PLoS ONE: Resveratrol estää niiden kasvun mahasyövän indusoimalla G1 vaiheen pysähtymisen ja Vanheneminen on SIRT1 riippuva Manner

tiivistelmä

Resveratrol, luonnossa esiintyvä polyfenoliyhdistepitoisuus, on raportoitu aiheuttavan syövän vastaista aktiivisuutta vaikuttamalla monipuolinen molekyyli tavoitteita. Tässä tutkimuksessa selvitimme vaikutuksia ja taustalla olevien mekanismien resveratrolin mahasyövän. Olemme havainneet, että resveratroli inhiboi proliferaatiota mahalaukun syövän solujen annoksesta riippuvalla tavalla. Pitoisuudella 25 ja 50 uM, resveratroli inhiboi solujen elinkykyä ja vähentynyt klonogeenisten mahdollisia mahalaukun syöpäsoluja. Resveratrol hoitoon pidätetty mahasyövän solut G1 vaiheessa ja johti vanhenemista sijasta apoptoosin. Regulators solusyklin ja vanhenemista polkuja, kuten sykliini D1, sykliiniriippuvainen kinaasi (CDK4 ja 6), p21 ja p16, oli väärin säädellystä mennessä resveratrolin hoitoa. Estovaikutukset resveratrolin mahasyövän tarkistettiin lisäksi in vivo
käyttäen karvattomia hiiriä ksenograftimallissa. Resveratrolin (40 mg /kg /d) kohdistuva inhiboiva vaikutus mahalaukun syövän kehitystä ja vähensi fraktioiden Ki67-positiivisten solujen kasvaimen yksilöitä nude-hiirissä. Sen jälkeen resveratrol hoito, induktio vanhenemista ja muutokset ilmaus sääntelyviranomaisten mukana solusyklin ja vanhenemista väyliä olivat samanlaisia ​​kuin mitä havaitsimme in vitro
. Kuitenkin ehtyminen Sirtuin (Sirt) 1 päinvastainen edellä kuvatun vaikutusten resveratrolin sekä in vitro
ja in vivo
. Tuloksemme viittaavat siihen, että resveratroli estää mahalaukun syövän SIRT1 riippuvaisella tavalla ja antaa yksityiskohtaisia ​​todisteita mahdollisuuden soveltaa resveratrolin mahalaukun syövän ehkäisyä ja hoitoa.

Citation: Yang Q, Wang B, Zang W, Wang X Liu Z, Li W, et ai. (2013) Resveratrol estää niiden kasvun mahasyövän indusoimalla G1 vaiheen pysähtymisen ja Vanheneminen on SIRT1 riippuvaisesti. PLoS ONE 8 (11): e70627. doi: 10,1371 /journal.pone.0070627

Editor: Dominique Heymann, Faculté de médecine de Nantes, France

vastaanotettu: 20 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 19 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 21 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 81101869, 81100103, 81171536 ja 81000868), National Basic Research Program of China (973 Program, No. 2012CB911202), ja itsenäiset innovaatioasiamiesten Shandongin yliopistossa (2012TS108) kantavassa rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpää (GC) on neljänneksi yleisin syöpä ja toiseksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolleisuus maailmassa. Erään maailmanlaajuisen arvion mukaan yhteensä 989600 uutta GC tapausta diagnosoitiin ja vähintään 738000 potilasta kuoli tästä taudista vuonna 2008, mikä vastaa 10% kaikista kuolemantapauksista syöpään [1]. Vaikka ilmaantuvuus GC on vähentynyt maailmanlaajuisesti, se on edelleen korkea kehitysmaissa, erityisesti Kiinassa [1], [2]. Aiemmat tutkimukset ovat paljastaneet intiimi suhde krooninen gastriitti aiheuttama helikobakteeri
infektio ja kehittämistä GC [3]. Lisäksi isäntä geneettisten, ympäristöön, ravinnon ja muut tekijät ovat sekaantuneet mahalaukun kasvaimia synnyttävän prosessin [1]. Koska se on vielä vaikea tehdä varhainen diagnoosi GC, suurin osa potilaista diagnosoidaan myöhemmissä vaiheissa. Paranemisesta huolimatta tavanomaisten hoitojen kehittyneen GC, kirurgia, kemoterapiaa ja sädehoitoa, pituus tai elämänlaatua potilailla, joilla on pitkälle edennyt GC on edelleen huono [2], [4]. Siksi etsintä uusien ennaltaehkäisy- lääkkeiden tai terapeuttisten kohteiden GC tarvitaan kipeästi.

kulutus tuoreiden hedelmien ja vihannesten osaltaan vähentynyt syövän, mukaan lukien GC [2], [5]. Kliinisiä sovelluksia viittaavat myös siihen, että jotkin bioaktiiviset ravinnon molekyyleillä on kyky inhiboida useita onkogeenisen vaiheita [5] - [7]. Resveratrol (Res, 3,5,4'-trihydroksistilbeeni) on luonnossa esiintyvä polyfenoliyhdistepitoisuus läsnä lähes 70 kasvilajien ihon punainen viinirypäleet, pähkinöitä, marjoja ja toiset [6] - [8]. Res raportoitiin ensimmäisen kerran käyttämään kasvaimen vastaisen toiminnan vuonna 1997 [8]. Myöhemmin raportit ovat osoittaneet, että Res saa aikaan estäviä vaikutuksia useita erilaisia ​​syöpiä, kuten paksusuolen syöpä, rintasyöpä ja lymfooma, ja vaikuttaa erilaisten molekyyli- tavoitteet [9] - [11]. Sirtuin 1 (SIRT1), luokan III nikotiiniamidiadeniinidinukleotidifosfaatti nukleotidin (NAD ^{+) - riippuvainen histoni /proteiini deasetylaasi, on raportoitu olevan keskeinen tavoite Res useissa kasvainmuodoista [9], [10]. Kuitenkin jotkut tiedot osoittavat päinvastoin tuloksia viittaa siihen, että Res kykenee chemoprotective vaikutuksia riippumattomia SIRT1 [11]. Estovaikutukset Res GC ja taustalla olevaa mekanismia ei ole hyvin tutkittu.}

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että Res inhiboivat GC-solujen in vitro
. Res indusoi solusyklin pysähtymisen G1 vaiheessa ja johti solujen vanhenemista. Nämä vaikutukset Res oli palautunut ehtyminen SIRT1. Inhiboiva SIRT1 riippuva toiminta Res GC soluja tarkasti myös in vivo
. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että Res kykenee SIRT1 riippuvia estävät vaikutukset GC ja ehdottaa terapeuttista roolia Res GC.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki eläinkokeissa hyväksyi eettisen komitean Shandong University School of Medicine (nro 001 vuonna 2011 animal Ethics hyväksyntä) ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

Cell Lines, viljelyolosuhteet ja Res hoito

Ihmisen GC solulinjat AGS (saatu Cell Resource Center, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology at Kiinan Academy of Sciences), BGC-823 ja SGC-7901 (toimittaja China Center for Type Culture Collection, Wuhan, Kiina) käytettiin tässä tutkimuksessa. Soluja viljeltiin F12 (AGS) tai RPMI 1640 (BGC-823 ja SGC-7901), joka sisälsi 10% FCS: ää, 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 2 mmol /l L-glutamiinia, 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO _{2. Erittäin puhdasta Res ostettiin Sigma (St. Louis, MO, USA), liuotettuna DMSO: hon ja lisätään elatusaineeseen ilmoitetun pitoisuuden. Kaikki kokeet suoritettiin 24 tunnin kuluttua Res lisäravinteiden, ellei toisin ole mainittu.}

Pienet häiriöt RNA transfektio

Kemiallisesti muunnetut pieni häiritsevä RNA (siRNA) kohdistaminen SIRT1 ja ohjaus siRNA ostettiin GenePharma (Shanghai , Kiina). Sekvenssi SIRT1 siRNA oli 5'-CCAUCUCUCUGUCACAAAUTT-3 '. Soluja inkuboitiin yön yli ja sitten transfektoitiin siRNA: lla käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan protokollan. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia siRNA transfektion jälkeen solut käsiteltiin 50 uM Res 24 tuntia ennen lisätutkimuksia.

solunelinkykyisyysmääritys

Proliferaatio arvioitiin käyttäen Cell Titer 96 ® vesikerros Solution Cell Proliferation Assay (Promega, Madison, WI, USA). Lyhyesti, 2 x 10 ^{3-solut ympättiin 96-kuoppalevylle, ja annettiin kasvaa 24 tuntia. Kaksikymmentäneljä tuntia myöhemmin, 20 ui MTS (3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -5- (3-karboksi-metoksifenyyli) -2- (4-sulfofenyyli) -2H-tetratsolium) lisättiin kuhunkin hyvin. Kun oli inkuboitu 3 tuntia 37 ° C: ssa, absorbanssi 490 nm: ssä rekisteröitiin Varioskan Flash monilevylukija (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Solujen elinkelpoisuus laskettiin seuraavalla kaavalla: suhteellinen solujen elinkykyä = (keskimääräinen absorbanssi käsitellyssä ryhmässä - keskimääräinen absorbanssi tyhjä) /(keskiarvo absorbanssi hallinnan ryhmä- keskimääräinen absorbanssi tyhjä). Määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin kolme kertaa.}

Colony muodostumisen määritys

Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille (300 tai 500 solua kuoppaa kohti) ja inkuboitiin 10 päivää, kunnes pesäkkeet riittävän suuri selvästi havaittavissa. Solut kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin kristallivioletilla, ja pesäkkeiden lukumäärä, joissa on enemmän kuin 50-solut laskettiin manuaalisesti. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin kolme kertaa.

Cell Cycle Analysis

Solut kerättiin, kiinnitettiin esijäähdytetty 70% etanolilla 4 ° C: ssa yön yli ja sitten värjättiin propidiumjodidilla (Beyotime Kiinan Jiangsun), joka sisältää RNaasi A: ta 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan pimeässä. Solusyklin jakautumisen määritettiin käyttämällä virtaussytometrillä (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), ja tiedot analysoitiin Multicycle ohjelmisto (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA, USA). Kokeet suoritettiin itsenäisesti kolme kertaa.

apoptoosimäärityksessä

havaitseminen ja kvantitointi apoptoosin suoritettiin merkintöjä DNA katkeamisen käyttämällä In situ Cell Death Detection Kit, TMR punainen (Roche Applied Science, Basel, Sveitsi). Soluja tai parafiinileikkeitä ksenografteja leimattiin TUNEL mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Soluille, käsittely 0,2 mM H _{2O 2 12 h toimi positiivisena kontrollina. Sillä parafiinileikkeillä, positiiviset kontrollit hankittiin Millipore (Billerica, MA, USA). Tumat vastavärjättiin DAPI (Beyotime) ja levyt tai leikkeet kuvattiin jonka fluoresenssimikroskopialla (Olympus, Tokio, Japani) käyttämällä cellSens Dimension ohjelmistoa. Kokeet suoritettiin itsenäisesti kolme kertaa.}

β-galaktosidaasin Värjäys

Vanheneminen arvioitiin käyttäen Vanheneminen β-galaktosidaasi Värjäys Kit (Beyotime). Lyhyesti, soluja tai jääleikkeiden -ksenografteja kiinteän ja inkuboitiin sitten juuri valmistettua β-galaktosidaasi (β-Gal) värjäysliuos 37 ° C: ssa yön yli. Kokeet suoritettiin itsenäisesti kolme kertaa.

Stable Lentivirusvektorikonstruktit-lyhyt hiusneula-RNA (shRNA) GC Cells

Lentivirusvektorit sisältävä kontrolli tai SIRT1 shRNA rakennettiin GenePharma ja käytetään transfektoimaan BGC-823 soluja. Efficient knockdovvn SIRT1 varmistettiin Western blot. Vakaiden transduktion, valvonta-lentivirus-tartunnan tai SIRT1 shRNA-lentivirus-tartunnan BGC-823-soluja viljeltiin täydellisessä väliaineessa mukana 2 ug /ml puromysiiniä neljä viikkoa ja pidetään LV-C ja LV-S, vastaavasti.

nude hiiret ksenograftimallia

Nainen joilta puuttuu kateenkorva BALB /c-nude-hiiriin (6~8 viikkoa) hankittiin Pekingin yliopiston (Beijing, Kiina) ja ylläpidettiin spesifisissä patogeenivapaissa olosuhteissa Key Laboratory of Cardiovascular Remodeling and Function Research, Qilu sairaala, Shandong University. Hiiret jaettiin satunnaisesti neljään ryhmään (8 hiirtä kutakin ryhmää): ryhmä I ja II, BGC-823-soluja (1 x 10 ^{6 solua injektiota kohti 0,1 ml: ssa PBS: ssä) injektoitiin subkutaanisti kylkeen alueelle nude-hiirissä; ryhmä III, LV-C (BGC-823 solua) injektoitiin; ja ryhmä IV, LV-S (BGC-823 solua) injektoitiin. Istutuksen jälkeen nude hiiriä II, III ja IV käsiteltiin Res (40 mg kg -1 0,1 ml kasviöljyä, hallinnoi letkuruokinnalla kerran päivässä). Ihonalainen kasvaimen koko mitattiin paksuus, ja tuumorin tilavuudet laskettiin kaavalla (pituus) x (leveys 2) /2. Hiiret lopetettiin neljä viikkoa myöhemmin. Kasvaimet kerättiin ja käsiteltiin Western blot ja immunokemiallinen tutkimuksia.}

Real Time-kvantitatiivinen PCR (RT-QPCR) B

Yhteensä RNA soluissa eristettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen) ja muunnetaan cDNA käyttäen PrimeScript ™ RT reagenssipakkaus (Takara, Tokio, Japani). RT-QPCR suoritettiin geenien, mukaan lukien sykliini D1, sykliinistä riippuvaisen kinaasin 4 (CDK4), p21 ja β-aktiini, kuten aiemmin on kuvattu [12]. Sekvenssit monistusalukkeiden on lueteltu taulukossa S1. MRNA: n ilmentyminen sykliini D1, CDK4 ja p21 normalisoitiin p-aktiini-suhteessa kontrolliin käyttäen 2 ^{-ΔΔCt menetelmällä. Kukin koe toistettiin kolme kertaa.}

Western Blot

Yhteensä proteiinin soluista tai tuumorinäytteitä uutettiin RIPA hajotuspuskuria (Beyotime), kuten on kuvattu [12]. Proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen BCA-Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Kalvo tutkittiin vasta-aineiden SIRT1 (Abcam, Cambridge, MA, USA), bcl-2, bax, kaspaasi-3, sykliini D1, CDK4: n ja 6 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), p16 ja p21 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Sekundäärinen vasta-aine käytettiin piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua anti-kani tai hiiri-vasta-ainetta. Proteiinivyöhykkeet visualisoitiin käyttäen ECL-järjestelmää (Pierce). β-aktiini (Cell Signaling) toimi latauskontrollina.

immunohistokemia

Kasvain yksilöitä nude-hiiret parafiini, vedettömät ja antigeenin noudetaan. Leikkeitä inkuboitiin vasta-aineen kanssa vastaan ​​Ki67 (1:500, Abcam) yön yli 4 ° C: ssa. HRP-konjugoitua anti kaniinin IgG ja DAB värjäystä käytettiin visualisoida Ki67 vasta-aine. Objektilasit lopuksi vastavärjät- hematoksyliinillä. Levyjä kuvantaa Olympus-valomikroskoopilla (Tokio, Japani) käyttämällä cellSens Dimension ohjelmistoa. Ki67-positiiviset solut laskettiin käsin ja prosenttia Ki67-positiivisten solujen arvioitiin kohti kenttiä. Viisi erillistä kentät laskettiin kunkin osion.

TILASTOANALYYSI

Tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SD. Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen Statistical Package for Social Sciences (SPSS, versio 16.0, Chicago, IL, USA) yksisuuntaisella ANOVA Tukeyn post-hoc-testi. P-arvo on alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.

Tulokset

Res Estää elinkelpoisuus GC solujen SIRT1 riippuvalla tavalla

kolme GC-solulinjat (AGS, BGC-823 ja SGC-7901) tutkittiin kokeissa. Viljelemällä soluja ajoneuvon (0,1% DMSO) kanssa ei vaikuttanut solujen elinkykyä (tietoja ei esitetty). Kuitenkin, kun käsitellään eri pitoisuuksia Res 24 tuntia, solun proliferaation annoksesta riippuvalla tavalla inhiboivat 25, 50, 100 ja 200 uM Res (kuvio 1A). Huomattavaa on, että leviämisen AGS ilmeisesti estetty, kun käsitellään 10 uM Res, jota ei havaittu kahta muuta solulinjoista (kuvio 1A). Kaikissa kolmessa solulinjojen läsnä ollessa 100 uM Res riitti aiheuttamaan yli 50% kasvun esto (56.78% for AGS, 54,87% ja BGC-823 ja 52.16% varten SGC-7901, vastaavasti). Näin ollen, 25 ja 50 uM Res käytettiin myöhemmissä kokeissa. Voit selvittää toiminnallista roolia SIRT1 vuonna Res hoidossa, me pudotti SIRT1 ilmaisun käyttämällä erityistä siRNA. Tehokas esto SIRT1 ilmaisun varmistettiin western blot (kuvio 1 B). Tulokset MTS-määritys osoitti, että SIRT1-köyhdytettyä soluja, Res ei estänyt soluproliferaatiota (kuvio 1C). Nämä tiedot osoittavat, että Res kykenee inhiboimaan GC soluja ja että inhiboiva vaikutus voidaan pelastaa SIRT1 ehtyminen.

Res Vähentää klonogeeninen potentiaali GC solujen SIRT1 riippuvalla tavalla

kasvainsoluja, pesäkkeiden muodostumisen on havaittu olevan herkempiä parametrin kuin elinkelpoisuuden arvioimiseksi lääkkeen vaikutusta. Siten pyrittiin sitten sitoutuneet määrittää vaikutus Res on klonogeeniset potentiaalia GC soluja. Res, konsentraatiossa 25 uM, johti huomattavaan vähenemiseen pesäkkeitä numerot sekä koot GC soluissa. Hoidon jälkeen 50 uM Res, The klonogeeniset potentiaalia edelleen laskenut. Kuitenkin knockdovvn SIRT1 ennen Res hoitoa lisäsi pesäkkeiden tasolle verrattavissa vehikkeliryhmässä (kuva 2).

Res Indusoi kertyminen GC Solut G1 vaiheen on SIRT1 riippuvaisesti

tutkimiseksi estävää vaikutusta Res GC-soluissa, teimme solusyklin analyysi. Havaitsimme, että 25 ja 50 uM Res kasvattanut solujen G1 vaiheessa niin BGC-823 ja SGC-7901-solujen (kuviot 3A ja 3B). Induktion G1 vaiheen pidätti Res oli myös annoksesta riippuvaa. Res pitoisuutena 50 uM oli voimakkaampi vaikutus kuin se teki 25 uM. Lisäys solujen lukumäärä G1 faasi mukana lasku solupopulaatioiden pääasiassa S-vaiheissa. Ehtyminen SIRT1 ennen Res hoitoa vähentynyt G1-vaiheen induktio Res (kuviot 3A ja 3B). Vahvistavan edellä esitetyt tulokset, tutkimme ilmaus solusyklin sääntelevät G1 vaiheessa ottaen sykliini D1, CDK4, CDK6, p21 ja p16 in BGC-823 soluja. Kuten kuviossa 3C on esitetty, in Res saaneilla BGC-823-solut, proteiini tasot aktivaattoreita G1 /S siirtymä (sykliini D1, CDK4 ja CDK6) pieneni, kun taas proteiinin tasot estäjien CDK (CDKIs) (p21 ja p16) lisääntynyt. Sitä vastoin näitä muutoksia ei todettu SIRT1-köyhdytettyä BGC-823-soluja, kun ne käsiteltiin 50 pM Res. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin RT-QPCR sykliini D1, CDK4 ja p21 (kuvio 3D).

puute sub-G1-solut osoittivat, että Res hoito ei laukaista apoptoosin GC-soluissa (kuvio 3A) , mikä oli sopusoinnussa tulosten TUNEL leimauskokeiden peräisin BGC-823-solut (kuvio S1A). Proteiinin tasot apoptoosiin liittyvien molekyylien, kuten bcl-2, Bax ja kaspaasi-3, kustakin ryhmästä olivat vertailukelpoisia (kuvio S1B). Yhdessä tuloksemme osoittavat, että Res indusoi G1 vaiheessa pidätyksen GC solujen SIRT1 riippuvalla tavalla eikä indusoi apoptoosia.

Res indusoi Vanheneminen GC Solut on SIRT1 riippuvaisesti

meidän käsissä, Res johtaa kasvun pysähtymisen sijaan kasvoi apoptoosin. Siksi teimme lisätoimia tutkia, onko Res voisi aiheuttaa vanhenemista GC soluissa. p-Gal-värjäys, tietty markkeri nisäkkäiden senescent soluja, käytettiin. Jälkeen Res hoitoon, löydettiin lisääntynyt jakeet solut värjättiin β-Gal. Kuitenkin esikäsittely SIRT1 siRNA estää Res-indusoidun solun vanhenemista (kuvio 4). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin molemmista BGC-823 ja SGC-7901-soluissa, mikä viittaa siihen, että Res riippuvaisempia SIRT1 aiheuttavan solujen vanhenemista GC soluissa.

Res kasvaimen kasvu estyy in vivo SIRT1 riippuvaisesti

Seuraavaksi lisätutkimuksia suoritettiin vaikutusten määrittämiseksi Res BGC-823 ksenograftien kasvua nude-hiirissä. Sillä in vivo
tutkimuksessa vakaa transdusoidut lentivirus--shRNA BGC-823-soluja käytettiin. Neljästä SIRT1 shRNA-lentiviruksien, LV-1 ja LV-4 kohdistaman ilmeinen hiljentäminen vaikutuksia SIRT1 lauseke (kuva S2). Neljän viikon kuluttua seulonta, ilmentyminen SIRT1 pidettiin vähentynyt tasoilla vakaa lentiviruksen-shRNA BGC-823-soluja (kuvio S2). Stable LV-1 lentiviruksen-shRNA BGC-823-soluja käytettiin seuraavissa ksenografteissa tutkimuksissa, koska vahvempi estävät vaikutukset SIRT1 ilmentymisen verrattuna LV-4. Kaikki eläimet selvisivät loppuun kokeissa, ja mitään ilmeistä eroa ei havaittu niiden paino (dataa ei esitetty). Neljä viikkoa implantoinnin jälkeen, mittaukset kasvaintilavuudet osoitti, että Res hoito vähensi kasvua BGC-823-ksenografteja (Res vs kontrolli: 0,5728 ± 0,2276 cm ^{3 vs 1,4288 ± 0,1741 cm 3, P < 0,001) . Vakaa transduktio valvonnan shRNA-lentivirus ei vaikuttanut kasvaimen tilavuus (Res vs Res + Ci: 0,5728 ± 0,2276 cm 3 vs. 0,68 ± 0,0672 cm 3, P = 0,603). Kuitenkin SIRT1-köyhdytettyä ksenografteissa, estovaikutukset Res kasvaimen kasvuun pelastettiin (Res + Si vs Res + Ci: 1,2313 ± 0,1777 cm 3 vs. 0,68 ± 0,0672 cm 3, P < 0,001, res + Si vs kontrolli: 1,2313 ± 0,1777 cm 3 vs 1,4288 ± 0,1741 cm 3, P = 0,123) (kuvio 5A). Vuonna Res hoidetuista ksenografteissa, leviämisen merkki, Ki67, väheni merkittävästi (kuvio 5B) (% suhteessa Ki67-positiivisten solujen, Res vs ohjaus: 3 ± 1,8 vs. 44.67 ± 3,79, P < 0,001). Vanheneminen havaittiin ksenografteissa päässä Res-käsitellyistä hiiristä osoittaa β-Gal-värjäyksen (kuvio 5B). Kuitenkin mitään ilmeistä apoptoosin aiheutettiin Res vuonna ksenografteissa (kuva S1D) ja mitään muutoksia ei havaittu sääntelyviranomaisten apoptoosin, kuten Bcl-2, Bax ja kaspaasi-3 (kuvio S1C). Nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​ in vitro
kokeita. Lisäksi muutokset ilmaus sääntelyviranomaisten solusykliä, kuten sykliini D1, CDK4, CDK6, p21 ja p16 olivat samanlaisia ​​kuin mitä havaitsimme in vitro
(kuvio 5C). Kaikki havaitut muutokset Ki67, β-Gal ja solukierron sääntelyviranomaisten palautettiin SIRT1 ehtymisestä (kuviot 5B ja C) (% suhteessa Ki67-positiivisten solujen, Res + Si vs Res + Ci: 46.32 ± 6,03 vs. 2,65 ± 1,53, P < 0,001, Res + Si vs ohjaus: 46.32 ± 6,03 vs. 44,67 ± 3,79, P = 0,946).}

keskustelu

Res, luonnollinen polyfenolien, arvioidaan parhaillaan lupaava syövän vastaisen agentti. Vaikka se on osoittautunut antamaan antiproliferatiivisia vaikutuksia vastaan ​​useita syöpätyyppejä sekä soluviljelmässä ja ksenograftimalleja [9] - [11], sen kemopreventiossa vaikutukset GC ja taustalla olevaa mekanismia ei ole hyvin tutkittu. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että Res inhiboivat GC solulinjojen (AGS, BGC-823 ja SGC-7901). Anti-kasvun vaikutus havaittiin, kun soluja käsiteltiin 25 uM Res 24 tuntia, ja inhiboiva vaikutus oli annoksesta riippuvaista. Pitoisuutena 50 uM Res, esto suhteet näiden kolmen solulinjat olivat 41%, 34% ja 32%, vastaavasti. Kun pitoisuus Res kasvanut, estäviä vaikutuksia vahvistettiin. Sekä 100 ja 200 uM Res esti kasvua yli 50% verrattuna vehikkeliryhmässä. Lisäksi suurempi annos Res on liian suuri saavuttaa in vivo
ja siten ei ole mitään järkeä kliinisessä ympäristössä [13], [14]. Siksi kahden tehollisen pitoisuuksia 25 ja 50 uM Res käytettiin myöhemmissä tutkimuksissa. Kasvun inhibitio aktiivisuus Res näyttää olevan soluspesifisiä, IC50 vaihtelee solutyypin ja vaihtelee 27 uM 180 uM [9], [10], [15], [16]. Jotkut näistä tutkimukset ovat myös osoittaneet, että Res kykenee estovaikutus on ajasta riippuva tavalla [15], [16]. Pitoisuus ja kesto Res hoidon käytetty meidän tutkimuksessa olivat yhdenmukaisia ​​useimpien raportteja muiden ryhmien [8], [9], [16]. Sillä in vivo
tutkimuksessa, hallinto menetelmä käytimme on letkulla, koska tämä on menetelmä, jota käytetään yleisesti hiirillä vaihtoehtona vatsaonteloon [15], [17]. Lisäksi hiirillä ovat osoittaneet, että Res imeytyy tehokkaasti suun kautta otettuna ja löytyy koko kehon [17], [18]. Käytettäessä in vivo
, Res vähensi solujen lisääntymisen kuin ominaista Ki67 ilmaisua, joka on sopusoinnussa tulosten meidän in vitro
kokeita.

Res voi hidastaa syöpäsolujen lisääntymistä kautta erilaisia ​​mekanismeja, joiden joukossa, solusyklin säätelyssä on tärkeä [9], [15], [19]. Meidän in vitro
tiedot osoittivat, että hoito GC solujen Res indusoi G1 vaiheen pysähtymisen. G1 vaihe on ensimmäinen neljä vaihetta solusyklin joka tapahtuu eukaryoottisolussa jako. G1 on erityisen tärkeä solusyklin vaihe, koska se on piste, jossa solu sitoutuu kierroksen jako. Progression kautta G1 vaihe edellyttää muodostumista ja toimintaa sykliini D-CDK4 tai -CDK6 komplekseja. Nämä kompleksit sitten fosforyloida retinoblastooma, joka johtaa vapautumista E2F transkriptiotekijöiden ja alavirran geenin transkription mukana S-vaiheen etenemisen. Toiminta sykliini D-CDK-kompleksit säätelevät ylävirran estäjiä, mukaan lukien jäsenet INK (p15, p16 ja p18) ja CIP perheiden (p21, P27 ja P57) [20], [21]. Samaa linjaa, johon G1 vaiheessa pidätyksen, havaitsimme downregulation sykliini D1, CDK4 ja CDK6 ja säätelyä p21 ja p16 in Res saaneilla GC soluissa. Meidän in vivo
tulokset ekspressiotasoja näiden solujen lukiertosäätelijöistä kasvaimen yksilöt ovat yhdenmukaisia ​​ in vitro
tuloksia. Tuloksemme ovat myös yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten [15], vaikka jotkut muut ovat ilmoittaneet, että S-vaiheessa pidätys on aiheuttamien Res [9], [19]. Pysyvyys kasvun pidätys voi johtaa apoptoosin tai vanhenemista soluissa. Koska sekä p21 ja p16 signalointireittien osallistua vanhenemista etenemisen välittävät erilaisia ​​stressiin [22], [23], suoritimme β-Gal-värjäys. Res hoito lisäsi merkittävästi taajuus senescent GC-solujen annoksesta riippuvalla tavalla. Solu vanhenemista ohjelma on tärkeä este syöpää vastaan ​​aloittamista ja kehittäminen [24], [25]. Vaikka aikaisemmat tutkimukset osoittavat, että läpi vaimennus oksidatiivisen stressin ja paranemisen aineenvaihduntaa, Res kykenee anti-aging vaikutuksia sekä in vitro
ja in vivo
[26] - [28], päinvastaiset vaikutukset on osoitettu syövän. Res on havaittu indusoivan vanhenemista kaltainen kasvun inhibitio useita erilaisia ​​syöpiä [29], [30]. Kaksoisrooli Res solujen vanhenemista, hidastava ikääntyminen normaaleissa kudoksissa ja kiihtyvä senesenssiin kasvaimissa, tekee siitä ihanteellisen ehdokas syövän ehkäisyyn ja hoitoon.

Apoptoosi on toinen yhteinen vaikutus, joka on yleensä havaitaan Res saaneilla syöpäsolut [9], [11], [15], [16]. Kokeelliset todisteet osoittavat, että apoptoosin voidaan välittää useita eri reittejä ja lukuisten säätelevien molekyylien. Näistä valvojat, proteiinit, jotka käsittävät bcl-2-perheen ovat tärkeitä. On olemassa sekä anti-apoptoottiset proteiinit (BCL-2, Bcl-x L) ja pro-apoptoottisten proteiinien (bax, huono, bak ja bcl-xs) tässä perheessä. Kasvua pro-apoptoottista bax /anti-apoptoottisten Bcl-2-suhde parantaa läpäisevyyttä mitokondrion kalvon, aiheuttaa vapautumisen sytokromi c välillä mitokondrioita sytosoliin ja puolestaan ​​johtaa kaspaasi-9 ja loppupään kohdistaa kaspaasi-3 [31]. Tästä huolimatta luontaisen apoptoottisen reitin, pro-apoptoottiset ligandeja, kuten FasL, sitoutumalla niiden reseptoreihin, aiheuttavat kaspaasi-8 ja loppupään efektoreja, kuten kaspaasi-3. Aktivointi Vaikuttajasolujen caspases indusoi pilkkomista monissa solun alustoissa ja aiheuttaa suoraan apoptoosin [31] - [33]. Vaikka useat aikaisemmat raportit osoittivat, että apoptoosin oli vastuussa Res aiheuttama kasvun estäminen, emme tarkkailla ilmeistä apoptoosin Res saaneilla GC soluissa. Tämä puute apoptoosin voi johtua pitoisuuden ja keston Res mukautettu hoito meidän kokeessa, koska tutkimukset eri ryhmistä osoittavat, että Res kykenee annostelu ja kesto-riippuvia vaikutuksia [34], [35]. Lisäksi koska vaikutukset Res ovat myös soluspesifisestä [36] - [38], GC käytettävät solut tutkimuksessamme voivat olla resistenttejä Res indusoiman apoptoosin.

Res on useita tavoitteita; joista, luokan III NAD ^{+ - riippuvainen deasetylaasi SIRT1 on useimmin tutkittu. Vaikka biokemiallinen tutkimus osoitti, että Res ei ollut suoraa aktivaattori SIRT1 [39], Res on silti pidetty klassinen agonistina SIRT1. Lukuisat tutkimukset osoittavat, että Res kykenee erilaisia ​​vaikutuksia eri malleja on SIRT1 riippuvaisella tavalla [40], [41]. Meidän kokeessa SIRT1-ehtyminen päinvastaiseksi kasvun eston Res sekä in vitro
ja in vivo
. G1 vaiheen pysähtymisen ja vanhenemista aiheuttama Res käsittely pelastuivat SIRT1-ehtyminen. Nämä tulokset osoittavat, että inhibitio vaikutukset Res GC ovat riippuvaisia ​​SIRT1. Edellä olevien tutkimusten SIRT1 voi säädellä geeniekspressiota kautta kaksi eri mekanismia. Ensimmäinen, välittömästi, SIRT1 suoraan välittää deasetylointi proteiinin ja parantaa sen ubikinaation ja sen jälkeen ubikitiinipromoottori proteasomi hajoaminen [42]. Toiseksi välillisesti SIRT1 kiinnostavuus deasetylaasi aktiivisuus vaikuttavat kromatiinin vahvistus tai tukahduttaa toimintaa transkriptiotekijöiden ja sitten säätelee geenien transkriptiota [43] - [45]. Koska molekyylit (sykliini D1, CDK4, CDK6, p21 ja p16) havaittiin kokeissa ei ole raportoitu suora tavoitteet SIRT1, me arveltu, että SIRT1 voisi säädellä näiden geenien ilmentymistä pääasiassa epäsuorasti mekanismi. Tulokset RT-QPCR tukevat tätä hypoteesia.}

Yhteenvetona havaintomme osoittavat, että Res estää sekä leviämisen GC-solujen in vitro
ja kasvua ksenografteista in vivo
. Res hoito indusoi G1 vaiheen pysähtymisen GC soluissa ja johtaa vanhenemista sijasta apoptoosin. SIRT1-ehtyminen pelastaa edellä kuvatut vaikutukset Res sekä in vitro
ja in vivo
. Työmme osoittaa, että Res estää GC on SIRT1 riippuvaisella tavalla ja antaa yksityiskohtaista näyttöä mahdollisuuden soveltaa Res GC ehkäisemiseksi ja hoitamiseksi.

tukeminen Information
Kuva S1.
Res ei kohdista vaikutuksia apoptoosiin BGC-823 soluja. (A) Apoptoosi osoittaa TUNEL merkinnät (punainen) ja BGC-823 solut vastavärjättiin DAPI (sininen). Käsittely H 2O 2 toimi positiivisena kontrollina. Alkuperäinen suurennus: × 200. Mittaviivat 50 pm. (B) Säätimet apoptoosin BGC-823-soluja, mukaan lukien Bcl-2, Bax ja kaspaasi-3 analysoitiin western-blotilla. (C) Säätimet apoptoosin ksenografteissa, mukaan lukien Bcl-2, Bax ja kaspaasi-3 analysoitiin western-blotilla. Havaitsemiseksi pilkotun kaspaasi-3, BGC-823 soluja käsiteltiin H 2O 2 toimi positiivisena kontrollina (näkyy oikea paneeli). (D) apoptoosi ksenografteissa havaittiin TUNEL merkinnät (punainen) ja leikkeet vastavärjättiin DAPI (sininen). Palasia naispuolinen jyrsijän rintarauhasen saatu 3~5 vieroituksen jälkeen rotan poikasten (Millipore) toimi positiivisena kontrollina. Alkuperäinen suurennus: × 200. Mittaviivat 50 pm. 'R' edustaa resveratroli, "Ci 'edustaa ohjaus siRNA, ja" Si "edustaa SIRT1 siRNA.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0070627.s001
(TIF) B Kuva S2.
knockdovvn SIRT1 by shRNA-lentivirus. (A) BGC-823-solut transfektoitiin ohjaus- tai SIRT1-specific shRNA-lentivirukset. Transfektion tehokkuus arvioitiin fluoresenssimikroskoopilla. Tällä infektiokertoimella (MOI) 50, yli 90%: n solut transfektoitiin shRNA-lentiviruksen. Neljän viikon jälkeen seulonta puromysiinin kanssa, kaikki elävät solut transdusoitiin. Suurennus: × 100, bar 200 um. (B) Solut kerättiin 4 päivää infektion jälkeen ja 28 päivää sen jälkeen puromysiiniä seulonnan. Äänenvaimennusjärjestelmä tehokkuus SIRT1 varmistettiin western blot.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0070627.s002
(TIF) B Taulukko S1.
Alukkeet RT-QPCR suoritetuissa kokeissa tässä tutkimuksessa.
doi: 10,1371 /journal.pone.0070627.s003
(DOC) B

• PLoS ONE: RhoE Edistää Etäpesäke mahasyövän kautta mekanismin Riippuu Enhanced Expression of CXCR4
• PLoS ONE: mykofenolihappo Estää Migration ja Invasion mahasyövän Cells kautta Useita Molecular polut