PLoS ONE: tunnistaminen Seerumin MikroRNA kuin Novel ei-invasiivisia biomarkkereita Early Detection of Mahalaukun Cancer

tiivistelmä

Background

tutkia mahdollisuuksia seerumin miRNA biomarkkereina varhaiseen diagnosointiin mahalaukun syöpä (GC), väestöpohjaisen tutkimus suoritettiin Linqu, korkean riskin ala GC Kiinassa.

Menetelmät /Principal havainnot

Kaikki koehenkilöt valittiin kahdesta suuresta kohorttitutkimusten . Differential miRNA havaittiin seerumissa altaat GC ja valvonnan avulla TaqMan alhaisen tiheyden array, ja validoitu yksilön 82 paria GC ja valvontaa, ja 46 paria dysplasia ja valvonnan reaaliaikaisella kvantitatiivisella käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio. Ajallinen suuntaukset tunnistettu seerumin miRNA ilme oli vielä syvennettävä retrospektiivinen tutkimus 58 GC potilasta, joilla oli ainakin yksi ennalta GC diagnoosi seeruminäyte perustuu pitkän aikavälin seurannassa väestöstä. Mirna profilointi Tulokset osoittivat, että 16 miRNA olivat selvästi yläreguloituja GC potilailla verrokkeihin verrattuna. Lisävalidointia tunnistettu paneeli kolmen seerumin miRNA (miR-221, miR-744, ja miR-376c) mahdollisina biomarkkereita GC havaitsemiseen, ja vastaanotin toimivat (ROC) käyrä-pohjainen riskinarviointi analyysi osoitti, että tämä paneeli voisi erottaa GC kontrollien kanssa 82,4% herkkyys ja 58,8% tarkkuus. MiR-221 ja miR-376c oli merkittävästi positiivinen korrelaatio on huono erilaistumisen GC, ja miR-221 näkyy korkeammalla tasolla dysplasia kuin verrokeilla. Lisäksi retrospektiivinen tutkimus paljasti kasvussa näiden kolmen miRNA tasoa aikana GC kehitys ( P
muutossuunnat < 0,05), ja tämä paneeli voisi luokitella seeruminäytteet kerättiin jopa 5 vuotta edellä kliinisen GC diagnoosi 79,3 % kokonaistarkkuus.

Johtopäätökset /merkitys

Nämä tiedot viittaavat siihen, että seerumin miR-221, miR-376c ja miR-744 on vahva potentiaali uusina ei-invasiivisia biomarkkereita varhaista havaitsemista GC.

Citation: Song My, Pan Kf Su Hj, Zhang L, Ma Jl, Li Jy, et al. (2012) tunnistaminen Seerumin MikroRNA kuin Novel ei-invasiivisia biomarkkereita Early Detection mahasyövän. PLoS ONE 7 (3): e33608. doi: 10,1371 /journal.pone.0033608

Editor: Joseph Califano, John Hopkins Medical School, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 marraskuu 2011; Hyväksytty: 13 helmikuu 2012; Julkaistu: 14 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Song et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Basic Research Program of China (973 Program: 2010CB529303), A3 ennakoinnin Program Natural Science Foundation of China (30921140311) ja National Natural Science Foundation of China (81041012 ja 81171989). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpää (GC) on toiseksi suurin syy syövän kuoleman maailmassa, jossa lähes puolet esiintyi Kiinassa [1], [2]. Ennuste GC vaihtelee huomattavasti jonka vaihe syövän kanssa 5 vuoden suhteellinen pysyvyys saavuttaa 90% vaiheessa I, mutta alle 5% kolmannessa vaiheessa IV [3]. Siten varhainen havaitseminen GC on keskeinen keino vähentää kuolleisuutta ja parantaa ennustetta GC.

Vaikka gastroskopisten seulonta GC on erittäin luotettava, se on invasiivinen ja kallis, erityisesti kehitysmaissa. Siksi paljon on pyritty kehittämään vähemmän kalliita alustavat seulontatestejä helppopääsyisissä yksilöitä. Kuitenkin monet aiemmin tutkittu analyytit, kuten pepsinogeeni (PG) I /II suhde karsinoembryonaaliselle antigeeni (CEA) ja hiilihydraattiantigeeniä 19-9 (CA 19-9), eivät olleet herkkiä ja riittävän täsmällisesti GC seulomiseksi [3], [ ,,,0],4]. Niinpä on olemassa kiireellinen tarve uusille non-invasiivisen biomarkkereiden parantaa varhaisen havaitsemisen GC.

MikroRNA (miRNA) ovat runsas luokka pienet ei-koodaavat RNA: t, jotka negatiivisesti säädellä geeniekspressiota -emäspariutumisen 3'-transloimaton alue ja kohde-mRNA: iden, jolloin joko mRNA: n pilkkominen tai translaation repression [5], [6]. Lisääntyvä näyttö on osoittanut, että miRNA ovat mukana erilaisissa biologisissa prosesseissa, kuten kehitys-, solujen erilaistuminen, proliferaatio ja apoptoosi [7], ja osallistuvat ihmisen syövän synnyn kuten onkogeenien tai tuumorisuppressoreilla [8]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA mentymisprofiili vaihtelee kasvaintyyppeihin ja voivat erilaistua syöpää ja normaaleissa kudoksissa [9], [10]. Viime aikoina kiertävä miRNA on ehdotettu suuri potentiaali biomarkkereita moniin syöpiin, kuten GC [11] - [16]. Kuitenkin arvo kiertävän miRNA varhaiseen havaitsemiseen GC ei ole raportoitu vielä.

Vuodesta 1989 olemme suorittaneet useita tutkimuksia Linqu County, korkean riskin ala GC Shandongin maakunnassa Kiinassa , mukaan lukien väestöpohjaisen kohorttitutkimuksen prekanseroosisten mahavaurioita [17], [18], ja satunnaistetussa tutkimuksessa estää etenemistä mahavaurioita [19]. Tämä ryhmä antaa meille mahdollisuuden tutkia dynaamisia muutoksia verenkierrossa miRNA tasojen aikana GC kehittämistä ja tarjoaa meille ainutlaatuisen mahdollisuuden tutkia mahdollisuuksia kiertävän miRNA varhaiseen havaitsemiseen GC.

Tässä me raportoimme tuloksista ero miRNA seerumissa GC ja dysplasia (DYS), ja retrospektiivinen tutkimus on suunniteltu arvioimaan dynaamisia muutoksia aikana GC kehitystä.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkimusasetelma ja väestön

yksityiskohdat tutkimuksen väestön menettelyjä tähystys, kriteerit mahalaukun histopatologia ja seuranta on kuvattu muualla [17] - [19]. Lyhyesti, tähystyksen seulonta tutkimus aloitettiin vuonna 1989 keskuudessa 3399 asukkaiden vuotiaista 35-64 vuotta vuonna Linqu County, korkean riskin alueen GC, ja joilla ei ollut GC diagnoosia myöhemmin jatkona toistuva tähystystutki- suoritettiin vuonna 1994 [17 ], [18]. Vuonna 1995, satunnaistetussa, lumekontrolloidussa interventio tutkimus aloitettiin tässä potilasryhmässä vuoteen 2003 asti, jolloin toistuva tähystystutki- suoritettiin [19]. Kaikki koehenkilöt kävivät veren piirtää sekä perustason ja loppupiste tutkimukset jokaisen tutkimuksen, ja jotkut kehittyneitä mahavaurioita, kuten suoliston metaplasiaa (IM) tai DYS, myös veren ja sai tähystystutki- vuonna 1992 ja 1999.

nykyisessä tutkimuksessa, monivaiheinen, sisäkkäisiä tapauskontrollitutkimuksessa kahdesta suuret ikäluokat suunniteltiin tunnistamaan ja validoida ero seerumin miRNA GC ja DYS, ja retrospektiivinen tutkimus tehtiin tutkimaan mahdollisuuksia ehdokas seerumin miRNA varhaiseen havaitsemiseen GC (kuvio 1).

tutkimus jakaantui neljään portaittain vaiheisiin. Vaiheessa I, seerumi altaat 14 GC potilaista ja 14 iän ja sukupuolen verrokit kanssa diagnoosi pinnallinen gastriitti (SG) tai lievä krooninen atrofinen gastriitti (CAG) käytettiin tuottamaan miRNA profiileja erilaisia ​​analyysi. Differential miRNA tunnistettiin, ja erittäin voimistunut miRNA tai kohtalaisen voimistunut miRNA jossa on funktionaalisia tai biomarkkereiden liittyviä raportteja valittiin lisäanalyysiä. Vaiheessa II, jonka tunnuksena miRNA validoitiin käyttäen kvantitatiivista käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) yksittäisistä seeruminäytteistä 14 GC ja hallintalaitteet, joita käytettiin taulukon testin I vaiheessa Faasi III merkittävästi muuttunut miRNA sittemmin validoitu 68 GC ja 46 DYS potilaille sekä heidän ikä- ja sukupuoli-verrokkiin. Vastaanotin toimii (ROC) käyrä-pohjainen riskinarviointi Sitten toteutettiin analyysi joukossa 68 GC-ohjaus paria arvioimiseksi erotteleva vaikutus seerumin miRNA GC. Kukin kohde on valittu kumpaankaan korkean tai matalan riskin ryhmissä vertaamalla ekspressiotasot miRNA biomarkkereiden vastaavaan raja-arvot on johdettu ROC käyrä. Vaiheessa IV, retrospektiivinen tutkimus suoritettiin 58 GC potilailla, joilla tarjotaan ainakin yksi oikeutettu valmiiksi diagnoosi seeruminäytettä pitkällä aikavälillä seurantatutkimus edellä kuvatulla tavalla, tutkia ajallinen kehitys mahdollisten miRNA biomarkkereiden ja määrittää niiden arvo alussa GC havaitsemiseen. Koko tutkimus hyväksyi Institutional Review Board of Peking University Cancer Hospital & Institute, ja kaikki potilaat antoivat tietoon perustuva suostumus.

Näytteen käsittely ja RNA

Enintään 5 ml kokoverta kustakin paaston osallistuja kerättiin tapausten ja kontrollien tehty samana vuonna. Verinäytteet annettiin seistä 30-40 minuuttia ja seerumin erotus saatiin aikaan sentrifugoimalla 965 g 15 min. Supernatantti seerumi otettiin talteen ja säilytettiin -80 ° C: ssa analyysiin asti. RNA eristettiin 100 ui seerumia käyttäen miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Saksa) valmistajan menettelyohjeen mukaisesti pienin muutoksin [20]. Sillä miRNA profilointi, kaksi allasta luotiin yhdistämällä seoksia ylemmän vesifaasin jälkeen faasin erottamisen ja etanolin 14 GC potilaista (12 uros, 2 naaras, ikä, 62 (SD 6,4) vuotta) ja 14, sukupuolen ja iän verrokeilla (ikä, 61 (SD 5,9) vuotta), tässä järjestyksessä. Sitoutumisen jälkeen kalvo RNeasy Mini sentrifugointi- pylväästä ja sen jälkeen pesemällä, RNA eluoitiin 40 ui RNaasi-vapaata vettä. Kaikkien qRT-PCR kokeissa RNA: sta 100 ui seerumia eluoitiin 100 ui RNaasi-vapaata vettä. Normalisoida näytteen ja näytteen vaihtelu RNA: n eristämistä vaiheessa, synteettinen ATH-miR-159 lisättiin kuhunkin seeruminäytteessä varten miRNA profiloinnin taas cel-miR-39 lisättiin qRT-PCR-analyysiä, kuten on kuvannut Mitchell et al
[11].

Mirna profilointi

Mirna profilointia suoritettiin käyttäen TaqMan alhaisen tiheyden array A (v2.0) mukaan valmistajan suositteleman protokollan (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Tämä qRT-PCR profilointi alustan koostuu yhdestä 384-kuoppaisen -mikronestekorttia jossa 377 miRNA voidaan analysoida yhdessä kolmen endogeenisten valvontaa (U6, RNU44 ja RNU48) ja yksi negatiivinen kontrolli liity ihmisen (ATH-miR-159). Lyhyesti, RNA yhdistettiin erikseen 14 GC potilaiden ja verrokkia edellä kuvatulla käänteiskopioitiin käyttäen TaqMan miRNA käänteistranskriptio kit ja TaqMan miRNA multiplex RT määritykset (ihmisen pool; Applied Biosystems). Kunkin RNA-allas, 3 ui kokonais-RNA: ta lisättiin kuhunkin multiplex käänteisen transkription reaktioita.

lisätä määrää cDNA saatavilla analyysiä varten, rikastamista kohdegeenien suoritettiin esivahvistus vaiheessa. 25 ul reaktioseosta sisälsi 2,5 ui laimentamatonta cDNA yhdistettiin 12,5 ui TaqMan Esivahvistustaso Master Mix (2 x), 2,5 ui Megaplex Esivahvistustaso Alukkeet (10 x), ja 7,5 ui nukleaasitonta vettä. Esivahvistus vaihe suoritettiin GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) seuraten valmistajan protokollaa.

reaaliaikainen PCR-analyysi, tuote laimennettiin lisäämällä 75 ui nukleaasitonta vettä ja 9 ui laimennettua jälkeen seos yhdistettiin 450 ul: TaqMan 2 x Universal PCR Master Mix ilman urasiilia-N-glykosylaasi ja 441 ui nukleaasitonta vettä. Lataamisen jälkeen 100 ui kutakin multiplex allas seos, array sentrifugoitiin ja sinetöity. Monistus suoritettiin Applied Biosystems 7900 HT-lämpösyklilaitteessa (Applied Biosystems) käyttäen valmistajan suosittelemaa sykliolosuhteita. Aineisto analysoitiin RQ Manager ohjelmiston versio 1.2 ja DataAssist ™ ohjelmiston versio 2.0 (Applied Biosystems). Normalisoinnin jälkeen käyttäen Piikitin-in ATH-miR-159, taitos muutos miRNA tasojen GC kontrolliin verrattuna laskettiin menetelmällä.

Mirna kvantifiointiin reaaliaikaisella qRT-PCR

Käänteiskopiointi suoritettiin käyttäen TaqMan-miRNA käänteistranskriptio kit ja miRNA-specific varsi-silmukka-alukkeita (Applied Biosystems). 7,5-il reaktioseosta sisälsi 0,75 ui 10 x Reverse-transkription puskuria, 0,095 ui RNaasi-inhibiittoria (20 yksikköä /ul), 0,075 ui 100 mM dNTP: itä dTTP, 0,5 ui MultiScribe käänteiskopioijaentsyymin (50 yksikköä /ul), 1,5 ui aluketta, 2,5 ui RNA: ta, ja 2,08 ui RNaasi-vapaaseen veteen. Käänteinen transkriptio suoritettiin t ammattilainen PCR System (Biometra, Saksa) seuraten valmistajan protokollaa.

Reaaliaikainen PCR suoritettiin kahtena ja mukana no-mallia negatiiviset kontrollit. On 20-pl reaktiossa cDNA: n (3 ui) yhdistettiin 10 ui TaqMan 2 x Universal PCR Master Mix ilman urasiilia-N-glykosylaasia, 1 ui TaqMan miRNA määrityksessä sekoitus, ja 6 ul: aan vettä. Monistaminen suoritettiin 7500 Real-Time PCR -järjestelmää (Applied Biosystems) seuraten valmistajan protokollaa. Ilmaisu tasot miRNA normalisoitiin piikki-in cel-miR-39, ja laskettiin käyttäen menetelmää.

Tilastollinen

pariksi t
testi käytetään tutkia ero keskimääräisessä iässä ryhmien välillä. Wilcoxonin testiä tai Mann-Whitneyn U-testiä käytettiin vertaamaan seerumin miRNA tasot eri ryhmien tarvittaessa. ROC käyrät perustettiin arvioimaan diagnostisia vaikutuksia miRNA, ja yleistetty lineaarinen malli, jossa toistetaan toimenpiteet käytettiin analysoida ajallisia suuntauksia seerumin miRNA tasojen aikana GC kehityksen jälkeen logaritminen muutos. Kaikki P
arvot olivat kaksipuolisia ja vähemmän kuin 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttämällä Statistical Package for Social Sciences (SPSS 13.0, Chicago, IL).

Tulokset

Aihe ominaisuudet

Yhteensä 82 GC potilaita, 46 potilaalla on DYS, ja 128 säätimet SG tai lievä CAG olivat mukana tässä tutkimuksessa. Kuten taulukosta 1, ei ollut merkittävää eroa iät potilaiden välillä GC tai DYS ja niiden vastaavat ohjaimet ( P
= 0,329 ja 0,214, tässä järjestyksessä).

Mirna profilointi

ilmentyvät eri miRNA havaittiin seerumissa altaat 14 GC ja 14 käyttäviin TaqMan alhaisen tiheyden array. Niistä 377 miRNA analysoitu, 99 osoitti > 2-kertainen voimistunut ja 40 osoittivat < 0,5-kertainen vaimentua muutoksia GC seerumin allas (taulukko S1). Kuusitoista voimistunut miRNA (miR-221, miR-744, miR-376c, miR-191, miR-27a, let-7e, miR-27b, miR-222, miR-21, miR-18a, miR-19a, asennuspalveli- 17, miR-106b, miR-106a, miR-20a, ja miR-155), jotka osoittavat merkittäviä ilmaisun muutoksia GC seerumin ja jossa on funktionaalisia tai differentiaalikaavojen raportteja GC kudoksessa valittiin ehdokkaista nyrkki-vaiheen validointi [21] - [28].

Ensiasteen validointi

ilmauksia 16 ehdokkaan miRNA mitattiin yksittäiset seeruminäytteet 14 GC ja tarkastuksia käytettiin array testissä. Johdonmukaisesti profilointitulosten, kaikki 16 miRNA osoitti korkeampia seerumin GC-ryhmässä kuin kontrolliryhmässä (kuva S1). Heistä 9 seerumin miRNA (miR-221, miR-744, miR-376c, miR-191, miR-27a, let-7e, miR-27b, miR-222, ja miR-21) oli > 2 keskiarvo kertainen muutos GC ryhmässä vertailuryhmän ryhmään ( P
< 0,05), ja näin ollen valittiin lisävalidointia.

Toisen vaiheen validointi

Tutkimme 9 miRNA ilmaisuja suuri joukko seerumia 68 paria GC ja valvontaa. Kuten on esitetty kuviossa 2, 8 ulos 9 miRNA (miR-221, miR-744, miR-376c, miR-191, miR-27a, anna-7e, miR-27b, ja miR-222) osoittivat merkitsevästi kohonneet GC, jolla on yli 2-kertainen muutos ( P
< 0,05), ja nämä miRNA valittiin seuraavat analyysit.

riskinarviointi GC tapauksista käyttäen paneelia miRNA

arvioimiseksi erotteleva vaikutus seerumin miRNA GC, ROC käyrät laadittiin kullekin 8 miRNA käyttäen 68 paria GC ja valvonnan toisen vaiheen validointi (kuva 3). Tulokset paljastivat, että miR-744, miR-376c, miR-221 ja anna-7e tuotti suurin alueilla ROC käyrät (AUC) ja saattaa olla mahdollisuus biomarkkereina GC havaitsemiseen.

Riskinarviointi perustuu neljään miRNA käytettiin erottamaan seeruminäytteistä GC tapausten valvontaa. Kunkin miRNA, me ensin lasketaan optimaalinen raja-arvo suhteellisen ekspressiotason (miR-744: 5.49 × 10 ^{-4; miR-376c: 6,05 × 10 -4; miR-221: 1,47 × 10 -3, anna-7e: 1,61 × 10 -3), jossa Youdenin indeksi (herkkyys + spesifisyys-1) GC diagnoosi oli suurimmillaan ROC käyrä. Sitten jaoimme kohde lisätään riskiryhmään, joka edustaa mahdollista GC tapauksessa, kun seerumin tahansa neljästä miRNA oli yhtä suuri tai suurempi kuin vastaava raja-arvo, ja matalan riskin ryhmään, joka edustaa ohjaus kun seerumin kaikki neljä miRNA olivat alle raja-arvojen.}

tämän arviointikriteeri, 56 säilyttäjät ja 32 kontrollit ennusti oikein GC ja ei-GC tapauksissa tuottaa herkkyys 82,4% ja spesifisyys 47,1%. Koska let-7e osoittivat pienimmän arvon ja laajin luottamusväli AUC yksi neljästä miRNA että ROC käyräanalyysi (kuva 3), me toisti edellä riskinarvioinnin jälkeen ilman let-7e ja saatu suurempi spesifisyys (40/68, 58,8 %), kun taas herkkyys pysyi muuttumattomana, mikä osoittaa, että osuus anna-7e erottaa GC kontrolleista oli vähäpätöinen, ja kolmen miRNA paneeli (miR-221, miR-376c ja miR-744) oli tehokkaampi yhdistelmä biomarkkerit GC diagnoosi.

edelleen tutkia mahdollisuuksia tämän paneelin varhaisia ​​GC, arvioimme alaryhmä 30 GC potilaiden varhaisessa vaiheessa, ja 22 oli oikein ennustaa GC tapauksissa herkkyyttä 73,3% .

Association between seerumin miRNA ilmaisun ja erilaistumista laadut GC

Lisäksi pyrimme tutkimaan korrelaatio ekspressiotasot miR-221, miR-744 ja miR-376c, ja erilaistumista laadut GC. Kuten kuvassa 4A-C, kaikki kolme miRNA osoittivat korkeampia seerumin huonosti eriytetty GC ryhmä (43 GC lukien 29 mies- ja 14 naaras, ikä, 60 (SD 8,3) vuotta) kuin hyvin tai kohtalaisesti eriytetty GC ryhmä (24 GC joista 19 urosta ja 5 naarasta, ikä, 60 (SD 6,2) vuotta). Niistä seerumin miR-221 ja miR-376c oli merkittävästi positiivinen korrelaatio on huono erilaistumiseen GC ( P
= 0,006 ja 0,004, tässä järjestyksessä).

Expression seerumin miRNA biomarkkereita koehenkilöillä jossa DYS

selventämään lisäksi merkitystä näiden kolmen miRNA kanssa syöpää edeltäviin mahalaukun vaurio, tarkastelimme niiden ilmaisut 46 paria DYS ja valvontaa. Kuten kuviossa 4D-F, joka on merkittävästi kohonnut taso miR-221 löytyi DYS ryhmässä verrattuna kontrolleihin ( P
= 0,027), kun taas mitään merkittävää eroa ei löytynyt miR-376c tai asennuspalveli- 744. Lisäksi riskinarviointi analyysin seuraavan aiemmin vakiintuneet menettelyt paljasti, että tämä kolmen miRNA paneeli voisi erottaa DYS kontrollista kanssa herkkyys 56,5% ja spesifisyys 47,8%.

Dynaaminen muutoksia seerumin miRNA biomarkkereiden kaasukromatografisessa kehitys

retrospektiivinen tutkimus, dynaamisia muutoksia kolmen seerumin miRNA biomarkkerit havaittiin 58 GC potilailla, jotka jaettiin neljään ryhmään sen mukaan aikaväli verestä vedon GC diagnoosi: pre-diagnoosi 2-5 vuoden , 6-9 vuotta, 10-14 vuotta ja ≥15 vuotta ryhmissä (taulukko 2). Jotkin kohteet voivat samanaikaisesti esiintyä kaksi tai enemmän kuin kaksi ryhmää, koska ne tarjosivat seeruminäytteiden useina ajankohtina, että seuranta-ajan.

Kuten kuviossa 5A, kaikki kolme seerumin miRNA näytetä merkittävästi lisäämällä ilmaisun aikana GC kehitys, paitsi pientä nousua seerumin miR-744 pre-diagnoosi ≥15 vuotta ryhmä. Lisäksi suuntaus testi osoitti tilastollisesti merkitsevä lineaarinen trendi kolmella miRNA tasot 20 GC potilailla, jotka osallistuivat kolme seeruminäytteitä eri ajankohtina aikana seuranta-ajan (kuvio 5B).

Lopuksi arvioidaan mahdolliset miRNA biomarkkereita varhaiseen ennustamiseen GC 29 potilaalla, jotka olivat antaneet seeruminäytteitä 2-5 vuotta ennen GC diagnoosia. Riskin mukaisesti arviointikriteeri perustettu ennen, 23 29 GC potilaalla (79,3%) oli luokiteltu oikein edustettu GC tapauksissa tämä kolmen seerumin miRNA paneeli.

Keskustelu

Tavoitteena tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa ero miRNA seerumissa GC ja DYS, ja tutkia mahdollisuuksia seerumin miRNA biomarkkerina varhaisen havaitsemisen GC. Löysimme merkittävästi kohonnut seerumin miR-221, miR-376c ja miR-744 GC potilailla systemaattisella microarray-pohjainen seulonta ja kaksivaiheinen validointi. Tämä kolmen seerumi miRNA paneeli voisi erottaa GC kontrollien ja suuntaus oli kasvava aikana GC kehitystä. Parhaan tietomme mukaan tämä on ensimmäinen väestöpohjainen tutkimus tutkia dynaamisia muutoksia seerumin miRNA liittyy GC ja sen esiasteita korkean riskin alue GC.

ilmaantuvuus GC vaihtelee suuresti kaikkialla maailmassa korkeimmat esiintyvien Itä-Aasiasta, mukaan lukien Japani, Korea ja Kiina [1], [2]. Kiinassa eniten GC diagnosoidaan myöhemmissä vaiheissa johtaa huonoon ennusteeseen, jonka keskimääräinen 5 vuoden pysyvyys < 30%, kun taas Japanissa ja Koreassa yli 60% GC diagnosoidaan varhaisessa vaiheessa lähiyhteisön endoskooppinen seulontaa 5 vuoden pysyvyys > 80% [29], [30]. Vaikka vaikutus varhaisen havaitsemisen GC endoskooppinen seulonta on merkittävä Linqu, on ollut vain muutama väestöpohjainen seulonta GC Kiinassa korkeiden kustannusten ja puutteellisen ammattitaitoisen endoscopists.

GC on loppuun tulos on monivaiheinen mahavaurioita erilaisia ​​biologisia ominaisuuksia, joka antaa mahdollisuuden havaita GC varhaisessa vaiheessa käyttämällä biomarkkereita. Aiemmissa tutkimuksessa löysimme suhde seerumin PG I /II monotonisesti vähentynyt vakavuuden kanssa mahavaurioita kuitenkin herkkyys ja ennustamiseen kehittynyt mahavaurioita ja GC olivat huonot [31]. Äskettäin, varaamiseen näytön mukaan miRNA tärkeä rooli syövän synnyssä ja tuumorista peräisin miRNA voi tulla liikkeeseen huomattavan vakaa muoto [11], [32], [33], mikä viittaa siihen, että miRNA voitaisiin käyttää uusia ei-invasiivisia biomarkkereita varhaisen havaitsemisen GC.

viime aikoina tutkimus määritteli neljä ilmen- tymisen lisääntymisen GC-liittyvä miRNA (miR-17-5p, miR-21, miR-106a ja miR-106b) [34], joka myös näyttöön korkeammat ekspressiotasot GC seerumissa meidän array, kun taas silmiinpistävää downregulation let-7a tutkimuksessaan ei havaittu meille. Toisessa tutkimuksessa havaittiin viiden kohonnut seerumin miRNA (miR-1, miR-20a, miR-27a, miR-34 ja miR-423-5p) GC potilailla [13], kun taas vain miR-20a ja miR-27a oli voimistunut meidän array, ja miR-27a oli validoitu olevan huomattavan yliekspressoituvan GC potilailla. Osittain ristiriitaisia ​​tuloksia voi heijastaa eroja näytetyypeillä, seulontavälineinä tai kvantifiointimenetelmät [35].

Kolmesta seerumin miRNA tunnistettu Tutkimuksessamme miR-221 on todettu poikkeuksellisen yläreguloituja kudoksissa monissa syövän tyyppejä, kuten maha- [24], ja peräsuolen [21], eturauhas- [36] ja rintasyövän [37]. MiR-221 voisi transkription jälkeen tukahduttaa P27 ja P57, mikä helpottaa G1 /S faasimuutos ja parantaa solujen lisääntymistä ja kasvaimen kasvua [24], [36], [38], [39]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että ilmentymistaso miR-221 plasmassa liittyy eloonjäämisaste kolorektaalisyövän [40] ja etenemisen eturauhasen syöpä [41]. Vain harvat tutkimukset ovat tutkineet toiminnallista merkitystä miR-376c, kuten miR-376c voisi parantaa proliferaatiota, eloonjäämistä ja chemoresistance munasarjasyöpäsolujen kohdistamalla Alk7 [42]. Mir-744, sen ilme kuvio, fysiologinen ja suhde syövän syntymistä ovat tällä hetkellä tuntematon.

Meidän nykyisessä tutkimuksessa, löysimme tämän kolmen miRNA paneeli voisi erottaa seeruminäytteistä GC tarkastuksissa herkkyydellä 82,4% ja spesifisyys 58,8%. Lisäksi meidän tutkimus osoitti, että joukossa 30 varhaisvaiheen GC potilasta, 22 (73,3%) oli luokiteltu oikein, mikä viittaa tämä paneeli saattaa olla biomarkkerina varhaista havaitsemista GC. Lisäksi se nostaa esiin mahdollisuuden, että tämä paneeli miRNA voi olla käyttökelpoinen alustavana seulontamenetelmä GC väestössä on suuri riski GC.

Olimme myös kiinnostuneita tutkimaan yhdistysten Näiden kolmen seerumin miRNA ja erilaistumista laatuja GC. Vertaamalla miRNA seerumissa GC potilaalla on eri laatuja, löysimme korkeamman seerumin miRNA ilmaisun huonosti eriytetty GC. Tämä tulos osoitti, että korkea ekspressiotaso näiden seerumin miRNA GC potilailla liittyi pitkälle edennyt GC. Vaikka mekanismia tämän ilmiön on epäselvä, korkea näiden miRNA seerumissa voi olla arvo ilmoittaa, etenemisen ja hoidon valinta GC.

arvioitava, vieläkö tämä kolmen miRNA paneeli voisi ennustaa edenneen mahasyövän leesiot, kuten DYS. Löysimme vain miR-221 näkyy kohonnut ekspressiotaso DYS, mikä viittaa tämä paneeli oli spesifinen GC. Huolimatta rajallinen vaikutus tämän paneelin DYS havaitsemiseen, miR-221, yksi kolmesta seerumin miRNA, voivat olla hyödyllisiä yksilöimällä DYS aiheita on erittäin suuri riski sairastua GC. Mielenkiintoista, jonka takautuvasti seuraamalla kehitystä näiden DYS aiheista, löysimme alhaisempaa regressio lievempiä vammoja ja yksi tapaus GC ennustetussa riskiryhmään, jolla oli korkeampi seerumin miR-221 (tuloksia ei ole esitetty).

takautuvasti ilmentymistason tutkimisen kolmen seerumin miRNA pre-diagnoosi näytteitä GC potilaita, löysimme kasvussa aikana GC kehitystä, ja edelleen analyysi osoitti, että tämä paneeli voisi ennustaa GC enintään 5 vuotta ennen kliinistä GC diagnoosi. Nämä tulokset tukevat vahvasti arvo Näiden kolmen miRNA ennustamiseen GC esiintymisen. Yhdistämällä tämä kolmen seerumi miRNA allekirjoitusta patologinen diagnoosi voi parantaa varhaisen havaitsemisen GC henkilöillä kehittyneitä mahavaurioita, kuten IM ja DYS.

sulkea pois mahdollisuutta, että korkeampaan ikään ja lyhyempi säilytysaika seeruminäytteiden osaltaan korkeampi miRNA ajan, analysoimme miRNA ilmentymistä 82 valvontaa, joille tehtiin verta piirtää samalla pistettä GC potilaita. Mitään merkittävää eroa ei havaittu aikana seurantajakson aikana (tuloksia ei ole esitetty), mikä viittaa siihen, että nouseva seerumin miRNA tasolla koko GC kehitys ei johdu ikääntymisestä ja tukemiseen että miRNA oli läsnä seerumissa stabiilissa muodossa. Siten kiertävä miRNA voidaan käyttää biomarkkerina kehittää ei-invasiivisen testi GC havaitsemista tulevaisuudessa, koska sen helppo saatavuus, erittäin vakaa ja alhainen määritys kustannuksin.

Tutkimuksemme on useita vahvuuksia. Ensinnäkin kaikki aiheet tuli suuren riskin väestöä GC ja tehtiin tiukka patologisen diagnoosin, joka perusteltua hypoteesia, että havaittu ero seerumin miRNA tasojen välillä GC ja valvonta voisi johtua enimmäkseen, jos ei kaikki, että neoplastisen transformaation. Toiseksi väestömme-based study on korkea noudattamista ja yli 20 vuoden seurannassa tehosti tutkimuksen luotettavuutta, ja mikäli ensimmäinen todisteita dynaamisia muutoksia seerumin miRNA aikana GC kehitystä sekä niiden mahdollisia biomarkkereina tunnistaa korkean riskin yksilöitä GC.

Tämä tutkimus on myös joitakin rajoituksia. Koska hyvin harvat koehenkilöille diagnosoitiin normaalia mahan limakalvon tässä potilasryhmässä [17], käytimme potilailla, joilla SG /lievä CAG verrokkeina. Kuitenkin, verrattuna tutkimuksiin käyttäen yleisesti normaalihenkilöihin verrokkina, meidän patologinen diagnoosi ohjaukseksi valikoimastrategiassa laimennettu erilaisuudesta tapausten ja kontrollien välillä, ja näin ollen voi vain aiheuttaa aliarviointi tuloksia. Lisäksi havainnot esitutkimus, jossa pieni otoskoko edellyttävät lisävahvistusta suurissa tulevaisuudentutkimusta ja toiminnallinen merkitys vasta havaituille miRNA on vielä selvennettävä.

Yhteenvetona tällä population-based study tunnistimme joukko ero seerumin miRNA (miR-221, miR-376c ja miR-744) GC ja ehdotti niiden mahdollisuuksia uusia ei-invasiivisia biomarkkereita varhaisen havaitsemisen GC.

tukeminen Information
Kuva S1.
Seerumin 16 valitun miRNA 14 paria GC ja verrokeilla ensimmäisen vaiheen validointi. Mediaani kertamuutoksia of miRNA tasoja verrataan GC ohjaus- annettiin ja Wilcoxonin suoritettiin tutkimaan eroa kahden ryhmän välillä. Suhteelliset tasot miRNA (log10 mittakaavassa Y-akseli) oli normalisoitu piikki-in cel-miR-39.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0033608.s001
(JPG) B Taulukko S1.
doi: 10,1371 /journal.pone.0033608.s002
(XLS) B

• PLoS ONE: Maito käymisen Propionibacterium freudenreichii indusoi apoptoosia HGT-1 ihmisen mahasyövän Cells
• PLoS ONE: geneettinen alttius on CagA-Interacting molekyylit ja Gene-Environment Vuorovaikutusta Phytoestrogens: oletetun Risk Factor mahasyövän