PLoS ONE: alassäätely RPL6 siRNA Estää leviämisen ja solusyklin etenemisen of Human mahasyövän Cell Lines

tiivistelmä

edellinen tutkimus paljasti, että ihmisen ribosomaalisen proteiinin L6 (RPL6) oli säädellään ylöspäin monilääkeresistenteistä mahalaukun syöpäsolujen ja yli-ilmentyminen RPL6 voisi suojata mahalaukun syövän huumeen aiheuttama apoptoosin. Edelleen osoitettiin, että säätely ylöspäin RPL6 kiihtyi kasvattamiseen sekä in vitro pesäkkeenmuodostuskyvyn GES solujen samalla alas-säätely RPL6 näytteillä vastakkaisen tuloksia. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia mahdollista roolia RPL6 terapiassa mahasyövän varten klinikalla. Ilmentyminen RPL6 ja sykliini E mahasyövän kudoksissa ja normaali mahan limakalvoa arvioitiin immunohistochemisty. Todettiin, että RPL6 ja sykliini E ilmennettiin korkeammalla tasolla mahasyövän kudoksissa kuin normaalissa mahan limakalvoa ja kaksi oli Vastaavaa mahasyövän. Elinaika leikkauksen jälkeen potilaat analysoitiin Kaplan- Meier-analyysi, ja havaittiin, että potilailla, joilla on RPL6 positiivinen ilmaisu osoitti lyhyempi elinaika kuin potilailla, joilla RPL6 negatiivinen ilmaus. RPL6 oli silloin geneettisesti alassäädetty mahasyövän SGC7901 ja AGS solulinjoissa siRNA. On osoitettu, että down-regulation of RPL6 vähentää pesäkkeenmuodostuskyvyn mahalaukun syövän solujen in vitro ja vähentää solujen kasvua in vivo. Lisäksi säätely alaspäin RPL6 voisi tukahduttaa G1-S faasimuutos näissä soluissa. Edelleen, me osoitti, että RPL6 siRNA alassäädetty sykliini E ilmaisun SGC7901 ja AGS soluja. Yhdessä nämä tiedot osoittivat, että RPL6 oli yli-ilmentynyt ihmisen mahalaukun kudoksissa ja aiheutti huono ennuste. Down-regulation RPL6 voisi tukahduttaa solujen kasvua ja solusyklin etenemisen vähintään läpi alaspäin säätäminen sykliini E ja joita voidaan käyttää uutena lähestymistapa mahalaukun syövän hoidossa.

Citation: Wu Q, Gou Y, Wang Q, Jin H, Cui L, Zhang Y, et ai. (2011) alassäätely RPL6 siRNA Estää leviämisen ja solusyklin etenemisen of Human mahasyövän Cell Lines. PLoS ONE 6 (10): e26401. doi: 10,1371 /journal.pone.0026401

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 07 elokuu 2011; Hyväksytty: 26 syyskuu 2011; Julkaistu 17. lokakuuta 2011

Copyright: © 2011 Wu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain avustusta National Basic Research Program of China (nro 2010CB732400, No. 2010CB529300), ja National Natural Science Foundation of China (nro 30801349). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpää, joilla on korkea moraali, oli yksi pahanlaatuinen syövät Aasian maissa. Sen esiintyminen oli prosessi multi-tekijöiden ja multi-vaiheet, mukana muutoksia monissa molekyylejä, mukaan lukien aktivoituminen proto-onkogeenien, inaktivaatio kasvaimen synnyssä, muutokset solusyklin liittyviä proteiineja, ja niin edelleen. Viime vuosikymmenen aikana, suuri määrä esikasvaintekijöiden ja kasvaimen synnyssä on löydetty. Huolimatta siitä, että melkoinen määrä geenejä on jo kuvattu, uudet geenit onkogeeninen tai kasvaimeen estävä toiminta vielä tunnistettu. Kuitenkin, molekyylimekanismi mahasyövän jää epäselväksi.

Ribosomi on välttämätöntä proteiinisynteesiä kaikissa soluissa, joka muodostuu ribosomaalisen RNA: iden (rRNA) ja ribosomaalisen proteiinit (RP). Monet RP myös pelata erilaisia ​​rooleja, jotka ovat riippumattomia proteiinibiosynteesin, jota kutsutaan extra-ribosomaalisen toiminto [1]. Lisääntyvä enemmän tutkimus osoitti, että häiriö proteiinin käännös osallistui kasvainten synnyssä ja monissa ribosomaalisen proteiinit olivat huonosti kasvaimissa, mutta mekanismit olivat vielä tuntemattomia [2]. On ehdotettu, että monet RP toimivat haploinsufficient tuumorisuppressoreilla kaloissa ja monet RP geenejä voi olla onkogeeneistä ihmisen laji [3]. Varhaisin raportti suhteita RP ja kasvainten julkaistiin 90 s 20 ^{vuosisadalla, joka osoitti yhdistys RPS19 paksusuolen syöpä etenemisen ja erilaistuminen [4] .Thereafter, enemmän ja enemmän RP havaittiin huonosti kasvaimissa , kuten korkea ilmentyminen RPL19 rintasyövän kasvaimia [5], yli-ilmentyminen RPL7a ja RPL37 eturauhasen syövän kudosnäytteistä [6], korkeampi ilmentyminen RPL15 ruokatorven syöpä [7], RP kuten varhainen havaitseminen merkki ihmisen squamous cell carcinoma kohdunkaulan [8], ja yli-ilmentyminen RPL36a liittyy solujen lisääntymistä maksasyövän [9] ja niin edelleen. Kertomuksia yhdistys RP kanssa syövän synnyn nousivat vielä [2], [10]. Kuitenkin tarkka roolit RP kasvaimen kehitys ovat monipuolisia ja vielä lisäselvityksiä.}

Aiemmin olemme analysoineet mRNA profiilit ihmisen mahasyövän solulinjaa SGC7901 ja sen monilääkeresistenteistä variantti SGC7901 /videonauhuri differentiaalisella näyttöön PCR ja tukahduttaminen vähentävän hybridisaation [11], [12]. RPL6 tunnistettiin yksi yli-ilmentynyt geenien SGC7901 /ADR verrattuna SGC7901, mikä vahvistettiin edelleen RT-PCR: llä ja Northern blot-analyysi [13]. Myöhemmät tutkimukset paljastivat, että säätely ylöspäin RPL6 suojattu mahan syöpäsolujen adriamysiini-indusoitua apoptoosia ja parantaa vastustuskykyä mahasyövän solujen useiden kemoterapeuttisten lääkkeiden, kuten vinkristiini, adriamysiini, etopsidin, sisplatiini ja 5-fludrouracil [13]. Nämä tulokset osoittivat, että RPL6 voisi edistää pahanlaatuisten fenotyypit mahalaukun syövän soluja, jotka johtivat meidät suorita myöhemmän tutkimuksen tutkimaan edelleen tarkkaa roolia RPL6 syövän synnyssä ja kehittämisessä mahasyövän. Sitten huomasimme, että geneettisesti säätely ylöspäin RPL6 vuonna GES solut voitaisiin nopeuttaa kasvua ja parantaa in vitro pesäkkeenmuodostuskyvyn GES solujen samalla alas-säätely RPL6 voisi näytteille päinvastaisiin tuloksiin. Lisäksi säätely ylöspäin RPL6 voisivat edistää G1 S-vaiheeseen siirtymistä GES soluja. Lisäksi tutkimus osoitti, että RPL6 sääteli sykliini E ilmentymistä GES soluissa [14]. Yhdessä nämä tiedot osoittivat, että RPL6 voisi edistää pahanlaatuisten fenotyypit mahasyövän solujen ja RPL6 voisi olla onkogeenisessä rooli kasvainten synnyssä ja mahasyövän, joka johti meidät käymään nykyiset tutkimuksen tutkia mahdollista roolia RPL6 geenien terapia mahalaukun syövän ja voitaisiin käyttää uutena lähestymistapa mahalaukun syövän hoidossa.

tulokset

RPL6 ja sykliini E ilmentymistä ihmisen mahasyövän yksilöitä ja sovitettu viereisen ei-neoplastisia kudoksia

tutkia suhteita RPL6 ja sykliini E ilmaisun kehittämisen kanssa mahasyövän, havaitsimme RPL6 ja sykliini E ilmentymistä ihmisen mahasyövän kudosten ja sovitettu viereisen ei-neoplastisia kudoksia immunohistokemiallisella värjäyksellä. Tulokset paljastivat, että RPL6 ja sykliini lokalisoitu lähes sytoplasmassa ja vain satunnaisesti ytimien mahasyövässä soluissa (Kuva. 1A). Tarkempi analyysi havaitsi, että positiivinen suhde (mukaan lukien näytteet, että värjätty) RPL6 oli 84% (46 55: sta), kun taas positiivisessa suhteessa sykliini E oli 75% (41 55: sta) ihmisen mahasyöpä yksilöitä. Myönteinen suhde molempien RPL6 ja sykliini E oli 70% (38 55 potilasta), kun taas negatiivinen suhde (myös yksilöitä, jotka eivät tahraa) sekä RPL6 ja sykliini E oli 11% (6 55 potilasta) ihmisen mahasyöpä yksilöt . Positiivinen suhde sekä RPL6 ja sykliini E oli 18% (8 55 potilaista) sovitetun vieressä olevaan ei-neoplastisia kudoksia (tietoja ei esitetä). Mitä eroja RPL6 ilmaisun ja sykliini ilmentymistä ihmisen mahasyövän yksilöitä, ei ollut eroa. Tämä tutkimus osoitti, että RPL6 ja sykliini E ilmaisuja ihmisen mahasyövän näytteet olivat suhteellisen (Fig. 1 B, p < 0,05), joka voi olla con-antelias rooli kehityksen mahasyövän ja RPL6 ja sykliini E voi toimia biomarkkereiden mahasyövän diagnosointiin ja geenikohteen mahasyövän hoidossa. Lopussa seurata, elinaika potilaista analysoitiin Kaplan- Meier menetelmällä ja tulokset osoittivat, että aikana potilaat, jotka seurattiin, potilailla, joilla on sekä RPL6 positiivisia ja sykliini E positiivinen osoitti lyhyempi elinaika ja huonompi ennuste kuin sekä RPL6 negatiivinen ja sykliini E negatiivinen ilmaus, tai joilla on RPL6 positiivinen ja sykliini E negatiivinen tai RPL6 negatiivinen ja sykliini positiivinen ilme vastaavasti (Fig. 2 A, p < 0,01), joka voidaan osoitti, että potilailla, joilla on sekä RPL6 positiivinen ja sykliini E positiivinen osoitti huonoon ennusteeseen. On myös osoitettu, että potilaat, joilla RPL6 negatiivinen ilmaus osoitti pidempi elinaika kuin RPL6 positiivisia (Fig. 2B, p < 0,01), ja potilaille, joilla on sykliini E positiivinen ilme osoitti huonoon ennusteeseen (Fig. 2C, p < 0,01). Siksi voidaan päätellä, että RPL6 voi toimi biomarkkeri arvioimiseksi ennustetta mahasyöpäpotilaista.

ilmentäminen RPL6 mahasyövän solulinjoissa ja sen johdannaiset

Tutkimaan edelleen mahdollinen rooli RPL6 geeniterapiassa mahalaukun syövän, SGC7901 ja AGS-solut transfektoitiin RPL6-spesifinen siRNA, ja seka-allas G418-resistenttien solujen varianttien on tuotettu. G418-resistenttien varianttien kätkeminen RPL6 erityisiä siRNA oli vastaavasti nimetty SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 ja SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2. G418-resistenttien solujen kätkeminen scramble siRNA plasmideja suunniteltiin SGC7901-siControl ja AGS-siControl vastaavasti. Kuten kuviossa 3A on esitetty, RPL6 ekspressio oli merkittävästi säädellä vähentävästi SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 ja SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 soluissa verrattuna vanhempien solujen ja kontrollisolujen. Esillä olevassa tutkimuksessa, SGC7901-siRPL6-2 ja AGS-siRPL6-2 osoitti tehokkaampia estävä tuloksia, jotka osoittivat, että SGC7901-siRPL6-2 ja AGS-siRPL6-2 soluja voidaan käyttää hyvänä solun malli selkeyttää mahdollisten roolia RPL6 geeniterapiassa mahasyövän klinikan.

alassäätely RPL6 vähentää mahan syöpäsolujen kasvua in vitro

tutkia, alas-säätely RPL6 ilmaisun voisi estää kasvun SGC7901 ja AGS solut, vanhempien solut, ohjaus solut ja niiden muunnokset ympättiin kulttuuriin levyille ja niiden kasvua seurattiin joka päivä MTT-määritys. Kuten osoitetaan kasvukäyrät kuviossa 3B, ohjaus (SGC7901-siControl ja AGS-siControl) soluissa oli samanlainen kasvuvauhdin vanhempien (SGC7901 ja AGS) soluissa, kun taas SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 ja SGC7901 -siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 solujen näytteillä pienempi kasvuvauhti kuin Verrokkisoluja, ja SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 solut osoittivat alimman kasvuvauhtia (Fig. 3B, p < 0,05). Ankkuroinnista riippumattoman kasvun näiden solujen analysoitiin lisäksi pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen määritys. Kävi ilmi, että SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 ja SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 solut tuottivat paljon vähemmän solujen pesäkkeitä pehmeässä agarissa kuin vanhemman solujen ja kontrollisolujen (Fig. 3C, p < 0,05), solut nimetty SGC7901-siRPL6-2 ja AGS-siRPL6-2 tuotettu vähiten pesäkkeitä. Nämä tiedot osoittivat, että alas-säätely RPL6 voisi vähentää mahan syöpäsolujen kasvua ja estävät pesäkkeiden muodostumista kyky SGC7901 ja AGS soluja.

RPL6 siRNA estivät kasvaimien syntyyn mahasyövän solujen in vivo

edelleen vahvistavat vaikutukset RPL6 on tuumorigeneesin mahalaukun syövän, kasvaimen muodostumisen määritys suoritettiin nude-hiirissä. SGC7901, AGS ja SGC7901-siRPL-2, AGS-siRPL6-2 soluja ihon alle istutettiin oikealle tai vasemmalle yläselän Kateenkorvattomien nude-hiirten yhdellä sivustolla. (Fig. 4A ja C) Neljä viikkoa myöhemmin hiiret tapettiin ja siirrettyjen kasvainten leikattiin irti ja kasvainten koot arvioitiin (Fig. 4B ja D, p < 0,05). Oli merkittävä väheneminen kokoisia ksenograftien in RPL6 alassäädetty soluissa. Nämä tulokset osoittivat, että knock-alas RPL6 voisi vähentää mahan syöpäsolun tuumorigeneesiä in vivo ja RPL6 voi olla keskeinen rooli edistettäessä pahanlaatuisen kasvaimen mahasyövän solujen in vivo.

RPL6 hidastui G1-S-vaiheessa siirtyminen SGC7901 solut

paljastaa mekanismeista ehkäisevän rooli RPL6 mahalaukun syöpäsolujen kasvua, vaikutusten RPL6 solusyklin jakautumista SGC7901 solut analysoitiin (Fig. 5A). Kuten kuviossa 5B on esitetty, SGC7901-siRPL6-1 solut osoittivat hieman kasvanut osuus G1 vaiheen ja laski prosenttiosuus S-faasissa, kun taas SGC7901-siRPL6-2 solujen näytetä merkittävästi lisääntynyt prosenttiosuus G1 vaiheen ja laski prosenttiosuus S-vaiheessa (P < 0,05 ) verrattuna vanhempien soluihin ja Verrokkisoluja. Nämä osoittivat, että RPL6 erityisiä siRNA voi hidastua G1-S siirtyminen SGC7901 soluja.

RPL6 alassäädetty ilmentymistä sykliini E mahasyövän solujen proteiini tasolla

On hyvin tiedossa että G1-S etenemistä ohjataan sykliini D /CDK4 ja sykliini E /CDK2 komplekseja, jotka säätelevät INK4 perheenjäsenten, p21 ja p27, vastaavasti. Ilmaisu Näiden sääntelyviranomaisten SGC7901 ja AGS solut ja sen variantit määritettiin Western Blot-analyysi. Kuten kuviossa 6, ilmaus sykliini E oli merkittävästi säädellä vähentävästi SGC7901-siRPL6-2 ja AGS-siRPL6-2 soluissa. Ilmauksia CDK2, p16, p21 ja p27 olivat ennallaan SGC7901 ja AGS solujen muunnelmia. Nämä tiedot osoittivat, että alas-säätely RPL6 vähentynyt ilmentyminen sykliini E SGC7901 ja AGS soluja, mikä saattaa rajata mahdollista roolia RPL6 ja sykliini E kehittämisessä mahasyövän ja RPL6 voidaan käyttää geeni kohteena mahasyövän klinikalla.

keskustelu

Tämä tutkimus osoitti, että RPL6 ja sykliini E oli yli-ilmentynyt mahasyövän kudoksiin ja on positiivinen korrelaatio niiden mahasyövässä kudoksissa. Seurataan Tulokset paljastivat, että potilailla, joilla RPL6 negatiivinen ilmaus osoitti pidempi elinaika kuin ne, joilla RPL6 positiivinen ilme, joka ehdotti, että RPL6 positiiviset potilaat osoittivat huono ennuste. Edelleen tutkimus osoitti, että alas-säätely RPL6 by RPL6 erityisiä siRNA inhiboivat ja kiinnittymisestä riippumatonta kasvua mahasyövän solulinjoissa in vitro, tukahdutettu solusykliä ja tukahdutti sykliini E ilmaisua, Lisäksi knockdovvn RPL6 by RPL6 erityisiä siRNA tukahdutti kasvaimen muodostumisen kyky mahasyövän soluihin in vivo.

meidän edellisessä tutkimuksessa ilmentyvät eri geenit liittyvät monilääkeaineresistenssin mahasyövän soluja eristettiin käyttäen ero display RT-PCR ja vähentävän hybridisaation [11], [ ,,,0],12]. RPL6, osa suuren alayksikön ribosomin, oli siten eristettiin klooni yli-ilmentynyt monilääkeresistenteistä mahasyövän soluihin [11]. On osoitettu, että RPL6 voisi suojata mahalaukun syövän solujen kemoterapeuttisen lääkkeen indusoiman apoptoosin [13]. Nämä tiedot osoittivat, että RPL6 saattaa liittyä sääntelyssä pahanlaatuinen fenotyyppi mahasyövän. Lisäksi tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia roolia RPL6 että kasvainten synnyssä ja mahasyövän, ja tulokset viittaavat siihen, että säätely ylöspäin RPL6 nopean kasvun ja in vitro pesäkkeenmuodostuskyvyn GES soluissa, kun taas alas-säätely RPL6 näytteillä päinvastaisiin tuloksiin. Myös up-säätely RPL6 kiihtyi G1 S-vaiheeseen siirtymistä GES solujen vähintään avulla ylös-säätely sykliini E ilmaisun taas alas-säätely RPL6 osoitti päinvastaisiin tuloksiin [14]. Yhdessä nämä tiedot osoittivat, että RPL6 voisi olla onkogeenisessä rooli kasvainten synnyssä ja kehittämisessä mahasyövän ja voisi toimia uutena lähestymistapa geeniterapiaan mahasyövän.

Nykyään yhä enemmän potilaita kuoli syöpään takia pahanlaatuinen fenotyypit niistä. Syöpähoidon häiriintynyt ihmistä eri puolilla maailmaa. Lisäksi kemoterapia ja kirurgia, geeniterapia on uusi ja lupaava syövän hoidossa. Yksi yleisimmin käytetyistä menetelmistä geenihoitoon on RNA-interferenssi (RNAi). RNAi, erittäin konservoitunut geenien mekanismi on tärkeä rooli geenin ilmentymisen säätelyyn. Geenien jonka transkription jälkeinen järjestelyihin homologisen kaksijuosteinen RNA havaittiin ensimmäisen keinotekoiset järjestelmät, joissa kaksinkertainen RNA (dsRNA) esiteltiin kautta injektiona tai ilmaus siirtogeenisiä konstruktioita. Tämä ilmiö tapahtuu pieni häiritsevä RNA (siRNA) sytoplasmassa nisäkässoluissa. SiRNA teknologia, kaksi toimitusmekanismit katsottiin, suora toimitus synteettisten siRNA nukleotidin ja käyttöönotto plasmidi-DNA (pDNA), joka koodaa lyhyen hiusneula konstruktio (shRNA), joka olisi entsymaattisesti osaksi siRNA [15]. SiRNA pelataan sen estävää roolit sovittamalla kanssa sekvenssit mRNA ja estivät seurauksena mRNA ilmaisun ja kääntäminen, ja toimi negatiivisena asetuksella. Nykyään yhä enemmän tutkijat ovat havainneet, että tippuu alas geeniekspressiota siRNA voisi merkittävästi tukahduttaa kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden. X-kromosomiin liittyvä estäjä apoptoosin proteiinia (XIAP), tärkeä jäsen estäjien apoptoosin proteiinin (IAP) perhe, osallistuu solujen jakautumisen ohjaamiseen, soluproliferaatiota ja apoptoosin [16], [17]. Down-regulation of XIAP siRNA voisi merkittävästi estää kasvainsolujen proliferaatiota ja herkistää kasvainsolut kemoterapia-aineiden [18], [19]. Osteopontiinin (OPN) proteiini, joka yli-ilmentyy useimmissa mahasyövän potilaiden ja liittyy sen synnyssä, oli tärkeä rooli leviämisen, invaasio, etäpesäke ja selviytyminen mahasyövän [20]. Sitten alas-säätely OPN by OPN-erityisiä siRNA estivät merkittävästi kasvua, muuttoliike ja invaasion mahasyövän solujen [21]. CML66, uusi kasvain antigeeni, joka pelataan onkogeenisessä rooli, oli yli-ilmentynyt useimmissa syöpäsolun linjat ja syöpiä [22], kaatamalla sen ilmentymisen CMl66-erityisiä siRNA esti merkittävästi proliferaatiota, invaasiota ja etäpesäkkeiden HeLa-solujen sekä vivo ja in vitro kokeissa [23]. FABP5, joka koodaa ihon rasvahappo sitovan proteiinin (C-FABP), on säädelty eturauhassyövässä ja toimii otaksuttu onkogeeni. Down-regulation FABP5 by FABP5-erityisiä siRNA esti eturauhasen syöpäsolun kasvua nude-hiirissä [24]. Lisäksi kun ribosomaalinen proteiini RPS13 joka parantaa mahasyövän solulinja SGC7901 kasvua, joka pudotettiin by RPS13-erityisiä siRNA, se esti merkittävästi SGC7901 solujen kasvua ja pesäkkeenmuodostuskyvyn in vitro ja esti tuumorin muodostumiseen kyky nude mouse [25]. Aiempi tutkimus havaitsi myös, että systeemisesti siRNA kautta atelokollageenia joka kohdistuu erityisesti kasvaimiin, on turvallinen ja toteuttamiskelpoinen syövän hoidon eturauhassyövän [26]. Siksi todisteet edellä ehdotti, että siRNA, estämällä geenin ilmentyminen voisi olla uudenlainen lähestymistapa syöpähoidon ja tehdä syövän geeniterapian toteutettavissa kliiniseen hoitoon.

Tässä tutkimuksessa, ilmauksia RPL6 ja sykliini E Mahan syöpä kudoksiin ja vastaavan viereisen ei-neoplastisia kudoksia havaittiin ja tulokset osoittivat, että RPL6 ja sykliini E osoittivat korkeampia ilmentymistä mahasyövän kudoksissa kuin sovitetun viereisen ei-neoplastisia kudoksia. Lisäksi on olemassa korrelaatio RPL6 ja sykliini E ilmentymisen mahasyövässä kudoksissa, mikä viittasi siihen, että ne voivat olla con-antelias rooli kehityksen mahasyövän ja RPL6 voisi toimia biomarkkeri mahasyövän diagnoosia. Seurataan tulokset osoittivat, että potilailla, joilla sekä RPL6 positiivisia ja sykliini E positiivisia ilmaisuja osoitti lyhyempi elinaika ja huonompi ennuste kuin vastaava valvonta ja myös, että potilailla, joilla RPL6 negatiivinen ilmaus osoittivat pidemmän elinaika ja parempi ennuste kuin potilailla, joilla RPL6 positiivinen ilme, joiden mukaan RPL6 voi toimi biomarkkerina mahasyövän ennustetta ja geenikohteen mahasyövän hoidossa klinikalla.

edelleen tutkia mahdollisuuksia toteutettavuus RPL6 kuten geeniterapian kohteena mahasyövän klinikalla, koputimme alas RPL6 ilmentyminen SGC7901 ja AGS solujen RPL6-erityisiä siRNA, tulokset osoittivat, että alas-säätely RPL6 mahasyövän vanhempien solulinjoissa (SGC7901 ja AGS) tehokkaasti estivät solujen kasvua ja in vitro pesäkkeenmuodostuskyvyn. Edelleen, solusyklin analyysi osoitti, että alas-säätely RPL6 hidastui G1-S-vaiheessa mahalaukun syöpäsoluja. Western blot-analyysi osoitti, että RPL6 esti solusyklin etenemistä läpi alas-säätely sykliini E. kasvainmuodostusta kokeita nude-hiirissä ehdotti, että alas-säätely RPL6 voisi kasvaimien muodostumisen estämiseksi in vivo.

sykliini E, keskeinen solu sykli proteiini, joka oli merkittävä rooli G1-S siirtyminen oli häiriö monissa eri kasvaimissa [27], [28], [29], [30], [31]. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että sykliini E oli tärkeä molekyyli kasvainten synnyssä. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme havainneet, että sykliini E ilmaisua, yhdessä RPL6 oli suurempi ihmisen mahasyövän kudosten kuin että täsmäsi vieressä olevaan ei-neoplastiset kudokset, jossa ehdotetaan rooli sykliini E pelataan mahasyövän. Edelleen tutkimus osoitti, että RPL6 vaikuttaa solujen kasvua säätelemällä sykliini E, jotka osoittivat, että korkea ilmentyminen sykliini E kiihtyi solujen kasvua, kun taas vähäinen ilmaus sykliini E hidastui solujen lisääntymistä. Sykliini E ja RPL6 voi pelata con-antelias mukana kehittämässä mahasyövän.

Yhteenvetona esillä tutkimus osoitti, että RPL6 ja sykliini ilmaisun liittyivät toisiinsa mahasyövän kudoksissa ja ne saattavat pelata CON- antelias mukana kehittämässä mahalaukun syövän, joka ehdotti, että RPL6 voidaan käyttää diagnostisena työkaluna mahasyövässä. Seuranta data-analyysi osoitti, että potilailla, joilla RPL6 negatiivinen ilmaus osoittivat pidemmän elinaika ja parempi ennuste kuin potilailla, joilla RPL6 positiivinen ilme postoperatively, joka ehdotti, että RPL6 toimi biomarkkerina mahasyövän ennustetta ja uusi geeni tavoite mahasyövän hoidossa. Lisäksi tutkimus osoitti, että alas-säätely RPL6 ilmentymisen RPL6-erityisiä siRNA esti SGC7901 solujen kasvua ja in vitro pesäkemuodostusta kyky, hidastui SGC7901 solu G1-S faasimuutoksen, ja tukahdutti kasvaimen muodostumiseen in vivo. Lopuksi todettakoon, että esillä oleva tutkimus vahvisti, että RPL6 siRNA voitaisiin käyttää uutena lähestymistapa mahasyövän hoitoa klinikalla.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

kudosnäytteet kaikki potilaat ilmoitettiin suostumuksen käyttää ylimääräinen patologiset näytteet tutkimustarkoituksiin. Protokollat ​​Tässä tutkimuksessa käytetyt hyväksyi sairaalan koehenkilöiden suojelemiseen komitean. Käyttö ihmiskudosten hyväksyi Institutional Review Board neljännen Military Medical University, ja oli sopeutui Helsingin julistuksen ja paikallisen lainsäädännön. Potilaat tarjoaa näytteitä tutkimusta varten allekirjoittivat tietoon perustuvan suostumuksen muotoja. Eläintutkimukseen, kaikki menettelyt eläinkokeiden tehtiin mukaisesti Institutional Animal Care ja käyttö komitean suuntaviivat Experiment Animal keskustan neljännen Military Medical University. Hyväksyntä tunnus käyttämällä eläimiä oli nro 10218 mukaan Experiment Animal Centerin neljännen Military Medical University.

Kudosten yksilöitä ja solulinjoissa

kudosnäytteet parafiinilla kerättiin 55 potilasta, joilla mahasyöpä, jolle tehtiin gastrektomia meidän sairaalassa vuosina 2004 ja 2009. Kaikki tapaukset mahasyövän ja viereisen ei-kasvainkudoksista diagnosoitiin kliinisesti ja patologisesti. Tiedot kliinis-ennusteissa potilaista kerättiin ja analysoitiin jälkikäteen. Kaikkiaan 55 potilasta seurattiin loppuun vuoden 2009 ja kaksi niistä oli menetetty aikana sekä seurantajakson ajan. Ihmisen mahalaukun Adenokarsinoomasolulinja SGC7901 saatiin Academy of Military Medical Science, AGS saatiin Shanghai Cell Bank (Shanghai, Kiina). Kaksi solulinjat säilytettiin meidän instituutti. Kaikki solulinjat pidettiin RPMI1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), johon oli lisätty 10% lämpöinaktivoitua vasikan sikiön seerumia (FCS) 37 ° C: ssa, 5% CO _{2: ssa kostutetussa inkubaattorissa (Forma Scientific, Marietta, OH).}

immunohistokemia ja immunohistokemiallinen pisteytys

parafiini ja nesteytyksestä leikkeitä pestiin makeassa vedessä 10 minuuttia. Lämmön aiheuttama antigeeni haku suoritettiin 20 minuutin ajan 95 ° C: ssa 10 mM sitraatti natrium- puskurissa (pH 6,0). Sen jälkeen, kun kalvot oli jäähdytetty huoneen lämpötilassa 40 minuuttia, ne blokattiin 3% vetyperoksidia 20 minuuttia ja sitten normaalia vuohen seerumia eristämällä nestettä 40 minuuttia. Tämän jälkeen niiden annettiin reagoida yli yön 4 ° C: ssa ensisijaisen vasta-IgG, RPL6 ja sykliini (Santa Cruz). Sen jälkeen, kun rewarming 40 minuuttia, ne saatetaan sitten reagoimaan toisen vasta-aineita (Zhongshan Goldenbridge Biotechnology CO.LTD) vielä 40 minuuttia huoneenlämpötilassa. Sitten tuotteet kehitettiin 3,3'-diaminobentsii- ja vastavärjättiin hematoksyliinillä. Pisteytys valmistui erikoislääkärin patologi ja tiedemies, joka sokaisi kliiniseen ja patologisen tietoa. Merkittiin, yksimielisyys saavutettiin Conferencing. Osuudet positiivisten solujen (0-3) ja värjäyksen intensiteettiä (0-3) arvioitiin erikseen suurennuksella x 200. Entinen laskettiin laskemalla värjäytyneiden tuumorisolujen kesken kokonaismäärä kasvainsolujen, esimerkiksi silloin, kun 25% solut värjättiin osuus pistemäärä oli +1, ja 50% on yhtä suuri kuin +2, 75% on +3, 0% on yhtä kuin 0. intensiteetti pisteytys arvioitiin väri värjätään kasvain tuma, erityisesti pisteet 0 tarkoittaa akromaattinen, +1 tarkoittaa meripihka, +2 tarkoittaa keltainen, ja +3 merkitsee ruskea. Yhdistetty pisteytys + 1~ + 2 määriteltiin "negatiivinen", ja + 3~ + 6 katsottiin "positiivinen".

Plasmidin rakentaminen ja transfektio

Kaksi paria hiusneula Sirna (siRNA ) oligoja varten RPL6 suunniteltiin mukaan siRNA suunnitteluohjeisiin Takara Biotechnology Co., Ltd Vertaa kohdesekvenssien ihmisen genomin tietokannasta BLAST-haussa poistamaan sen riittävyyttä kohdesekvenssin kanssa 21 emäsparin homologia vierekkäisiä muihin koodaussekvenssit . Oligolle-1, sense: 5'-GATCCGGAGAAGGTTCTCGCAACTTTCAAGAGAAGTTGCGAGAACCTTCTCCTTTTTTGGAAA-3 ', antisense: 5'AGCTTTTCCAAAAAAGGAGAAGGTTCTCGCAACTTCTCTTGAAAGTTGCGAGAACCTTCTCCG-3'; ja oligo-2, sense: 5'-GATCCGTCGAGTTCCTCTACGAAGATTCAAGAGATCTTCGTAGAGGAACTCGATTTTTTGGAAA-3 ', antisense: 5'-AGCTTTTCCAAAAAATCGAGTTCCTCTACGAAGATCTCTTGAATCTTCGTAGAGGAACTCGACG-3'; Sekoituskoodin DNA-dupleksi myös suunniteltu säädöllä, oligo-1, sense: 5'-GATCCGGTGAGATCTTCGACACAGTTCAAGAGACTGTGTCGAAGATCTCACCTTTTTTGGAAA-3 ', antisense: 5'-AGCTTTTCCAAAAAAGGTGAGATCTTCGACACAGTCTCTTGAACTG TGTCGAAGATCTCACCG-3'. Hehkutus muodostamiseksi DNA-dupleksit, 0,01 M jokaista sense- ja antisense-oligoja käytettiin. Dupleksit laimennettiin ja sitten liitettiin pSilencer3.1-H1 neo vektorin (Takara Biotechnology (Dalian) Co., Ltd). Tuotteet transformoitiin DH5a-kompetentteja soluja. Ampisilliini-resistentit pesäkkeet valittiin, jonka tunnuksena restriktiodigestiolla, ja edelleen varmistettiin DNA-sekvensoinnilla. Mukaan valmistajan ohjeita, siRNA plasmidit RPL6 transfektoitiin SGC7901 soluihin käyttäen Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA), vastaavasti. Kaksikymmentäneljä tuntia transfektion jälkeen, G418 (400 ug /ml) lisättiin elatusaineeseen ja vakaiden klooneja. Sekoitetut kloonit laajennettiin vielä 2 kuukautta. SGC7901 ja AGS soluja (kutsutaan myös vanhempien soluja), jotka ekspressoivat stabiilisti täytteen RPL6 nimettiin SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1, ja SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2. Ja solut, jotka on transfektoitu siControl nimettiin SGC7901-siRPL6 ohjaus ja AGS-siRPL6 ohjaus (jota kutsutaan myös kontrollisoluja).

Soluproliferaatiomääritys

3- (4,5-dimetyylitiatsol-2- yyli) -2,5-difenyyli-tetratsolium (MTT) määritys suoritettiin vaikutuksen arvioimiseksi RPL6 soluproliferaatioon, kuten aiemmin on kuvattu [32]. Absorbanssi 490 nm: ssä (A490) Kunkin kuopan luettiin mikrolevylukijalla BP800 (Biohit, Helsinki, Suomi). Kukin koe suoritettiin neljänä rinnakkaisena ja toistettiin 3 kertaa.

Soft agar pesäkkeiden muodostumisen määritykset

Soft agar pesäkkeiden muodostumisen määritystä käytettiin sen määrittämiseksi, ankkuroitumisesta riippumattoman solukasvun potentiaalia. Kaksitoista kuoppalevyille täytettiin 0,5 ml: lla 0,5% jalo agar (Invitrogen) RPMI1640 täydennetty 10% vasikan seerumia, koska pohjakerros ja annettiin jähmettyä 4 ° C: ssa yön yli. Yhteensä 200 solut suspendoitiin 0,25 ml: aan 0,3% agaroosia ja ympättiin pohjassa agar. Soluviljelmälevyihin ylläpidettiin 2 viikkoa CO _{2-inkubaattorissa. Pesäkkeiden määrä laskettiin mikroskoopilla.}

tuumorigeenisyyden nude-hiirissä

Kasvainten muodostuminen suorittaa vaikutusten arvioimiseksi RPL6 on kasvainten muodostumiseen in vivo. BALB /c-nude-hiiret 4-6 viikkoa toimittivat Shanghai Cancer Institute ja sijaitsee mikro-eristäjä häkeissä positiivisessa ilmanpaineessa, ja pidettiin vakiolämpötilassa (22 ° C) ja kosteus varten tuumorigeenisyyden tutkimuksessa. Noin 3 x 10 ^{6 soluja log-vaiheessa kerättiin ja ihonalaisesti yläselän BALB /c-nude-hiirissä. Ainakin kolme nude-hiiriä käytettiin kussakin ryhmässä. Hiiret tapettiin 4 viikkoa myöhemmin ja tuumorin paino kunkin hiiren arvioitiin. Kaikki menettelyt eläinkokeiden tehtiin mukaisesti Institutional Animal Care ja käyttö komitean suuntaviivat Experiment Animal keskustan neljännen Military Medical University.}

Solusyklianalyysiä

analyysi solusyklin vaihe jakelu, SGC7901 ja sen variantit on log-vaiheessa kerättiin ja pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä. Solupelletit kiinnitetään 70% etanolissa, käsitellään RNaasi A: lla (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) ja värjättiin propidiumjodidilla (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

• PLoS ONE: DNA Repair Gene APE1 T1349G polymorfismi ja mahalaukun syövän riski on kiinalainen Population
• PLoS ONE: Menetys promyelosyyttileukemian proteiini mahasyövän: Implications for IP-10 Expression ja kasvain-infiltroivien Lymphocytes