PLoS ONE: Maito käymisen Propionibacterium freudenreichii indusoi apoptoosia HGT-1 ihmisen mahasyövän Cells

tiivistelmä

Background

Mahalaukun syöpä on yksi yleisimmistä syövistä maailmassa. N "taloudellisesti kehittyneissä maissa" elämäntapa, kuten ruokavalion, muodostaa riskitekijän suosii tämä syöpä. Ruokavalio modulaatio saattaa alentaa ruoansulatuskanavan syövän esiintymisen. Joukossa lupaava elintarvikkeiden ainesosien, meijeri propionibakteerien osoitettiin laukaista apoptoosin ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa, vapautumisen kautta lyhytketjuisten rasvahappojen asetaatti ja pro- pionaatti.

Menetelmät /Principal Havainnot

piimä yksinomaan käymisen P. freudenreichii
, äskettäin suunniteltu. Tässä työssä, pro-apoptoottisen potentiaalia tämän uuden piimä oli osoitettu HGT-1 ihmisen mahalaukun syöpäsoluja. Käynyt maito supernatantti indusoi tyypillisiä apoptoosin kuten kromatiinin tiivistyminen, muodostuminen apoptoottisten elinten, DNA: n pilkkoutuminen, solusyklin pysähtymiseen ja syntyminen subG1 väestöstä, fosfatidyyliseriinin altistumista solukalvon ulompi selosteessa, reaktiivisen hapen kerääntyminen, mitokondrion kalvon läpäisevä mahdollisia häiriöitä, kaspaasi aktivointi ja sytokromi c: vapauttaa. Yllättävää kyllä, tämä uusi fermentoitu maito P. freudenreichii
tehostettu sytotoksisuus kiinilla huume käytetään mahalaukun syövän kemoterapiassa.

Johtopäätökset /merkitys

Tällaiset uudet probiootti piimä voi siis olla käyttökelpoinen osana ennaltaehkäisevää ruokavalion noudattamista ehkäistä mahasyöpä ja /tai ravintolisänä voimistavan syövän terapeuttisia hoitoja.

Citation: Cousin FJ, Jouan-Lanhouet S, Dimanche-Boitrel MT, Corcos L, Jan G (2012) Milk käymisen Propionibacterium freudenreichii
indusoi apoptoosia HGT-1 ihmisen mahasyöpä syöpäsoluja. PLoS ONE 7 (3): e31892. doi: 10,1371 /journal.pone.0031892

Editor: Abbes Belkhiri, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 marraskuu 2011; Hyväksytty: 19 tammikuu 2012; Julkaistu: 19 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Cousin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoitettiin Conseil Regional de Bretagne läpi CBB développement hankepyynnön ja Centre National interprofessionnel de l'Économie laitière (CNIEL) kautta tieteellisen komitean on Syndifrais hankepyynnössä. Tutkimus IRSET ryhmässä tukivat avustusta Ligue Nationale Contre le Cancer (Côte d'Armor, Ille et Vilaine, Morbihan, Vendée ja Sarthe Valiokunnat), INSERM, University of Rennes 1 ja alue Bretagne. FJC apuraha CNIEL (jatko Fellowship). SJL tukivat Association pour la Recherche sur le Cancer (jatko Fellowship). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Diet moduloi riski sairastua mahalaukun syöpään

syöpä on tärkein kuolinsyy taloudellisesti kehittyneissä maissa johtuvat syöpään liittyvän elämäntapavalintoja kuten tupakointi, vähäinen liikunta ja "länsimainen" ruokavalio [ ,,,0],1]. Itse asiassa roolia ruokavalion syövän kehittymisessä tukevat vahvasti epidemiologisista tutkimuksista, erityisesti syöpien ruoansulatuskanavan. Mahalaukun syöpä (GC) edustaa Kolmas tappavia syöpiä miesten maailmassa. Vuonna 2008, 640,600 tapauksissa GC arvioitiin, mikä aiheuttaa 464,400 kuolemia maailmanlaajuisesti [1]. Tämä tauti on erityisen usein Itä-Aasiassa, ja Keski- ja Itä-Euroopassa. Tärkeimmät etiologisista tekijöitä mahasyövän ovat ruokavalio ja helikobakteeri
infektio. Merkittäviä todisteita, lähinnä tapausverrokkitutkimukset, viittaa siihen, että riski sairastua GC kasvaa korkea saanti suolattu, säilötty tai savustettu perinteisesti elintarvikkeisiin, sekä kuivattua kalaa ja lihaa. Päinvastoin, kuidut, tuoreita vihanneksia ja hedelmiä, ehkä johtuu niiden C-vitamiinipitoisuus, havaittiin käänteisesti yhteydessä GC riski [2], [3]. Vaikutus luonnon /elintarvikkeiden ainesosien karsinogeenisuutta mahassa on siis tutkittu viime vuosikymmeninä [4] - [6]. Näistä, probioottien ja niiden kyky inhiboida syövän kehittymisen herättänyt tieteellistä mielenkiintoa [7], [8]. Probiootti määritellään yleensä "live mikro-organismi, joka annettuna riittävä määrä, annetaan terveyden kannalta isäntä" [9]. Vaikka jotkut mikro-organismit, kuten H. pylori
voivat suosia GC, toiset voivat olla hyödyllinen vaikutus estämällä ruoansulatuskanavan syöpien. Erityisesti valitaan kantoja probioottisten bakteerien voivat rajoittaa syövän kehittymisen eläinmalleissa syövän [10]. Tämä oli erityisen osoituksena paksusuolen syöpä taas vähemmän tiedetään mahdollisista probioottien GC. Eräs mahdollinen mekaaninen selitys tällainen suojaava vaikutus on in situ
vapautuminen anti-syöpää metaboliitit, kuten lyhytketjuisten rasvahappojen (SCFAs).

lyhytketjuisia rasvahappoja indusoida syöpäsolujen

SCFA, kuten asetaatti, propionaatti ja butyraatti, ovat tärkeitä anionit suolen sisällön ja niiden pitoisuus voi moduloida ruokavalion. Ne osoitettiin keskeisessä asemassa tärkeitä fysiologisia toimintoja kuten modulaation ruoansulatuskanavan epiteelisolujen proliferaatiota /apoptoosin tasapainossa. Tämä edellyttää SCFA välittämiä solun syklin pidätys, histonideasetylaasi- esto ja apoptoosin stimulaation transformoiduissa soluissa, mutta myös stimulaatiota erilaistumisen terveissä soluissa [11], [12]. On myös raportoitu, että SCFAs butyraatti ja propionaatti sekä indusoida apoptoosia ihmisen mahalaukun sinoomasolulinjoja [13] - [15]. Apoptoosi on luonnollinen fysiologinen prosessi mahdollistaa solujen määrä sääntelyä ja muodostaa tavoite syöpälääkkeiden [16]. Apoptosis mahdollistaa ehtyminen syöpäsolujen "puhdas" tavalla. Syöpäsolut hajottamatta koordinoidusti ketjureaktion ja jäännökset imeytyvät viereisten kudosten ja immuunijärjestelmä [17], [18]. Kaksi apoptoottisia reittejä on kuvattu: ulkoista reitti, joka välittää aktivoinnin kuoleman reseptorien ja kaspaasin 8, ja sisäisen reaktiotien, jossa mitokondrioita ja kaspaasi 9 osallistuvat [16]. Yleensä syöpäsolujen apoptoottisen funktion puuttuu, mikä voi selittää niiden jatkuvaa lisääntymistä ja näin ollen kasvainten muodostumisen. Kyky indusoida apoptoosia syöpäsoluissa siten tunnustettu sen terapeuttista potentiaalia [16]. Koska maitotuotteiden propionibakteerien pystyvät tuottamaan hyödyllisiä proapoptoottiseen SCFAs, ne voivat osoittautua käyttökelpoisiksi syövän ehkäisyyn tai hoitoon.

Propionibacterium freudenreichii
voi suosia apoptoottisen ehtyminen ruoansulatuskanavan syöpäsolujen

Tämä probiootti dairy Propionibacterium osoitettiin aiheuttavan solukuolemaa ihmisen erilaisten koolonsyöpäsolulinjaa läpi apoptoosin, yhteistyössä kulttuureissa [19]. Aktiivisia yhdisteitä, eritetään elatusaineeseen, laukaista luontainen mitokondrioiden apoptoottisen reitin viljellyissä ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja. Erityisesti SCFAs asetaatiksi ja propionaatti vapautuu P. freudenreichii
indusoida apoptoosia vaikuttamalla mitokondrioiden adeniini nukleotidin translocator, aiheuttaen mitokondrioita depolarisaation ja permeabilisation, vuoto sytokromi c: n ja kaspaasi-aktivointi [19], [20]. Kuitenkin propionibacterial supernatantit ovat vielä pro-apoptoottisen kuin SCFAs asetaattia ja propionaattia, käytetään pitoisuuksina mitattiin supernatanteista, viittaa siihen, että muut yhdisteet voivat olla mukana tätä vaikutusta. Valitut kannat P. freudenreichii
pysyvät elää ja metabolisesti aktiivisia suolistossa ihmisten ja ihmisen mikrobiston liittyvien rotilla ne tuottavat SCFAs [21], [22]. Näin ollen ne osoitettiin lisäävän apoptoosia transformoiduissa paksusuolen epiteelisoluissa kuten rottia ruokittiin karsinogeeni 1,2-dimetyylihydratsiinia (DMH), mutta ei kontrolli terveistä [23]. Propionihappobakteereiden voisi olla probioottien suosimalla paksusuolensyöpä ennaltaehkäisyyn, mikäli he saavuttavat tavoitteensa elossa ja metabolisesti aktiivisia. Tässä yhteydessä vektori tai probiootti antovehikkeli, osoitettiin määrittämiseksi propionibakteerien selviytymisen ja toimintaa [21], [24], [25]. Complex maitotuotteita, kuten jogurttia ja juustoa, erityisesti suojella propionibakteerien stressistä, mutta sisältävät monimutkainen seos bakteereja. Näin ollen ei ole mahdollista katsoa edullinen vaikutus tiettyyn rasitusta.

fermentoitu maito arvioitiin propionibakteerien toimitus ajoneuvon tässä yhteydessä

Tässä tutkimuksessa käytimme uuden elintarvikelaatua fermentoitua maitoa, joka sisältää vain P. freudenreichii
ainoana mikrobikasvuston. Koska tämä tuote sisältää sekä live propionibakteerien ja niiden aktiiviset metaboliitit se pitäisi tuoda ne kosketukseen mahalaukun limakalvon nieltynä. Tämä piimä tutkittiin suhteessa HGT-1 ihmisen mahalaukun syöpäsoluja apoptoosin. Todellakin, propionibakteerien tiedetään tappaa ihmisen paksusuolen syöpäsoluja, mutta niiden vaikutus mahalaukun syöpäsoluja ei tunneta. Fermentoitu maito tappoi HGT-1-soluja on ajasta ja annoksesta riippuvalla tavalla. Tyypillisiä piirteitä apoptoosin prosessin havaittiin, kuten kannattavuus pudota, kromatiinin tiivistyminen, apoptoottisten elinten muodostumista, DNA: n pilkkoutuminen, ROS tuotanto, mitokondrion kalvon mahdollisia häiriön, kaspaasin aktivaatio, solusyklin pysähtymiseen ja syntyminen subG1 väestöstä.

tulokset

P. freudenreichii
piimä tappaa ihmisen mahalaukun ja paksusuolen syöpäsoluissa

P. freudenreichii
ITG P9 kasvoivat 72 tuntia 30 ° C: ssa täydennetty maito ja täydennetty maito ultrasuodatusta päästä lopulliseen väestöstä 9,43 log _{10 pesäkkeenmuodostusyksiköissä (cfu) /ml ja 9,35 log 10 cfu /ml, vastaavasti. SCFA pitoisuudet olivat 26,21 mM asetaattia ja 54.47 mM propionaatti (2,08 propionaatti /asetaatti suhde) maito käymisteitse supernatantti kun se oli 24,00 mM ja 53,32 mM (2,22 suhde) on fermentoitu maitoon ultrasuodokseksi supernatantti. Nämä suhteet olivat odotettavissa propionibakteerien, jotka yleensä tuottavat kaksi kertaa enemmän propionaattia asetaatti [26]. Kaksitoista muut ruoka-luokan meijeri propionibakteerien kannat testattiin myös (katso taulukko S1 ja kuva S1). Käyttämällä näitä kantoja, kaksitoista piimät saatiin. Propionaatti pitoisuudet vaihtelivat 36-67 mM ja propionibakteerien väestön 9,0-9,7 log 10 pmy /ml, vähemmän ja tehokkaimman rasitusta, vastaavasti.}

sytotoksinen potentiaali supernatanttien valmistettu maidosta tai maitoa ultrasuodokseksi, sekä käymisen P. freudenreichii
ITG P9, tutkittiin. HT-29 ihmisen paksusuolen syövän solujen ja HGT-1 ihmisen mahasyövän soluja käsiteltiin näillä supernatanteista. Eri laimennoksena välillä ½ testattiin. Lisäksi sytotoksisuuden seosta 15 mM asetaattia ja 30 mM propionaatti testattiin pitoisuuksina, lähellä näiden ½ laimennettiin supernatanteista. Positiivisina kontrolleina apoptoosin induktio, kemoterapialääkkeet kamptotekiini (4 uM) ja etoposidi (100 uM) käytettiin HGT-1 ja HT-29-soluja, vastaavasti. Kolme selkeästi erilaista solukuoleman seurannan verrattiin. Kuten kuvassa S2, metyleenisininen, MTT ja trypaanisinieksluusiolla määritykset antoivat samankaltaisia ​​kinetiikka kuoleman. Näin ollen, metyleenisininen määritystä käytettiin tässä tutkimuksessa edelleen arvioida solujen elinkelpoisuus. Ei-käymisteitse maitotuotteet (maito tai maito ultrasuodokseksi) ei ollut vaikutusta, eikä HT-29, eikä myöskään HGT-1 solujen elinkykyä (Fig. 1 A, B). Supernatantti maidon tai maitotuotteiden ultrasuodokseksi käymisen P. freudenreichii
indusoi samanlaisen sytotoksisuuden on ajasta riippuva tavalla HT-29 ja HGT-1-soluissa, ja lähellä sytotoksisuuteen lääkkeellisesti tai asetaatti /propionaatti seoksen. Puolet maksimaalisesta tappamista HGT-1-soluissa tapahtui kuluttua 24 h ja 26 h hoidon kanssa piimä ja piimä ultrasuodatusta supernatanttien vastaavasti kuluttua 17 h hoidon camptothecin ja 24 tunnin kuluttua hoidon SCFA seoksen (Kuva. S3) . Lisäksi sytotoksisuuden fermentoidun meijerituotteen supernatantteja HGT-1-solujen annoksesta riippuvainen (Fig. 1 C). Kunkin laimennus testataan, lasku HGT-1 solujen elävyyden aiheuttama piimä tai piimä ultrasuodokseksi oli hyvin samankaltainen (Fig. 1 C & Fig. S3). Siksi seuraavat vaiheet Tutkimuksen suoritimme vain piimä ultrasuodokseksi supernatantti. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että propionihappobakteerien tehokkaasti tappaa ihmisen paksusuolen ja mahalaukun syövän solut, ainakin osittain kautta tuotannon propionaatti ja asetaatti (Fig. 1). Joitakin muita piimät, käymisen eri meijerituotteiden propionibakteerien kantoja, osoittivat samanlaisia ​​sytotoksisia vaikutuksia syöpäsolujen (taulukko S2). P. freudenreichii
ITG P9 että tunnetaan sen aineenvaihdunta in vivo
[22], vastaava piimä tutkittiin edelleen.

P. freudenreichii
fermentoitua maitoa indusoi tyypillisiä merkkejä apoptoosin ihmisen mahasyövän solujen

Nucleus morfologia HGT-1-soluja inkuboitiin, kun läsnä on P. freudenreichii
piimä ultrasuodokseksi analysoitiin fluoresenssimikroskopialla jälkeen Hoechst 33342 värjäyksen (kuvio. 2A). Ydin- fluoresenssi käsittelemättömien solujen (verrokki) määrä pysyi ennallaan aikana kokeen sininen normaali ytimet (aika 0 h, Fig. 2 aa). Hoidon aikana, HGT-1-solut näytetään lyhennetyn kromatiinin ja hajanaista ytimet ominaisuudet apoptoottisten tumien (Fig. 2AB, c), jota seurasi ulkonäkö apoptoottisten kappaleiden 72 h (Fig. 2AD). Inter-nukleosomaalisia DNA pirstoutuminen seurauksena DNA: n pilkkoutuminen, tyypillinen merkki apoptoosin [27], myös seurataan piimä ultrasuodokseksi hoitoa. DNA: n fragmentoituminen havaittiin 24 h hoidon fermentoitua maitoa ultrasuodoksen (Fig. 2B), ja vähemmässä määrin kamptotekiinin (Fig. S3). DNA: n määrä kvantitoitiin myös virtaussytometrialla jälkeen propidiumjodidileimauksella tutkia vaikutuksia piimä ultrasuodoksen HGT-1 solukierron jakelu (Fig. 2C). Käsittelemättömän HGT-1-soluissa esitetään solusykliä jakelu (Fig. 2Ca) ilman subG1 vaihe, joka pysyi muuttumattomana aikana kokeen (tietoa ei ole esitetty). Prosenttiosuus solujen subG1 vaiheessa, joka on osoitus apoptoottisen prosessin, huomattavasti ajan myötä fermentoidun maidon ultrasuodos hoitoon (Fig. 2C-B, Cc, Cd): 24 h (39,24 ± 4,87%), 48 h (91,63 ± 0,28 %) ja 72 h (94,79 ± 0,45%). 48 h ja 72 h hoidon jälkeen kaikki solut olivat subG1 solusyklin vaihe, joka osoittaa täydellistä kuoleman HGT-1-soluissa. Kontrollina, kamptotesiini indusoi samanlaiset apoptoottiset tunnusmerkkejä in HGT-1-soluissa (kuvio. S4).

Vahvista apoptoosin, phosphatdylserine translokaation sisemmästä ulompaan seloste solukalvon arvioitiin värjäämällä HGT- 1-soluissa yhdistelmä anneksiini V-FITC: tä (AV) ja 7-AAD, jota seurasi virtaussytometria fluoresenssin analyysi (Fig. 3). Käsittelemättömät solut (0 h) esitetään osuus on suuri elävien solujen (AV ^{- /7AAD -; 92%) ja vain 5% solut värjättiin anneksiini V (Fig. 3B). Nämä prosenttiosuudet määritetään käsittelemättömissä soluissa ei muuttunut sinä aikana kokeen (tietoa ei ole esitetty). Hoidon aikana HGT-1-solujen ½ laimennettu piimä ultrasuodokseksi vuonna DMEMc prosenttiosuus värjättyjen solujen vain 7-AAD (osoittaa kuolio) oli hyvin alhainen (Fig. 3B). Kuitenkin prosenttiosuudet solut värjättiin anneksiini V lisääntynyt merkittävästi aikaa riippuvaisella tavalla ja saavutti 80% 72 h (Fig. 3B). Siten HGT-1-soluissa tehtiin apoptoosia käsittelyn jälkeen P. freudenreichii
piimä ultrasuodokseksi, tunnettu ensimmäinen AV positiivista värjäytymistä, mikä osoittaa, fosfatidyyliseriini valotus, ja sitten molemmat AV ja 7-AAD positiivista värjäytymistä, mikä osoittaa myöhemmässä menetystä kalvon eheyden. Kontrollina, kamptotesiini indusoi samanlaiset apoptoottiset tunnusmerkkejä (Fig. S5).}

SCFA toimivat suoraan mitokondrioissa kolme tärkeää mitokondrioiden parametrit määritettiin myös: ΔΨm sisemmän kalvon potentiaalia, ja sukupolvi ROS, käyttäen kahta fluoresoivat koettimet, DiOC (6) 3 (joka on ΔΨm-herkkä) ja DHE (joka havaitsee O _{2 ^{- taso), ja niiden sijaintia sytokromi c. Käsittelemättömät solut (0 h) osoitti korkeaa fluoresenssi (korkea ΔΨm) ja alhainen DHE fluoresenssi (alhainen tuotanto O 2 -) (Fig. 4A, B). Käsittelyn jälkeen fermentoitu maito ultrasuodatusta, ajasta riippuva väheneminen sisällyttäminen DiOC6 (3) fluoresoivasta koettimesta, joka havaittiin, paljastaen menetys ΔΨm ja siten mitokondrion kalvon depolarisaation (Fig. 4A). Prosenttiosuudet käsiteltiin HGT-1-solujen vähentynyt sisäkalvon potentiaali nousi ajasta riippuvalla tavalla saavuttaa 96% soluista 72 tuntia. FCCP hoito käytettiin positiivisena kontrollina Mitokondrioiden kalvon Depolarisaatio. Tämä menetys ΔΨm vahvistettiin ominaisuus menetys punaisen fluoresenssin seuraavat JC-1-värjäys (Fig. 4B). Mitä ROS tuotanto HGT-1-soluissa, piimä ultrasuodokseksi indusoi kerääntymistä O 2 -, merkittävästi 48 tunnin kuluttua ja 72 tunnin hoidon (Fig. 4C). Tämä ROS kertymistä voidaan osittain estää, jos solut on esikäsitelty, että ROS puhdistusainetta TEMPOL (Fig. S6). Sytokromi c vapautumista mitokondrioita solulimassa on keskeinen solun tapauksessa apoptoottisen ohjelman. Immunoblottauksella tutkiminen sytoplasmassa fraktiolla läsnäolo sytokromi c vahvisti muutoksesta solunosasijaintia (Fig. 4D). Sytokromi c havaittiin sytoplasmassa rikastettu fraktio 24 h hoidon, joka osoittaa siirtäminen tämän proteiinin (Fig. 4D). Tämä relocalization sytokromi c sytoplasmassa vahvistettiin Immuunivärjäystä osoittaa diffuusi immunovärjäykseen koko solun käsittelyn jälkeen, kun taas välimerkein värjäytymistä ennen käsittelyä (kuva. 4E).}}

P. freudenreichii
piimä aktivoi caspases

Vahvista apoptoottinen mekanismien aiheuttama piimä ultrasuodokseksi in HGT-1-soluissa, käsittelyä kaspaasien 3, 8 ja 9 analysoitiin western-blottauksella ja vastaavien entsyymiaktiivisuuksien seurannan HGT -1 solu-uutteita (Fig. 5). Ei-piimä ultrasuodatusta ei aiheuttanut kaspaasin aktivaatio in HGT-1 solut: vain proforms kaspaasin 3 ja -9 havaittiin Western blot (kuvio. 5A) eikä kaspaasiaktiivisuus mitattiin (kuvio. 5B). Fermentoitu maito ultrasuodos supernatantti, samoin kuin kamptotesiinin tai seos propionaatti ja asetaatiksi [2: 1] moolisuhteessa, indusoi lohkaisu pro-kaspaasi 3 ja sukupolven aktiivisten muotojen kaspaasi-3-alayksiköt p17 ja p12 (Fig. 5A). Aktivointi kaspaasi-3, joka on efektori kaspaasi, vahvisti apoptoosin. Lisäksi, piimä ultrasuodosta indusoi pilkkominen prokaspaasi-9, joka johtaa 35 ja 37 kDa: n prosessoidut muodot. Kaspaasi 8 ei havaittu kontrolli käsittelemättömän HGT-1-soluja. Kuitenkin hoito propionibacterial supernatanttien tai C2 /C3 seos johti selvään havaitseminen 54 kDa promuotoon, jonka jälkeen sen pilkkominen kuluttua 48 h hoidon.

Kun määritellään, kuinka kaspaasi-3, -8 ja - 9 entsyymiaktiivisuuksia vahvistanut kaspaasin aktivaatio sekä propionibacterial aineenvaihduntatuotteiden ja camptothecin. Todellakin, kaspaaseiksi-9 ja -3 aktivoituivat varhaisessa vaiheessa hoidon, kun taas kaspaasin 8 näytti aktivoidaan myöhemmin (kuvio. 5B). Camptothecin ja SCFA seos aktivoituu kaikissa kolmessa tutkittu caspases. Nämä tiedot vahvistivat aktivointi sisäisen reaktiotien apoptoosin fermentoitua maitoa ultrasuodatusta hoitoa, ja varhainen kaspaasi-9 ja kaspaasi-3 ja -8.

P. freudenreichii
fermentoitua maitoa lisää kamptotesiini sytotoksisuuden

Campthotecin on sytotoksinen kinoliini alkaloidi, joka inhiboi DNA-entsyymin topoisomeraasi I (topo I) ja on laajalti käytetty kemoterapeuttisen hoidon GC. Olemme yllä että propionibacterial aineenvaihduntatuotteiden indusoivat apoptoosin HGT-1-solujen kautta mitokondrioiden kuoleman kautta. Me seuraavaksi tutkitaan apoptoosia indusoitiin molempia kamptotesiinin ja piimä ultrasuodatusta in HGT-1-soluissa. Kohonneet pitoisuudet kamptotesiinin (0, 0,25, 0,5, 1, 2 uM) yhdessä kohonneet pitoisuudet fermentoitua maitoa ultrasuodoksen (0,, ⅛, ¼) testattiin HGT-1 solujen elinkykyä ja molemmat indusoi menetys HGT-1 elinkelpoisuus , annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 6). Lisäksi lisäämällä piimä ultrasuodoksesta parannettu merkittävästi sytotoksisuutta kamptotesiiniä HGT-1-solut (Fig. 6). Esimerkiksi, 0,25 uM kamptotesiini ja piimä ultrasuodatusta laimennettiin pakk johti elinkelpoisuuden menetys 8,6% ja 18,6%, vastaavasti. Näiden kahden yhdisteen johti solujen elinkelpoisuuden menetys 29,8% (Fig. 6), mikä viittaa siihen lisättiin sytotoksisuutta vaikutus, kun kamptotesiinin yhdistettiin piimä ultrasuodatusta in HGT-1-soluissa. Näin ollen, yhdistelmä-indeksi (CI), laskettu aiemmin [28], on arvo 1, mikä osoittaa additiivista vaikutusta kamptotesiinin ja piimä ultrasuodatusta hoitoja.

Keskustelu

Uusi käynyt maitoa, joka sisältää P. freudenreichii
ainoana bakteeri, kehitettiin jotta edelleen tutkia probioottisten mahdollisuuksia tämän maitotuotteiden valmistuksessa propionibakteerien (tarkistetaan [29]). Tässä tutkimuksessa me raportoimme että vesifaasi tämän piimä tappaa ihmisen paksusuolen ja mahalaukun syövän solujen kautta aineenvaihduntatuotteita, kuten propionaatti ja asetaatti, vapauttaa tämän bakteerin. Tämä käsite perustuu havaittuun sytotoksisia vaikutuksia P. freudenreichii
piimä supernatantit viljellyillä HT-29 ja HGT-1 syöpäsoluja. Tämä vaikutus saatiin ultrasentrifugoimalla supernatanteilla, eli fermentoitu maito vesifaasi, vailla kaseiinien ja bakteerit, jotka osoittavat, että aktiiviset yhdisteet erittyvät, kuten aikaisemmin on kuvattu propionihappobakteerien [19]. Tästä syystä useimmat kokeet tässä työssä suoritettiin fermentoitua maitoa ultrasuodoksen (Fig. 1). Osoitimme ensimmäistä kertaa, että P. freudenreichii
piimä supernatantin aiheuttaman apoptoosin HGT-1 solujen ajasta ja annoksesta riippuvaisella tavalla ulkonäkö klassisen morfologiset ja biokemialliset piirteet apoptoosin (tiivistettyä ja hajanainen chromation, DNA-tikapuiden ja kerääntyminen solujen subG1 solusyklin vaihe).

Katsoimme sitten jos solun mekanismeja HGT-1 solukuolemareittiin olivat samanlaisia ​​mitokondrion kuoleman reitin laukaista Caco-2- ja HT-29 ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa P. freudenreichii
DMEMc viljelmäsupernatanteista [19], [20]. Sub-solu- ja biokemiallisten tapahtumien havaittiin käsitellyn HGT-1-solujen piimä ultrasuodatusta olivat samankaltaisia ​​ja sisälsivät ainakin mitokondrioiden ΔΨm menetys, ROS (O _{2 ^{-) sukupolvi, kaspaaseiksi käsittely ja aktivointi, sytokromi c siirtäminen sytoplasmaan (Fig. 3, 4, 5). Käynyt maito supernatantti aiheuttama käsittely ja kaspaasi-8, lisäksi caspases -3 ja -9. Lisäksi kuvio 4A osoittaa, että kaspaasi-8 ei havaittu kontrolli käsittelemättömät solut ja käsitellyissä soluissa kamptotesiini tai ei-piimä ultrasuodatusta mukaisesti puute sen mRNA (C. Le Jossic-Corcos, Faculty of Medicine, Brest , Ranska, henkilökohtainen tiedonanto). On huomattava, että näennäinen ristiriita välillä entsymaattisen tuloksia, mikä viittaa siihen, kaspaasi-8 aktiivisuuden kamptotekiini-käsitellyissä soluissa, kun taas mitään kaspaasi 8 havaitaan näissä soluissa Western-blottauksella. Tämä voidaan selittää sillä, spesifisyyden puutteesta ja Ac-IETD-AMC substraatti, jota voidaan käsitellä muilla entsyymeillä, kuten kaspaasien -3 ja -10 tai grantsyymi B, varsinkin, jos pitoisuus näiden entsyymien kohonnut [30], [31]. Sen sijaan P. freudenreichii
piimä ultrasuodatusta ja seos SCFA sekä aiheutti ilmaisun ja kaspaasi-8. Mekanismeja täällä ei tunneta; kuitenkin, kaspaasi-8: n tiedetään olevan alle ilmaistuna joidenkin syöpäsolujen seurauksena DNA: n metylaatio [32], [33]. Sen ilmentymistä voidaan palauttaa RNA-ja proteiinin tason demetyloimalla, kuten decitabine [34] ja HDAC-inhibiittorit [35], mikä demetylaation säätelysekvenssi kaspaasin 8, kasvu kaspaasi-8-promoottorin aktiivisuus ja re -ilmaisu kaspaasi-8 [32]. SCFA, kuten propionaatti, ovat HDAC-inhibiittoreita, mikä johtaa hyperasetylaation histonien [36]. Tämä suosii transkriptio kautta muutosta DNA konformaatiossa [37] ja voisi palauttaa kaspaasin 8 ilme. Muut ruoka-syntyneiden yhdisteiden jo osoittanut palauttamiseksi kaspaasin 8 ilme. Injektoitavan uute Semen coicis
(suhteellinen maissin) ote näytetään antituumorivaikutuksen parantaa ilmentymistä kaspaasin 8 ja indusoi apoptoosia HepG2-soluissa [38]. Diallyyli disulfidi, löytyy valkosipuli, parantaa ilmentymistä kaspaasin 8, Fas ja FasL leukemian K562-soluissa. Tällainen sääntely voi siis olla mukana proapoptoottisten vaikutuksia maitotuotteiden propionibakteerien ja käymisestä niitä sisältävien tuotteiden. Western blotting osoittaa palautettu ilmentymisen ja sitten myöhään kaspaasi-8 propionibacterial metaboliittien saaneilla HGT-1-solut, joita voi esiintyä seurauksena kaspaasin 8 aktivaation toiseen kaspaasi, kuten kaspaasi-9. Todellakin, poistumista sytokromi c, osa mitokondrioiden koulutusjakson, osoitettiin aktivoida useita caspases kuten 2, 3, 6, 7, 8 ja 10 [39]. Lisäksi kaspaasi-9 aktivointi osoitettiin tulos alavirtaan kaspaasin 8 aktivaation [40]. Siten kaspaasi-9 osoitettiin in vitro
aktivoimaan kaspaasi-3 joka kääntyy aktivoi kaspaasi-6, joka vastaa kaspaasin 8 aktivaation [41]. Kaikkiaan meidän tulokset vahvistavat, että propionibacterial aineenvaihduntatuotteet läsnä P. freudenreichii
piimä aiheuttaa useita solukomponenttien mekanismit suosivat apoptoosin. Tällainen aktivoituminen kaspaasin 8 ilmaisu voi johtaa suuren apoptoottisen vasteen HGT-1-solut käsiteltiin kuolleiden domain reseptorien agonistit (esim Trail tai Fas).}}

Tietääksemme tämä on ensimmäinen työ raportoinnin erityisiä induktio mahalaukun syöpäsolun apoptoosin fermentoidun meijerituotteen. Fermentoitu maidot, mukaan lukien jogurtti, ehdotettiin olevan käyttökelpoisia ehkäistäessä ja paksusuolen syöpä. Epidemiologista tietoa suojaavia vaikutuksia maidon ja maitotuotteiden paksusuolensyöpä nopeudella saatiin ristiriitaisia ​​tuloksia [42]. Maito ja koko maitotuotteet kulutus liittyy vähenemiseen peräsuolen syövän riskiä. Mutta tämä ei ole totta kaikenlaisia ​​maitotuotteet ja vaikutukset vaihtelevat suuresti. Käynyt maitotuotteet voivat olla tehokkaita pakettiautoa kohdistaa suojaava molekyylien tai mikro tiettyihin kohteisiin, kuten ruoansulatuskanavan epiteeli [43]. Nauta laktoferriinin, ainesosana maito, indusoi apoptoosia paksusuolen [44] ja mahalaukun [45] syöpäsoluja. Valitut mikro-organismeja läsnä piimät voi myös ehkäistä paksusuolen syövän synnyn. Näin ollen, jogurtti ja maitohappobakteereja esillä syövän ominaisuuksia eläinmalleissa paksusuolen karsinogeneesin [46]. Kuitenkin vähän keskittyi käymisteitse maitotuotteet ja mahasyövän. Työmme osoittaa, että P. freudenreichii
voisi olla merkitystä tässä yhteydessä, koska se tuottaa sekä live propionibakteerien ja proapoptoottisiin Metaboliittien mahalaukun limakalvon. Tässä yhteydessä tulee huomata, että P. freudenreichii
tarttuu ruoansulatuskanavan epiteelisoluihin ja limaan [47], [48]. Se oli myös osoitettu estävän tarttumista aiheuttava aine mahasyövän Helicobacter pylori
ruoansulatuskanavan epiteelisoluihin, sekä H. pylori
indusoimaan vahingoista [49]. Nämä ominaisuudet viittaavat rooliin P. freudenreichii
piimä ennaltaehkäisyyn mahasyövän.

Lopuksi, meidän piimä potentialized pro-apoptoottisen toiminnan lääkkeen kamptotesiinin mahalaukun syövän soluissa. Näin ollen, elävä viljelmiä probioottisten maitohappobakteerien oli aiemmin osoitettu herkistää LS513 peräsuolen syövän soluja 5-fluorouracyl [50]. Kuitenkin tässä tapauksessa probiootit yksinään ei ollut proapoptoottiset vaikutusta. Tässä työssä pieniä annoksia lääkettä camptothecin käytetään mahalaukun syövän kemoterapiassa olivat tehottomia tappamisessa mahalaukun syöpäsoluja. Kuitenkin, kun läsnä on pieniä annoksia P. freudenreichii
piimä, he tappoivat samat solut tehokkaasti (Fig. 6). Propionibacterial aineenvaihduntatuotteet aiheuttaa luontaisen apoptoosireitin vaikuttamalla suoraan mitokondrioita, kun taas camptothecin toimii DNA-tasolla. Tämä on sopusoinnussa niiden kumulatiivinen potentiaalia apoptoosin induktioon, kun nämä proapoptoottisten induktorien yhdistetään. Lisäksi, fermentoitu maito sisältää SFCAs, tunnettu HDAC-inhibiittorit kykenevät moduloimaan apoptoosia ja solusyklin mahasyövän soluihin [13], [51] sekä ilmentymisen solusyklin liittyvien ja apoptoottisten proteiinien muissa syöpäsoluissa [52], [53]. Probiootit jo käytetty kliinisissä tutkimuksissa vähentää sivuvaikutuksia syövän kemoterapiaa [54]. P. freudenreichii
voi, mukaan tuloksemme, käytettävä niin kliinisissä tutkimuksissa. Sen synergistinen vaikutus voi auttaa alentamaan lääkkeen annosta ja parantaa mukavuutta potilaiden.

Yhteenvetona uusi maitoa, yksinomaan käymisen P. freudenreichii
, indusoi apoptoosin HGT-1 ihmisen mahalaukun syöpäsoluja. Lisäksi tämä piimä tehosti kamptotesiini sytotoksisuuden aktiivisuutta, lääkkeen käytetään mahalaukun syövän kemoterapiassa. Tällaiset uudet probiootti piimä saattaa kiinnostaa toiminnallisena ruoka estää mahalaukun syövän ja /tai potentialize terapeuttisia hoitoja.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit

Kampotekiinillä, etoposidi , TEMPOL, asetaatti ja pro- pionaatti natriumsuolat, ja kaspaasi substraatteja Ac-DEVD-AMC (N-asetyyli-Asp-Glu-Val-Asp-7-amido-4-metyylikumariinia), Ac-IETD-AMC (N-asetyyli-Ile Glu-Thr-Asp-7-amido-4-metyylikumariini) ja Ac-LEHD-AFC (N-asetyyli-Leu-Glu-His-Asp-7-amido-4-trifluorimetyylikumariinia) ostettiin Sigma-Aldrich (Saint -Quentin Fallavier, Ranska). Kamptotesiini liuotettiin DMSO: hon. Lopullinen DMSO-pitoisuus ei ylittänyt 0,01%, eli pitoisuus, joka ei aiheuttanut myrkyllisyys. RNAasi A, PI (propidiumjodidin), Hoechst H33342, MitoTracker® Red CMXRos, TO-PRO-3, JC-1, 3,3'-dihexyloxacarbocyanine jodidia (DiOC6 (3)) ja dihydroethidium (DHE) saatiin Invitrogen ( Cergy-Pontoise, Ranska). Anneksiini V-FITC (AV) pakkaus ja 7-aminoactinomycin-D (7-AAD) ratkaisu toimitti BD Biosciences (Pont-de-Claix, Ranska).

• PLoS ONE: E-kadheriinin destabilisaatio tilinpidon patogeenisyyden missensemutaatioita perinnöllistä Diffuusi Mahalaukun Cancer
• PLoS ONE: tunnistaminen Seerumin MikroRNA kuin Novel ei-invasiivisia biomarkkereita Early Detection of Mahalaukun Cancer