteutettavuus digitaalisen PCR teknologian analysointia mahasyövän biopsianäytteistä. Kuitenkin yksi ongelma tässä lähestymistavassa on se, että kudos sisältää tavallisesti ei-syöpä stroomasolujen, jotka häiritsevät molekyyli- analyysejä. Voit voittaa tämän ongelman, kehitimme kaksiulotteinen sirontakuvaajan kutsutaan Kasvaimen sisältö (TC) kaavio, joka jakaa dataa monistettu, vahvistamattoman, ja moniselitteisiä luokat. Tavoitteena oli kehittää automatisoitu keinon arvioida HER2
tila, jossa on TC kaavio-avusteisen HER2 Twitter /CEP17 digitaalinen PCR-analyysi toimii ensimmäisessä vaiheessa.
Materiaalit ja menetelmät
Kliininen mahasyövässä biopsianäytteissä ja kirurgisista näytteistä
-DISH.
lautasen värjäystä ja arviointia
-DISH suoritettiin FFPE kudos käyttämällä HER2 DNA lautasen kit (Roche Diagnostics) mukaan valmistajan ohjeiden ja näytteet arvioitiin valomikroskoopilla. HER2
signaaleja esiintyi mustia pisteitä tai klustereiden ja CEP17 signaaleja esiintyi punaisina pisteinä. Kaksikymmentä ei-päällekkäistä syöpä ytimiä pisteytettiin HER2
ja CEP17 signaaleja ja HER2
geenin monistaminen luokiteltiin suositellut ASCO /CAP suuntaviivat [19]; positiivinen, [ HER
2 /CEP17 suhde ≥ 2,0] ja /tai [keskimäärin HER
2 kopiomäärä ≥ 6,0 signaaleja /solu]; epäselvä, [ HER
2 /CEP17 suhde < 2.0] ja [keskimäärin HER
2 kopiomäärä ≥ 4,0 ja < 6.0 signaaleja /solu]; negatiivinen, [ HER
2 /CEP17 suhde < 2.0] ja [keskimäärin HER
2 kopiomäärä < 4.0 signaaleja /solu].
valmistaminen DNA FFPE kliinisestä materiaalista
-DISH. Kasvaimen sisältö vahvistettiin ennen ja jälkeen otsikointikäskyt värjäämällä viereisen diat HE. Koska yksi parafiiniblokkiin sisältää tavallisesti useita paloja biopsianäytteen, yksittäiset näytteet eristettiin käyttäen lasileikkuri. DNA: n uuttamiseksi kirurgiset resektoitiin näytteistä, 5 leikesarjojen kunkin edustavan kudoksesta-lohko leikattiin paksuuteen 10 pm, joka sijoitettiin levy valmistettu polytetrafluorieteenistä (PTFE, Sanplatec, Osaka, Japani). Kalvo on kemiallinen kestävyys ksyleeni-pohjainen deparaffinization, ja on helppo leikata paloiksi. Tutkimuksessa eri osat olivat ClipArt pois arkkien mukaan HER2 profiili. Lasi tai PTFE kappaletta koottiin 2,0 ml putkeen, ja DNA eristettiin käyttäen QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA).
HER2
kopiomäärä arviointi digitaalisen PCR
ja CEP17 on esitetty taulukossa 1. Kukin aluke suunniteltiin siten, että saadut PCR-tuotteet olivat riittävän lyhyt (59 ja 65 bp) poistamiseksi vaikutusta DNA: n fragmentoituminen on FFPE prosessissa. Digitaalinen PCR suoritettiin käyttäen EP1 järjestelmä, jossa 48,770 digitaalisen array integroitu fluidiseen piiriin (Fluidigm). Jokainen siru sisälsi 48 paneelit, jotka jaettu edelleen 770 reaktio kammioihin. Positiivisten fluoresoivien signaalien kussakin paneelissa on käytetty määrittämään eri DNA-sekvenssejä. Protokolla on kuvattu muualla [26]. Lyhyesti, 4-il Reaktioseokset valmistettiin kutakin määritystä, joka sisälsi 1 x TaqMan geeniekspression master mix, 1 x HER2-FAM ja chr17cent-VIC Taqman, ja 1 x näyte lastaus reagenssia (Fluidigm). Reaktioseos jakautuu tasaisesti osaksi 770 reaktio kammiot ja digitaalisen array oli lämpö- kierrättää koskevasta EP1 System FC1 cycler. Kaksi kohdealueella oli itsenäisesti monistettiin ja 6-karboksifluoreseiinia ja VIC väriaine signaaleja kammioissa kirjattiin lopussa kunkin PCR-sykliä. Lukumäärä 6-karboksifluoreseiini-positiivinen (HER2) ja VIC-positiivinen (CEP17) kammiot kussakin paneelissa laskettiin ja HER2 Twitter /CEP17 kopioluku laskettiin [27].
Arviointi kasvaimen pitoisuussuhde (TCR) B
-DISH arviointiin.
Stepwise sekoittumisen LCL.
-DISH ja digitaalisen PCR H522 ja SK-BR-3-soluissa ja LCL. Erot katsottiin olevan merkittäviä, jos p
< 0.05.
Tulokset
ja CEP17. Vain suhteellisen suhteet kaksi jälkimmäistä voidaan saada digitaalisen PCR: llä käyttäen tuumorinäytesylinterin eristämättä yksittäisiä soluja. HER2
/CEP17 suhde, joka on saatu digitaalisten PCR [ r
] ilmaistiin seuraavasti, joka perustuu oletukseen, että geenin kopion määrä syöpäsolujen ovat homogeenisia ja ei-syöpäsolujen ovat geneettisesti vakaa diploidi kromosomeja (kuvio 1A ja 1B) :( 1) missä [ r
] on suhde HER2
jotta CEP17 saatu digitaalinen PCR (0 < r
); [ x
] on TCR (0 ≤ x
≤ 1); [
] on CEP17 kopioluvun yhdessä syöpäsolun (0 ≤
); ja [ B
] on HER2
kopiomäärä yhdessä syöpäsolun (0 ≤ B
). Tästä eteenpäin, kaksiulotteinen scatterplot edustaa Eq (1) kutsutaan TC kaavio.
] määritettiin HE-värjätään yksilöitä käyttämällä kuvan analyysin ohjelmisto, kuten Tissue Studio kuva-analyysi-ohjelmisto kudosnäytteistä ja Hybrid Cell Count ohjelmisto kirurgisista näytteistä, vastaavasti; ja [ r
] ja [ x
] määritettiin mittauksista.
] ja [ x
] kuten pysty- ja vaaka-akseleilla, vastaavasti (kuvio 1 B). Suhde [ B Twitter /
] oli viitearvon määrittämiseksi HER2
geenimonistuman. Itse varsinainen kopioluku CEP17 [
] ja HER2
[ B
] ei voitu määrittää tekemättä HER2
-DISH. Kuitenkin käytännön arviointi HER2
ja CEP17 kopioi numerot lautasen havaittu, että [
] vaihteli 2,0-6,0 (40 ja 117 CEP17 signaalien joukossa 20 syöpäsoluja S1 ja S2 taulukot) ja koskaan ylittänyt 8,0 kliinisissä mahasyövässä näytteitä. Kokemuksemme mukaan 164 peräkkäisen tapauksista mahasyövän (Ushiku T et al
. Julkaisematon data), CEP17 kopiomäärä on 1,0-5,7, mediaani 2,5, ja monosomia, määritellään [
< 1.5], on melko harvinaista vain kahdessa tapauksessa (1,2%). Siten erilaisia [
] asetettiin [2 ≤
≤ 8] kanssa turvamarginaali.
vahvistus-negatiivinen [ B Twitter /
< 2] tai [ B
< 2
]. [ Bx
+ 2 (1 - x
)] sen jälkeen ilmaistaan seuraavasti: (2) B-
+ 2 (1 - x
)] :( 3) B
< 2]. Oikea sivuosa yhtälön (5) osoitti monotoninen kasvu mukaan muuttujan [
] (2 ≤
≤ 8); sisällyttäminen [
= 2], mikä oli pienin arvo [
], osaksi Eq (5) antoi seuraavat: (6) B
vahvistus-negatiivinen edellytys [ B Twitter /
< 2] päti mitään arvoa [
] (2 ≤
≤ 8).
vahvistus-positiivisia oli [ B Twitter /
≥ 2] tai [ B
≥2
]. Tässä tapauksessa, [ Bx
+ 2 (1 - x
)] oli ilmaistaan seuraavasti: (7) B-
≥ 2]; oikea sivuosa yhtälön osoitti monotoninen kasvu. Sisällyttäminen [
= 8], joka oli maksimiarvo [
], osaksi Eq (8) saatiin seuraavasti: (9) B
vahvistus-positiivisten kunnossa [ B Twitter /
≥ 2] päti mitään arvoa [
] (2 ≤
≤ 8).
= (7 x
+ 1) /(3 x
+ 1)] (
= 8) nimettiin positiivinen alue, ja alapuolella suoran linjan [ r
= x
+ 1] (
= 2) oli negatiivinen alueella. Alue, jota rajaavat viivat [ r
= x
+ 1] ja [ r
= (7 x
+ 1) /(3 x
+ 1)] oli määräämättömäksi vyöhyke riippuen arvosta [
], joka nimettiin epäselvä alue ja määritellään seuraavasti (kuvio 1 B) :( 10)
] on 0 (joissa ei ole syöpäsoluja), kaikki rivit lähentyneet koordinaateissa (0,1), joka perustuu oletukseen, että ei-syöpäsolujen ovat genomisesti stabiileja. Kun [ x
] oli 1,0 (joka koostuu vain syöpäsoluja), linjojen läpi koordinaatit (1,2) riippumatta arvot [
] ja [ B
].
-DISH viljellyissä soluissa
] ja [ B
] saadaan HER2
-DISH solulinjoissa, tai käyttämällä laskettua [ B '
] alkaen [
] ja mitattiin [ r
].
ja CEP17 ( HER2 Twitter /CEP17) in LCL ja H522 ja SK-BR-3cells arvioitiin HER2
-DISH käyttäen FFPE Aikasolujen ja digitaalisilla PCR (taulukko 2). HER2
signaaleja esiintyi erillisinä pisteitä ytimille HER2
-DISH (kuvio 2A ja 2B); HER2
kopiomäärä yksittäisissä soluissa oli lähes kaksi LCL ja neljä H522-soluissa. Sen sijaan, SK-BR-3-soluissa osoitti ryhmitelty HER2
signaaleja, jotka oli vaikea erottaa yksilöllisesti (kuvio 2C); heidän määränsä mielivaltaisesti asetettu maksimiarvot 7, 14, ja 21 mukaan klusterin kokoa. Täten, alempi HER2
/CEP17 suhde saatiin HER2
-DISH kuin digitaalisen PCR.
[ B
] ja CEP17 [
] kopioida numeroita laskettiin HER2
-DISH seuraavasti: [
= 41/20 = 2,05] ja [ B
= 85/20 = 4,25]. Kun arvot [
] ja [ B
] levitettiin Eq (1), tietoja voidaan kuvata viittaamalla linjan [ r
= ( 4.25 x
+ 2 (1 - x
)) /(2,05 x
+ 2 (1 - x
))] (Kuva 2D ). Kun kyseessä on SK-BR-3-soluissa, CEP17 kopiomäärä [
] oli [
= 83/20 = 4,15]; kuitenkin, kuten edellä on kuvattu, HER2
signaalit kerättiin ryhmäksi, joka laski arvioitu kopioluku. Siksi soveltamalla [
= 4,15], [ r
= 5,69], ja [ x
= 1.0] Yhtälön (1), arvioitu HER2
kopiomäärä [ B '
] oletettiin olevan [ B'
= 5,69 x 4,15 = 23,61]. Näin ollen [
= 4,15] ja [ B '
= 23.61] whilethe vertailulinja oli [ r
= (23.61 x
+ 2 (1 - x
)) /(4,15 x
+ 2 (1 - x
))] (Kuva 2E). Piirretty digitaalinen PCR tietoja SK-BR-3-solujen sekoitetaan LCL noudatettiin tätä linjaa sijaan [ r
= (19.50 x
+ 2 (1 - x
)) /(4,15 x
+ 2 (1 - x
))], joka perustui HER2
-DISH tietoja, joiden [ B
= 19,50]. Nämä tulokset osoittavat pätevyyden TC kaavio-ie, että sillä on riittävästi quantitativity digitaalisen PCR erottamaan HER2-monistettu vahvistamattoman soluissa.
Concordance välillä TC kaavion digitaalista PCR ja HER2-IHC /- lautasen kliinisissä biopsianäytteissä
tilan kunkin näytteen määritettiin HER2-IHC ja -DISH (kuvio 3A-3C). Arvioidut arvot olivat yhdenmukaisia manuaalinen laskee tehnyt patologi (KM). TC nopeus määritettiin kuvien erottamalla ytimiä syöpä niiltä ei-syöpäsolujen (kuvio 3D).
-DISH-positiivinen (punainen), -equivocal (violetti) ja -negatiivinen (sininen), sekä HER2-IHC-positiivinen (vinoneliöt), -equivocal (kolmiot), ja -negatiivinen ( cross-merkit) näytteitä. Kliinis tietoja edustavista ja kaikista tapauksista on esitetty taulukossa 3 ja S1 Taulukko vastaavasti. Ei ollut HER2
-DISH-positiivisia tapauksia viivan alapuolella [ r
= x
+ 1]; kuitenkin yksi HER2
-DISH-negatiivinen ( ), kaksi moniselitteinen (ja), ja kolme positiivista (,)ja,) tapauksessa havaittiin moniselitteisiä alueella . Lisäksi oli HER2
-DISH-negatiivinen tapauksessa positiivisen alueen (!). Kolme tapausta (,ja*) osoitti selvästi korkea digitaalinen PCR-arvot (28,25, 19,99 ja 24,00, vastaavasti). Vuonna HER2
-DISH, nämä tapaukset osoittivat ryhmittyneet HER2
signaalit (kuvio 3C), jotka olivat vaikea mitata, kuten SK-BR-3-soluissa. Eq (1) Myös ilmaistaan seuraavasti: (11) B
] laskettiin soveltamalla mitattuna [ r
] ja [ x
] ja mitattiin [
], joka määritettiin laskee CEP17 signaalit saadaan HER2
-DISH 20 syöpäsoluissa (taulukko 3 ja S1 taulukko). [ B '
] saatiin myös mittaamalla [ r
] ja [
] ja [ x
= 1], kuten on kuvattu SK-BR-3-soluissa.
-DISH. Neljästä epäselviä tapauksia IHC pisteet 2+, yksi () oli positiivinen ja muut (, ja)) olivat negatiivisia, määritettynä HER2
-DISH. Arvioitu [ B Twitter /
] arvo oli vastaavasti ≥ 2,0 tapauksessaja < 2.0 jälkimmäisessä kolmessa, paitsi tapauksessa), arvioitu [ B Twitter /
] joista oli 2,12.
arviointi kasvaimensisäisenä HER2 heterogeenisyys kirurgisista näytteistä
-DISH (positiivinen) on piirretty moniselitteisiä alueella. Näyte-2 on piirretty moniselitteisiä alueella, koska alue-2 kattoi suhteellisen laajalle alueelle, joka sisältää sekä HER2-positiivinen ja -negatiivinen komponentteja. Näyte-2 osoitti eroavaisuuksia HER2-IHC (positiivinen) ja HER2
-DISH (negatiivinen) (S2 taulukko), jossa digitaalinen PCR, jotka vastaavat HER2
-DISH.
vahvistus-negatiivinen, -equivocal, ja positiivisten tapausten käyttämällä kaksiulotteista hajottaa juoni tai TC kaavio, joka perustuu mitattujen arvojen HER2 Twitter /CEP17 suhde saadaan digitaalinen PCR [ r
] ja TCR [ x
] ilman tavanomaisia HER2
-DISH tai HER2-IHC tietoa. Siten analyysi TC kaavio on riippumaton CEP17 ja HER2
kopioida numeroita ([
] ja [ B
]) yhtenä syöpäsolun, joka voi yleensä saadaan HER2
-DISH.
-DISH voitaisiin välttää, alle 30% tapauksista. Taajuus HER2
vahvistus vaihtelee mahasyövässä histologisia tyyppejä, 20% -30% suoliston < 10% diffuusi tyyppi [32]. Siksi tehokas seulontamenetelmä vaaditaan rutiininomaisessa kliinisessä käytännössä, erityisesti maissa, joissa on korkea esiintyvyys mahasyövän. TC kaavio voidaan myös käyttää yhdessä muiden PCR-pohjainen menetelmä, kuten kvantitatiivinen PCR HER2
vahvistus [33].