PLoS ONE: Calpain /SHP-1 Vuorovaikutus by Honokiol vaimennus Peritoneaalisille levittäminen mahasyövän nu /nu Mice

tiivistelmä

Background

Honokiol, pienen molekyylipainon luonnontuote, on aiemmin raportoitu aktivoida apoptoosia ja estää mahalaukun kasvaimen kehittymisen. Onko honokiol estää angiogeneesiä ja etäpesäkkeiden mahalaukun syöpäsolujen edelleen tuntematon.

Menetelmät /Principal Havainnot

Testasimme vaikutukset honokiol on angiogeeninen aktiivisuus ja vatsakalvon levittäminen käyttämällä in vivo, ex vivo
ja in vitro
-analyysijärjestelmissä. Signalointi vasteet ihmisen mahasyövän soluja, ihmisen napanuoran verisuonten endoteelisolut (HUVEC), ja eristetyt kasvaimia havaittiin ja analysoitiin. Vuonna ksenografti mahakasvaimen hiirimallissa, honokiol estivät merkittävästi vatsakalvon levittämistä havaita PET /TT tekniikkaa. Honokiol myös tehokkaasti vaimennettu angiogeneesiä havaitaan poikasen rakkokalvon kokeessa, hiiren Matrigel plug määritys, rotan aortan rengas endoteelisolujen itämistä määrityksessä, ja endoteelisolujen putken muodostumista määrityksessä. Lisäksi honokiol tehokkaasti parantaa signaali anturin ja aktivaattori transkription (STAT-3) defosforyloinnilla ja estivät STAT-3 sitoutuu DNA: han ihmisen mahalaukun syöpäsoluissa ja HUVEC, joka korreloi säätely ylöspäin aktiivisuuden ja proteiinin ilmentymistä Src homologia 2 (SH2) sisältävä tyrosiinifosfataasin-1 (SHP-1). Calpain-II-estäjä ja siRNA transfektio merkittävästi päinvastaiseksi honokiol aiheuttama SHP-1 aktiivisuutta. Vähentynyt STAT-3 fosforylaation ja lisääntynyt SHP-1 ilmentymisen myös esitetty yksittäisiä vatsakalvon etäpesäkkeitä. Honokiol kykeni myös inhiboimaan VEGF sukupolven, jota voitaisiin kumota SHP-1 siRNA transfektiota.

Johtopäätökset /merkitys

Honokiol lisää ekspressiota ja aktiivisuutta SPH-1, joka edelleen deaktivoi STAT3 kautta. Nämä havainnot viittaavat siihen, että honokiol on uusi ja angiogeneesin estäjä ja vatsakalvon levittäminen mahalaukun syöpäsoluja, mikä tukee soveltamisen mahdollisuuksia honokiol mahalaukun syövän hoidossa.

Citation: Liu SH, Wang KB, Lan KH, Lee WJ, Pan HC, Wu SM, et ai. (2012) Calpain /SHP-1 Vuorovaikutus by Honokiol vaimennus Peritoneaalisille levittäminen mahasyövän nu /nu
Hiiret. PLoS ONE 7 (8): e43711. doi: 10,1371 /journal.pone.0043711

Editor: Henrik Einwaechter, Klinikum rechts der Isar der TU München, Saksa

vastaanotettu: 17 tammikuu 2012; Hyväksytty: 24 heinäkuu 2012; Julkaistu: 24 elokuu 2012

Copyright: © Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat tutkimusapurahoja Taichung Veterans General Hospital, Taiwan (TCVGH-997314C, TCVGH-1007313C) ja National Science neuvoston Taiwan (NSC99-2320-B-005-003-MY3). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

suurin osa potilaista (-60%) ja mahasyövän diagnosoidaan myöhään tauti. Mahalaukun syöpä on toiseksi yleisin syy maailmanlaajuiseen syöpään kuolleisuus kehittyneissä maissa ja jolla etäpesäkkeitä aikaan diagnoosi [1]. Leikkaus ja yhdistelmä solunsalpaajahoitojen mahasyövän on osoitettu antavan vain vaatimaton selviytymisen etuja kehittyneissä tapauksissa, ja lähes 50% potilaista kuolee jälkeen toistumisen [2], [3]. Merkittävä muoto toistuminen on vatsakalvon levittämiseen. Syövän kasvua ja vatsakalvon etäpesäke ovat angiogeneesistä riippuvaisia, prosessi, joka liittyy useita angiogeenisten tekijöiden, mukaan lukien verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF), epidermaalinen kasvutekijä (EGF), fibroblastien kasvutekijä, prostaglandiini E2: n, interleukiini-8, kemokiini (CXC-motiivin) ligandin 1, ja matriksimetalloproteinaasi perheen [4] - [6]. Useat molekyyli signaaleja, kuten signaalin anturin ja aktivaattori transkription-3 (STAT-3), tumatekijä-EB, Akt, mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasien, syklo-oksigenaasi-2, lipoksigenaasin, indusoituva typpi--pioksidisyntaasia, tuumorinekroositekijä ja muut , on myös osoitettu olevan osallisena kasvaimen etenemiseen ja angiogeneesissä [7] - [9]. Kuitenkin solu- ja molekyylitason mekanismeja kehittämiseen, eteneminen, ja etäpesäke mahasyöpä vielä epäselviä.

Janus-aktivoitu kinaasi (Jak) /STAT signalointireitin tärkeä rooli säätelyssä solujen kasvua, angiogeneesin, erilaistuminen, muuttoliike, ja etäpesäkkeiden [10]. Konstitutiivisen aktivaation STAT polkuja, erityisesti STAT-3, on liittynyt monenlaisia ​​ihmisen syöpäsairauksia. Jatkuva STAT-3 fosforylaation on havaittu useissa erilaisissa ihmisen syövissä, kuten kiinteitä kasvaimia mahan, paksusuolen, maksan, eturauhas-, rinta-, keuhko-, ja pään ja kaulan sekä veren pahanlaatuisia kasvaimia [8], [10]. Aiempi tutkimus on osoittanut, että fosforylaatio STAT-3: n ja VEGF-proteiinin ilmentyminen on lisääntynyt ihmisen mahasyövän kudos, joka puolestaan ​​nostaa angiogeeninen fenotyyppi ja edistää mahalaukun syövän kehittymisen ja etenemisen [11]. Toisaalta tietyt fosfataasit tiedetään olevan tuumorisuppressoreilla, ja se voi olla tärkeä rooli inhibitio tai valvontaa syövän kasvua [12] - [15]. Proteiini tyrosiinifosfataasien (PTP), mukaan lukien SH2 domain sisältäviä tyrosiinifosfataasin (SHP) -1 ja SHP-2, pystyvät säätelemään negatiivisesti STAT signalointi tyrosiini defosforyloitumista useiden komponenttien liittyvän signaalireitteihin [13] - [15] . Jatkuva aktivointi STAT-3 kasvaimissa voidaan helpottaa ainakin osittain lakkaa toimimasta näiden fosfataasien. Calpain II on osoitettu rooli Endoplasmakalvosto (ER) stressiin säännelty tumorigeneesin, joka osallistuu mekanismi honokiol-estivät mahalaukun tumorigeneesin [16]. Lisäksi edellinen tutkimus on osoittanut myös, että SHP-1 on endogeeninen substraatti calpain seuraavista A23187-aiheuttamaa verihiutaleiden aktivaation [17]. Siksi kalpaiinin /SHP-1-säännelty STAT-3: n ja VEGF reitti voi olla mukana angiogeneesiin, kasvua, ja vatsakalvon levittäminen mahalaukun syöpäsoluja.

Honokiol, pienen molekyylipainon luonnontuote, on merkittävä aktiivinen biphenolic yhdiste Magnolia officinalis
, jonka tiedetään parantaa mikrobi-infektion, tulehduksen ja ruoansulatuskanavan häiriöt perinteisissä Aasian lääkkeiden järjestelmiä [18]. Edellisessä tutkimus osoitti, että honokiol estää mahalaukun tuumorigeneesiä aktivoimalla 15-lipoksigenaasin-1 ja sen seurauksena inhibitio peroksisomiproliferaattoriaktivoidun reseptorin-A: n ja COX-2-riippuvainen signaalien [19]. Honokiol on osoitettu aiheuttavan ER stressiä ja käynnistää calpain-II-välitteinen glukoosin säätelemä proteiini-94 lohkominen ja apoptoosin ihmisen mahasyövän soluihin [16]. On osoitettu, että VEGF: n ilmentyminen voisi olla vasteellinen ravinteiden puutetta olosuhteissa, jotka aiheuttavat ER stressiä [20], [21]. Lisäksi ER-stressi aktivaattori tunikamysiini on todettu selvästi estää hiussuonten kehityksen, mikä viittaa siihen, että tämä ER stressin indusoija voi olla potentiaalinen rooli rinta- kasvaimen hoidossa [21]. Vaikutukset honokiol on ER stressin korreloivat angiogeneesiä ja mahakasvaimen etäpesäke ovat vielä epäselviä. Täällä arveltu, että honokiol estää angiogeneesiä ja vatsakalvon levittäminen mahalaukun syöpäsolujen kautta calpain /SHP-1-säänneltyjen STAT-3: n ja VEGF-reitin. Tulokset osoittivat, että honokiol selvästi esti angiogeneesiä ja vatsakalvon levittäminen mahalaukun syöpäsolujen kautta calpain /SHP-1 vuorovaikutuksen aktivoimien STAT-3 defosforyloinnilla ja VEGF alassäätöä polku.

Tulokset

Honokiol estetty Peritoneaalisille etäpesäke mahasyövän in vivo

Syöpä on usein ominaista suosia [ ^{18F] fluori-2-deoksi-D-glukoosia (FDG), ja [ 18F] -FDG /PET voi toimia korvikkeena mittana terapeuttista tehoa. Toiminnallinen mahdollisuus pieneläinten kuvantamisen avulla kliinisen PET /TT-laite, jossa FDG arvioitiin. Neljä ryhmää hiiriä varten vatsakalvon etäpesäke kokeissa tutkittiin. Selvitys /kuva etäpesäkkeiden tilannetta esitetään kuviossa 1. Hyödynsimme [ 18F] -FDG-PET /TT havaita vatsakalvon etäpesäkkeitä hiirillä ympätty ihmisen mahalaukun syöpäsolujen (MKN45 tai SCM-1) kanssa tai ilman honokiol hoitoon. Kuten kuviossa 2 on esitetty, suurin intensiteetti projektio tuotetaan tyypillinen edustaja hiirillä. Vatsakalvon etäpesäke leimasi kontrollihiirissä (vasen paneeli), ja se oli tehokkaasti muuttamaan jonka honokiol hoito (oikea paneeli). Nämä kuvat osoittavat selvästi, että noninvasive [ 18F] -FDG sisäänottokyvyt vatsakalvon etäpesäkkeitä valvonta hiiret olivat huomattavasti korkeammat kuin vuonna honokiol hoidetuissa hiirissä. Kvantifiointia intensiteetti on esitetty kuviossa 3A. Vatsaonteloon honokiol (5 mg /kg, kaksi kertaa /viikko) vähensi merkittävästi arvioitu radioaktiivisuusyksiköllä ja erityisiä sisäänoton arvot (SUV) määritetään FDG-PET /CT hiirillä, jotka inokuloitiin mahalaukun syövän solut (Fig. 3). Lisäksi monet etäpesäkenystyröiden löytyivät vatsaonteloon (suoliliepeessä) valvonnan hiirillä, jotka inokuloitiin MKN45 ja SCM-1 (Fig. 2) soluja. Sen sijaan, vatsakalvon kasvaimen kyhmyjä todettiin yksittäisesti käsitellyissä hiirissä honokiol. Kvantifiointi kyhmyt kohti kentän esitetään kuviossa 3B.}

Honokiol Inhibioitu Angiogeneesi in vivo
, ex vivo
, ja in vitro

Endoteelisolut ovat kriittisiä angiogeenisen prosessin, joka on tarpeen kasvaimen kasvu ja etäpesäke. Me seuraavaksi tutkittiin angiogeenisen vaikutuksen honokiol käyttäen kananpojan rakkokalvon määritys ( CAM
määritys), Matrigel tulppa määritys, aortan rengas itämistä määrityksessä, ja endoteelisolujen putken muodostumiseen. Kuten on esitetty kuviossa 4A, honokiol esti tehokkaasti neo-verisuonten muodostumista CAM
määritykseen ilman mitään näkyvää vaikutusta ennestään verisuonia. Kvantitatiivinen analyysi paljasti, että honokiol aiheutti 2,5-kertaisen määrän väheneminen vasta muodostuneiden verisuonten verrattuna, että väliaineen ohjaus.

Matrigel tulppa määrityksessä, matrigeeliä, joka sisälsi VEGF (100 ng /ml geeliä) ja tai ilman honokiol (10 ug /ml) implantoidaan ihon alle nude-hiiriin. 21 päivän kuluttua implantaatiosta muodostunut matrigeelin tulpat leikattiin ja valokuvattiin. Tulpat VEGF yksin olivat selvästi juovikas, verisuonten ja punainen. Tulpat sisältävät VEGF: n ja honokiol olivat kalpea, mikä osoittaa lainkaan tai vähemmän verisuonten muodostumista (Fig. 4B-a). Tutkimme myös suonitiheys ja alus morfologian pistokkeen kohdissa H & E-värjäys ja immunohistokemiallista värjäystä vasta-aineella CD31, joka on endoteelisolumarkkeri. Vaskularisaatio on honokiol + VEGF ryhmän väheni merkitsevästi verrattuna VEGF yksin ryhmä (Fig. 4B-b). Kvantifiointi vaskularisaation laskemalla alusten ja esitetty endoteelisolujen paljasti, että verisuonten tiheys honokiol-käsitellyssä ryhmässä oli merkittävästi vähentynyt (kuviot. 4B-c ja 4B-d).

Seuraavaksi endoteelisolut indusoitiin versoa eristetyistä rotan aortan renkaita läsnä ollessa Matrigel ja ECGM (endoteelisolujen kasvualusta), joka sisälsi angiogeenisten sytokiinien, kuten VEGF, ja emäksinen fibroblastikasvutekijä. Laaja endoteelisolujen seuraus rotan aortan rengas eksplanttien havaittiin kontrolliryhmässä (Kuva. 5A). Honokiol hoito johti merkittävään (~five-kertainen) väheneminen endoteelin seuraus ja versoja aorttarenkaat (kuviot. 5A ja 5C). Lisäksi morfologiset erilaistumisen endoteelisolujen putken muodostumiseen tutkittiin käyttäen kaksiulotteista matrigeeliä menetelmällä. Kuten kuviossa 5B on esitetty, kylvö HUVEC in matrigeeliä johti verisuonten putkimaisen rakenteen muodostuminen. Honokiol tehokkaasti inhiboi endoteelisolujen putken muodostumiseen vähentämällä putkimainen rakenne pituus ja leveys (kuviot. 5B ja 5D).

Honokiol poistetaan STAT-3: n signaloinnin Human Mahalaukun Syöpäsolut, HUVEC, ja kasvaimia

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet vahvaa korrelaatiota aktivoitu STAT-3 ja angiogeeninen fenotyyppi [11]. Olemme edelleen selvitetty vaikutusta honokiol on fosforylaatiota STAT-3 ihmisen mahasyövän soluja (MKN45 ja AGS) ja HUVEC. Kuten kuviossa 6 on esitetty, honokiol vähensi tyrosiini (Tyr705) fosforylaatio STAT-3 on aika-riippuvaisella tavalla noin kaksi kertainen pieneneminen 1-2 h AGS-soluissa (kuvio. 6A) ja 3 10- kertainen pieneneminen 0,5-24 h MKN45 soluissa (kuvio. 6B). Yllättäen honokiol indusoi STAT-3 defosforylointia Tyr705, mutta ei Ser727, tähteet näissä ihmisen mahalaukun syöpäsoluja. Kuitenkin honokiol samanaikaisesti estämällä sekä Tyr705 ja Ser727 fosforylaation STAT-3 HUVEC (Fig. 6C). Kvantitatiivinen analyysi proteiinin bändejä Western blot käyttäen Image-Pro Plus ohjelmisto on esitetty kuviossa 7. tulokset analyysin kanssa -konfokaalimikroskoopilla osoitti myös, että honokiol poisti tyrosiini (Tyr705) fosforylaatio STAT-3 AGS soluissa ja HUVEC (kuvio . 8A).

tutki vielä STAT-3 fosforylaation in vatsakalvon etäpesäkkeitä eristetty nude-hiirissä inokuloitu MKN45 solujen kanssa tai ilman honokiol (5 mg /kg) hoitoon. Immunohistokemiallinen analyysi osoitti, että p-STAT-3 yli-ilmentymisen ja kerääntymistä kasvaimen alueella, myös ytimet ja solulimassa, merkittävästi kumota honokiol hoito (Fig. 8B). Vuonna Western blotting-analyysi, honokiol merkittävästi vähentynyt kertyminen p-STAT3 tuumoreissa verrattuna ajoneuvon ohjaus (Kuva. 9A). Ilmaisu konstitutiivisen STAT3 ei vaikuttanut. Lisäksi DNA: ta sitovaa aktiivisuutta STAT-3 vahvistettiin edelleen käyttäen EMSA. Kuten on esitetty kuviossa 9B, honokiol inhiboivat merkittävästi lisääntynyt DNA: ta sitovaa aktiivisuutta STAT-3 ihmisen mahalaukun syöpäsoluja. Honokiol esti myös VEGF-kasvoi STAT-3 DNA: n sitoutuminen aktiivisuus HUVEC-soluja (kuvio. 9B).

Honokiol aiheuttama SHP-1-säännelty STAT-3: n defosforylaatio mahasyövän, endoteelisolut, ja kasvaimia

SHP-1 on ei-transmembraaninen PTP [12]. Me seuraavaksi tutkittava, onko honokiol voi säädellä ilmentymistä ja toimintaa SHP-1. Kuten kuviossa 10A on esitetty, honokiol parantaa proteiinin ilmentymistä SHP-1, mutta ei SHP-2, ja HUVEC ja AGS solujen ajan riippuvalla tavalla. Farmakologiset PTP estäjä ja SHP-1 siRNA transfektiota tehokkaasti poisti honokiol aiheuttama STAT-3 defosforyloinnilla in HUVEC ja AGS soluja (Kuva. 10B-a). Samanlaisia ​​tuloksia SCM-1-soluja ja SV-40 kuolemattomiksi hiiren mikroverisuonten endoteelisoluja (SVECs) käsiteltiin honokiol on esitetty kuviossa 10B-b. Me seuraavaksi tutkittava, onko endogeeninen SHP-1 moduloidaan honokiol. Honokiol kykeni muistelemalla SHP-1 aktiivisuutta mahasyövän soluissa, HUVEC ja SVECs on ajasta riippuva tavalla (kuva. 11A). Honokiol myös lisännyt SHP-1-proteiinin ilmentyminen vatsakalvon etäpesäkkeitä eristetty MKN45-ympätty hiirten paljasti immunohistokemiallisella analyysillä (Kuva. 11B). Tutkimme lisäksi vuorovaikutusta SHP-1 ja STAT-3 käyttäen menetelmiä samanaikainen immunosaostus ja Western blotting. Kuten on esitetty kuviossa 11C, SHP-1 spesifisesti liittyy STAT-3 AGS soluissa ja HUVEC: n läsnä ollessa honokiol verrattuna IgG-ohjaus.

Honokiol Altered ER morfologia, indusoi Calpain-II-säännelty SHP -1-indusoidun STAT-3: n defosforylaatio, ja vähentynyt VEGF Generation

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että ER-stressi on tärkeä rooli angiogeneesissä [20], [21]. Me seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus honokiol on ER mikrorakenteen transmissioelektronimikroskopialla. Kuten kuviossa 12A, ER laajentumista ja pirstoutuminen oli näytteillä honokiol saaneilla SCM-1 mahalaukun syöpäsoluja ja HUVECeja.

Lisäksi halusimme selvittää calpain-II aktivoitumista tarvitaan SHP-1 aktiivisuutta honokiol saaneista soluista. Farmakologiset kalpaiinia estäjä ja calpain-II siRNA transfektio vähentää tehokkaasti honokiol tehostetun SHP-1 aktiivisuutta AGS soluissa ja HUVEC (Fig. 12B). Solut, jotka käsitelty yhdistelmä-DNA-kalpaiini-II, positiivisena kontrollina, osoitti 4-5-kertainen SHP-1-aktiivisuuteen (Fig. 12B). VEGF: n tiedetään sisältävän STAT-3-promoottori sitoutumiskohdan. Me seuraavaksi tutkittava, onko honokiol voi säädellä VEGF ilme. Honokiol vähensi VEGF sukupolven AGS soluissa ja HUVEC, ja tämä vaikutus purettiin SHP-1 siRNA transfektiota (Fig. 12C). Lisäksi transfektio mutantti-STAT-3-plasmidi soluihin esti myös VEGF-sukupolvi. Yhdistelmä honokiol kanssa mutantti-STAT-3 plasmiditransfektiolla soluissa synergistisesti vähensi VEGF tuotantoa verrattuna jompikumpi hoito yksinään (Fig. 12C). Edelleen vahvistaa vuorovaikutusta calpain-II ja SHP-1, samanaikainen immunosaostus ja Western blotting suoritettiin mahalaukun syöpäsoluja. Kuten on esitetty kuviossa 12D, kalpaiinin-II jotka liittyvät erityisesti SHP-1 AGS-soluissa, kun läsnä on honokiol (20 uM) verrattuna IgG-kontrolli. Samoin honokiol aiheuttama calpain /SHP-1 vuorovaikutus havaittiin myös HUVEC-soluja (tietoja ei esitetty).

Keskustelu

Honokiol on tärkeä osa Magnolia officinalis
, joka on siirtymäkauden lääke Aasiassa [18]. Honokiol hallussaan anti-oksidatiivisen ja tulehdusta estäviä in vitro
ja in vivo
[22] - [25]. Honokiol on osoitettu olevan voimakkaita anti-proliferatiivista aktiivisuutta endoteelisolujen in vitro
ja kasvaimen vaikutuksia vastaan ​​angiosarcoma nude-hiirissä [26]. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet ensimmäistä kertaa, että honokiol on voimakas angiogeneesin estäjä ja vatsakalvon etäpesäkkeiden mahasyövän. Tutkimuksemme on keskittynyt vaikutuksia ja mahdollisia mekanismeja honokiol peritoneaalidialyysia etäpesäke ja angiogeneesiä käytetään PET /CT, CAM
määrityksessä Matrigel plug määritys, aortan rengas endoteelisolujen itämistä määrityksessä, endoteelisolujen putken muodostumiseen määrityksessä, ja in vitro
Solukokeita. Tulokset osoittivat, että honokiol voivat tukahduttaa angiogeneesiä ja vatsakalvon levittämistä kautta calpain-II-aktivoitu SHP-1 aktivaatio signalointiryöpyn. Aktivointi fosfataasin SHP-1 honokiol edelleen johti alas-säätely STAT-3 aktivointi ja VEGF tuotantoa, mikä johtaa angiogeneesin inhibitiota ja vatsakalvon etäpesäke. Kuitenkin, angiogeneesin inhibitiota ja estämällä metastaattista potentiaalia syöpäsolujen honokiol voi olla erillinen osa, joista toinen on vaikutusta honokiol angiogeneesiin suoraan ja toinen vaikutus honokiol syöpäsoluihin.

Viime useita vuotta, useat tutkimukset ovat osoittaneet, että konstitutiivinen aktivointi STAT perheen, erityisesti STAT-3, liittyy soluproliferaatioon, angiogeneesin ja metastaasin [10], [11], [27] - [30]. Aktivoitunut STAT-3: n ekspressio on löydetty eri kasvain- soluja ja näytteitä ihmisen syöpäkudoksissa. Vapautettiin STAT-3 aktivointi on ehdotettu olevan tärkeä rooli yli-ilmentymisen VEGF ja lisääntynyt angiogeenisten fenotyyppejä mahasyövän, jotka voivat vaikuttaa mahalaukun syövän kehittymisen ja etenemisen [11]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että honokiol voidaan tehokkaasti estää fosforylaation STAT-3: HUVEC-soluja (sekä Tyr705 ja Serine727 sivustot), ihmisen mahasyövän soluja (Tyr705 päällä), ja vatsakalvon etäpesäkkeitä (Tyr705 site). Koska onkogeeninen aktivaatio tyrosiinikinaasien on yhteinen piirre syöpiä keskityimme roolista Tyr705 fosforylaation STAT-3.

SHP-1 hallussaan potentiaalinen tuumorisuppressoriproteiinia funktio ja on negatiivinen säätelijä JAK /STAT signalointireitti [15]. On myös osoitettu, että SHP-1 fosfataasi voi sitoutua fosforyloidun Y1173 verkkotunnuksen, joka johtaa EGFR defosforylaatio [31]. Y429, että sytoplasminen domeeni erytropoietiinireseptoriin on ehdotettu olevan sitoutumiskohdan proteiinityrosiinifosfataasi SH-PTP1, joka voi olla tärkeä rooli päättämisestä proliferatiivisen signaalit [32]. SHP-1 on myös osoitettu olevan antagonisti kasvutekijän signalointi epiteeli- ja hematopoieettisten solujen [15]. SHP-1 oli erityisen korostettiin mahdollisena fysiologinen antagonisti VEGFR signaloinnin [33]. Endoteelisoluissa, SHP-1 liitetään fyysisesti VEGFR2 ja tarvitaan myös sekä TNFa-välitteisen ja kudos-estäjä metalloproteinaasien (TIMP) -välitteisen angiogeneesin estäminen [31]. Siten SHP-1 aktivaatio voi olla merkittäviä vaikutuksia sääntelyn lisääntymistä ja angiogeneesiä. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että honokiol erityisesti tehostettu ilmentyminen SHP-1, mutta ei SHP-2, mahalaukun syövän, endoteelisolujen, ja vatsakalvon etäpesäkkeitä. Nämä havainnot viittaavat siihen, että honokiol voivat estää endoteelisolujen angiogeneesiä ja syöpäsolumetastaasi, joka voi olla esimerkiksi SHP-1 aiheuttama STAT-3 alassäätöä polku.

Aikaisemmat tutkimukset ovat ehdottaneet tärkeä rooli ER stressin molekyylimekanismi angiogeneesiä ja syöpäsolujen kasvua [16], [20], [21]. Koyama ja kollegat ovat myös ehdottaneet, että ER stressin aiheuttama kalsiumin häiriöt voivat olla mukana induktioon amyloidi β keskittymisen ja angiogeenisen tekijän ilmentymistä verkkokalvon pigmenttiepiteelin [34]. Tuore tutkimus on osoittanut, että ER stressin säännelty IRE-1α signalointi hallussaan olennainen toiminto istukan kehitys ja alkion elinkelpoisuuden korostaen suhde ER stressiä, ja angiogeneesi istukan raskauden aikana [35]. Kim ja kollegat ovat osoittaneet, että sekä SHP-1 ja SHP-2 ovat endogeenisia substraatteja kalpaiinia, joka on mukana yhteydessä suoliameba
indusoimaan isännän solukuolemaa [36]. Erityisesti kalpaiinien aktivoituvat, kun solunsisäisen kalsiumin ([Ca ^{2+] i) pitoisuus on koholla; m-kalpaiinin (kalpaiini II) vaatii [Ca 2+] i klo millimoolia alueella, mutta mikromolaarinen pitoisuuksia [Ca 2+] i ovat riittävän aktivointi μ-calpain (kalpaiini I) [37 ], [38]. On osoitettu, että korkea taso [Ca 2+] i estää Proteiinityrosiinikinaasin aktiivisuuden seurauksena calpain aktivoinnin aikana stimulaatiota ionoforin verihiutaleiden [39]. Honokiol kykeni indusoimaan [Ca 2+] i mobilisointi hermosoluissa [40]. Viime aikoina, tunikamysiini on raportoitu estävän angiogeneesiä in vivo
. Aikaisemmat tutkimus on osoittanut, että honokiol indusoi ihmisen mahasyövän apoptoosia ja estää kasvaimen kehittymisen kautta calpain välittämää glukoosin säätelemä proteiini-94 pilkkominen [16]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme mutkattomasti osoittaneet, että ER olivat laajentuneet ja hajanainen honokiol saaneilla mahalaukun syöpäsoluja ja HUVECeja. Lisäksi farmakologinen estäjä kalpaiini ja calpain-II siRNA transfektio vähentää tehokkaasti honokiol tehostetun SHP-1 aktiivisuutta mahalaukun syöpäsoluissa ja HUVECeja. Erityisesti tuloksemme ensimmäistä kertaa osoitettu, että calpain /SHP-1 vuorovaikutus suoraan laukaisee honokiol estämällä STAT-3 fosforylaation mahalaukun syöpäsoluja. Nämä tulokset osoittavat, että honokiol voi aiheuttaa ER stressiä ja laukaista calpain-II-aktivoitu SHP-1 aktiivisuutta mahasyövän solujen ja endoteelisolujen.}

Yhteenvetona tulokset Tämän tutkimuksen tarjoavat in vivo , ex vivo
ja in vitro
todisteita angiogeneesin estäminen ja vatsakalvon levittäminen mahalaukun syöpäsolujen honokiol ja molekyylitason perustan sen vaikutuksia. Nämä tiedot korostavat osallistumista ER kalpaiini ja proteiinityrosiinifosfataasi SHP-1 signalointi honokiol-esti STAT-3 aktivointi ja VEGF tuotantoa mahalaukun syövän solujen ja endoteelisolujen (Fig. 13). Nämä havainnot viittaavat myös siihen, että alas-säätely STAT-3: n ja VEGF signalointi indusoi calpain /SHP-1 saattaa olla lupaava terapeuttinen strategia mahasyövän hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

Cells ja kulttuuri

Ihmisen mahalaukun syövän solulinjat kuten valkoihoinen solulinja (AGS, kohtalaisen /huonosti (mixed) eriytetty adenokarsinoomasolua) ja Aasian solulinjoja (MKN45 ja SCM-1, erilaistumaton adenokarsinoomasolua) saatiin kantasolupankit Taipei Veterans General Hospital (Taiwan). Soluja pidettiin RPMI1640-alustassa, joka sisälsi 10% FCS: ää ja streptomysiiniä /penisilliiniä kostutetussa 5% CO _{2-ilmakehässä.}

HUVEC saatiin napanuorasta verisuonia kollagenaasikäsittelyn kuten aiemmin on kuvattu [41]. Tämä tutkimus noudattaa periaatteita käytettäväksi ihmiskudosten hahmoteltu Helsingin julistuksen. Tutkimuksen protokolla hyväksyi eettinen Review Board of Taichung Veterans General Hospital, Taichung, Taiwan (hyväksytty asiakirja TCVGH-C0062-1). HUVEC kolmannessa passage käytettiin. Transfektion tehokkuus (> 80%), jonka Lipofectin-reagenssia (Invitrogen) määritettiin kolmannen kanavan. Joissakin kokeissa, SV-40 kuolemattomiksi hiiren mikroverisuonten endoteelisoluja (SVECs) viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1% penisilliini /streptomysiiniä. SVEC noomasolulinjasta lahjakas tri KH Lan (Cancer Center, Taipei Veterans General Hospital, Taiwan).

Honokiol saatiin Wako Chemical Company (Osaka, Japani), ja se määritettiin olevan ainakin 99% puhdasta HPLC: llä. Eri pitoisuuksia honokiol käytettiin tässä tutkimuksessa riippuen lääkeaineen herkkyys osoitetaan IC50-arvot (20 uM AGS, 40 uM MKN45 ja SCM-1). MKN45 ja SCM-1-soluissa, mutta ei AGS soluja, on osoitettu tehokkaasti aiheuttavan kasvaimia vierassiirrännänmallissa kasvain hiirimallissa.

Eläimet

Kaikki eläinten hoitoon ja kokeellisia toimenpiteitä hyväksyttiin ja suoritti komitean eläinkokeet, National Chung Hsing University, Taichung, Taiwan (hyväksytty asiakirja Nchu-100-26). On neljästä kuuteen viikkoa vanhoja BALB /c-nude-hiiriä ostettiin NLAC (Taipei, Taiwan). Hiiret kasvatettu ja ylläpidettiin spesifisissä patogeenivapaissa olosuhteissa, annettiin steriloitua ruokaa ja vettä ad libitum
ja sijaitsee este laitos, jossa on 12 tunnin valo /pimeä sykli.

Vieraslajisiirteen Kasvain Mouse Model

arvioimiseksi vatsakalvon etäpesäke, viljellyissä ihmisen mahalaukun syöpäsoluja (4~5 x 10 ^{6 solua) inokuloitiin vatsaonteloon BALB /c-nude-hiirissä [42]. Vatsakalvon kasvaimet nude-hiiriä vahvistettiin 7 päivää injektion jälkeen mahalaukun syövän soluja, joissa kasvaimet tarkastettiin PET /CT valvontaa. Sitten hiiriin injektoitiin intraperitoneaalisesti honokiol (5 mg /kg /kahdesti viikossa) ja 28 päivää. Vaikutus honokiol peritoneaalidialyysia levitystä arvioitiin PET /TT. Selvitys /kuva etäpesäkkeiden tilannetta kuvattiin kuviossa 1. Sen jälkeen hiiret tapettiin nukutuksessa (pentobarbitaalin) ja tutkittiin makroskooppisesti läsnäolo vatsakalvon etäpesäke. Kasvaimet irrotettiin, leikattiin kappaleiksi, kiinnitettiin 10% formaliinilla, ja upotetaan parafiiniblokit tai pakastettu nopeasti nestetyppeen.}

positroniemissiotomografia /Tietokonetomografia (PET /TT) skannaus

Kun vähintään 6 tunnin paasto, hiirille annettiin 7,4 MBq (0,2 mCi) annos ^{18F-FDG suullisesti huuhtelemalla 1 ml vettä. Hiiret nukutettiin isofluraanilla höyrystin ennen jokaisen skannauksen. Kokeet pieneläinten kuvantamisen tehtiin yhdistetty PET /TT skanneri (Discovery ST; GE Medical Systems). Multidetector rivi kierteiset tomografiin käytettiin. Teknisten parametrien CT osa PET /TT olivat seuraavat: CT varustetut, 0,5 sekunnin täysi Viistopyyhkäisytekniikkaa, ilmaisin rivi kokoonpano 16 x 1,25 mm, väli tila 2,75 mm, siivu paksuus 1,25 mm , jaolla 1.75:1 (korkealaatuinen tila), nopeudella 17,5 mm per kierto, suuri field-of-view (FOV), jännite 120 kVp ja 200 mA. Teknisten parametrien käytetty PET osa PET /TT olivat seuraavat: 10,0 min kussakin sängyssä, FOV valittu kuvantamiseen jälleenrakennukseen oli 20 cm ja PET resoluutio noin 4,5 mm puoliarvoleveys (FWHM). Korjaavassa parametrit olivat tyyppiä 3D iterointia kuin 21 alaryhmiä ja 2 toistojen. Arvioidaan määrällisesti kyky PET /TT-laite pieneläinten kuvantamisen, kiinnostuksen kohteena olevan alueen (ROI), laitettiin pienempiin FOV transaksiaalinen PET kuvien kokonaan ympäröimään alueet FDG sisäänottoa havaittu kudoksissa välttäen lähellä kudosten. Keskiarvo kunkin pikselin toiminnan arvo kussakin ROI kirjattiin ja ilmaistiin Bq /ml.}

Chick korioallantoiskalvoon Pitoisuus ( CAM
Assay) B

tutkimiseksi in vivo
angiogeenistä aktiivisuutta, joka on modifioitu chick koko eläin CAM
määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [43]. Hedelmöittynyt poikasen munaa inkuboitiin jatkuvasti kostutettuun muna kasvattaja 37 ° C: ssa. 3 päivän inkuboinnin jälkeen, kanan alkioiden siirrettiin viljelymaljaan. Kaksikymmentä ui honokiol ansaan tyypin I kollageenin seos levitetään pinnoite levyt ja polymeroitiin lämmittämällä. Kiekot lastattu CAM
6 päivän ikäisten alkioiden. Sen jälkeen kun 24-tunnin inkuboinnin ympärillä ladattu levy valokuvattiin Nikon digitaalikamera, ja määrä vastaperustetun alusten laskettiin kaksi tarkkailijoiden kaksoissokkotutkimuksessa tavalla. Määritykset kunkin testinäytteen suoritettiin käyttäen 10-13 munia.

Matrigel Plug Pitoisuus

Nude-hiiriä tai C57BL /6-hiiriin injektoitiin subkutaanisesti 0,6 ml matrigeeliä, joka sisältää ilmoitetun määrän kapsaisiinia , 100 ng VEGF: n, ja 10 yksikköä hepariinia. Injektoitu Matrigel muodostui nopeasti yksi, kiinteä pasta tulppa. Sen jälkeen 7-21 päivää, ihon hiiri helposti vetää takaisin paljastaa matrigeelin tulppa, joka säilyi ennallaan. Hemoglobiini mitattiin käyttäen Drabkinin menetelmä ja Drabkinin reagenssipakkauksen 525 (Sigma, St Louis, MO) kvantifiointiin verisuonten muodostumista. Hemoglobiinin pitoisuus laskettiin tunnetun määrän hemoglobiinia, määritetään rinnakkaisesti. Kuvat valokuvattiin Nikon digitaalikamera, ja määrä vastaperustetun mikro-alusten laskettiin.

Ex vivo
aortan Ring Pitoisuus

aorttoja eristettiin 6 -week Sprague-Dawley-rottia. Levyt (48-kuoppa) päällystettiin 120 ul: matrigeeliä. Aorttoja eristetty hiiriä puhdistetaan periadventitial rasvaa ja sidekudosta, ja leikataan ~ 1 mm pitkä 1,5 mm pitkä renkaita. Oltuaan huuhdeltiin viisi kertaa endoteelisolujen-pohjainen liuoksesta ja aorttoja saatettiin matrigeelin peittämä kaivoja ja peitetään toisella 100 ui Matrigel. Honokiol tai ajoneuvon lisättiin kuoppiin lopulliseen tilavuuteen 250 ui väliainetta.

• PLoS ONE: suhde negatiivisten ja positiivisten imusolmukkeiden sopii arviointi ennusteeseen mahasyövän Potilaat, joilla on positiivinen etäpesäke
• PLoS ONE: Korkea γ-säteily Herkkyys liittyy lisääntynyt mahalaukun syöpäriski kiinalaisessa Han Asukasluku: Case-Control analyysi