PLoS ONE: pyruvaattikinaasia M2 on kaksijakoinen rooli sääntelyyn EGR /EGFR Signaling via E-kadheriinin riippuvaisesti mahasyövän Cells

tiivistelmä

Tausta ja Tavoitteet

EGFR aktivointi ja PKM2 ilmaisun ovat avainasemassa kasvainten synnyssä. EGFR aktivointi säätelee PKM2 funktioita subsellulaarisessa riippuvaisella tavalla ja edistää geenin transkriptio ja kasvaimen kasvua. Lisäksi PKM2 ylössäädellään EGFR aiheuttaman reittejä gliooman syöpäsairauksia. Kuitenkin olemme huomanneet, että PKM2 voisi myös säätelevät EGR /EGFR-signalointireitin mahalaukun syöpäsoluja. Meidän tavoitteena oli määritellä biologisten mekanismien PKM2 säätelemään solun liikkuvuus ja invaasiota.

Methods

Meillä työskentelee vakaa transfektio lyhyt hiusneula-RNA vakaasti vaientaa ilmaus PKM2 että BGC823, SGC7901 ja AGS mahasyövän solulinjoissa. Vaikutukset PKM2 in vitro määritettiin arvioimalla solumigraation ja invaasiota. Immunohistokemiallista analyysiä käytettiin tutkimaan välisiä suhteita PKM2 ja muita proteiineja.

Tulokset

Tuloksemme osoittavat, että knockdovvn PKM2 vähensi aktiivisuutta E-kadheriinin ja tehosti EGF /EGFR signalointireitille mahalaukun solulinjoissa BGC823 ja SGC7901 jotka olivat positiivisia E-kadheriinin ilmentymisen. Kuitenkin erilaistumaton mahakarsinoo- solulinjaa AGS, josta puuttuu E-kadheriinin ilmentymisen, PKM2 edistänyt solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Immunohistokemiallinen analyysit osoittivat, että tasot E-kadheriinin ilmentymisen, ERK1 /2 fosforylaation, ja sytoplasman PKM2 ilmaisun korreloivat keskenään.

Johtopäätös:

PKM2 voi pelata erilaisia ​​rooleja eri eriytetty mahalaukun syöpäsolutyyppien, ja tämä päätelmä olisi yhdenmukainen aiempien kliinisen tutkimuksen. Tulokset Tutkimuksemme paljastaa tärkeän linkin PKM2 ja E-kadheriinin aikana EGFR-stimuloidun mahasyövässä solun liikkuvuus ja invaasiota.

Citation: Wang LY, Liu YP, Chen LG, Chen YL, Tan L, Liu JJ, et ai. (2013) pyruvaattikinaasia M2 on kaksijakoinen rooli sääntelyyn EGR /EGFR Signaling via E-kadheriinin riippuvaisesti mahasyövän Cells. PLoS ONE 8 (6): e67542. doi: 10,1371 /journal.pone.0067542

Editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japani

vastaanotettu: 07 helmikuu 2013; Hyväksytty: 20 toukokuu 2013; Julkaistu: 28 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 30971362, 81072013 & 91229201), perustutkimus rahastoja Keski yliopistojen Kiinassa (nro 2010111082) ja Ministry of Health Foundation valtion Key Clinical osasto. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

pyruvaatti-kinaasi (PK) välittää lopullinen nopeutta rajoittava vaihe glykolyysin kataly- defosforyloitumista fosfoenolipyruvaattia (PEP) ja pyruvaatin, jolloin saatiin yksi molekyyli ATP. Nisäkässoluissa on neljä pyruvaattikinaasia isoentsyymien (M1, M2, L ja R), jotka ilmentyvät selektiivisesti eri solujen ja kudosten [1]. Nisäkkäillä, M1 isoformin (PKM1) ilmentyy useimmissa aikuisen kudoksissa. M2 isoformi (PKM2), vaihtoehtoisesti silmukoituneen variantti M1, ilmentyy alkion kehityksen aikana [2]. Tutkimuksissa on havaittu, että syöpäsolut yksinomaan ilmaista PKM2 [3], [4]. PKM2 on osoitettu olevan olennainen aerobinen Glykolyysivaiheen kasvaimissa (Warburg vaikutus). Vuosien mittaan merkittäviä edistysaskeleita on tehty ymmärtämisessä toiminta ja sääntely PKM2 kuin pyruvaattikinaasia ja proteiinikinaasi syöpäsoluissa [5]. Tuore tutkimus vahvisti, että PKM2 aiheuttama epidermaalinen kasvutekijä (EGF) translokoituu tumaan glioblastoomasolujen, vuorovaikutuksessa β-kateniinin ja johtaa cyclinD1 ilmaisu, joka edistää solujen lisääntymistä ja kasvaimen kehittymisen [6]. Nämä havainnot paljastavat uusi rooli PKM2 transkription koaktivaattorikompleksien. On kuitenkin olemassa joitakin ristiriitoja suhteen spesifisyys ja mahdollisuudet PKM2 anti-syöpä kohde syövän hoidossa. Viime havainto osoitti, että PKM2 ilmentyminen korreloi voimakkaasti mahalaukun syöpä erilaistumista. Eriytetyn syöpätyypit ilmaista enemmän PKM2 proteiinia kuin tehdä eriytymättömiä niistä. PKM2 oli kielteinen ennustetekijä sinettisormus solussa mahasyövän [7]. Biologisen roolin PKM2 eri erilaistumisen vaiheissa ja mahasyövän on vielä selvitetty.

Aikaisemmat tutkimukset koskevat PKM2 ovat keskittyneet tuumorin aineenvaihduntaan ja kasvaimen kasvua. On ollut vain muutamia raportteja kasvainmetastaasit. E-kadheriinin on kriittinen rooli ylläpitämisessä epiteelin eheys, ja menetys E-kadheriinin vaikuttaa liiman ohjelmistoon solun [8]. Aiemmat tutkimukset [9] in vitro ovat osoittaneet, että menetys E-kadheriinin ihmisen sinoomasolulinjoja liittyy huono erilaistumista ja fibroblastit morfologia. EGF-riippuvaista aktivoitumista EGFR on raportoitu inhiboida E-kadheriinin tartunta-riippuvaisella tavalla, joka estää ligandista riippuvan aktivaation erilaisia ​​reseptorityrosiinikinaaseja [10]. Tutkimus osoitti, että pudotus on PKM2 vähentynyt aktiivisuus E-kadheriinin ja parannettu EGF /EGFR signalointireitin solulinjoissa BGC823 ja SGC7901, jotka olivat positiivisia E-kadheriinin ilmentymisen. Kuitenkin erilaistumaton mahakarsinoo- solulinjaa AGS, josta puuttuu E-kadheriinin ilmentymisen, PKM2 edistänyt solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia toiminnan selvittämiseen ja mekanismi PKM2 osalta soluliikkuvuus sisään eri eriytetty solulinjoissa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely, ehdot ja transfektio

ihmisen mahalaukun syövän solulinjat BGC823 (huonosti eriytetty, mukaan palveluntarjoajan) ja SGC7901 (kohtalaisen eriytetty) viljeltiin RPMI 1640 -elatusaineessa (HyClone, Logan, UT, USA). AGS solulinja (eriyttämätön) viljeltiin F12K väliaineessa. Kaikki solut viljeltiin alustassa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Gibco, Detroit, MI, USA) ja 100 IU /ml penisilliiniä-streptomysiiniä, 37 ° C: ssa, 5% CO _{2 kosteutetussa ilmakehässä. Ihmisen mahalaukun syövän solulinja AGS tilattiin American Type Culture Collection (ATCC, USA), ja ihmisen mahasyövän solulinjoissa SGC7901 ja BGC823 saatiin Kiinasta Centre for Type Culture Collection (Shanghai, Kiina). SGC7901, BGC823 ja AGS-solut transfektoitiin siPKM2 (pcPUR + U6-siPKM2) tai PU6 (pcPUR + U6-siRenilla) plasmidi käyttämällä FuGENE HD (Roche, Indianapolis, IN). Puromysiinin (0,1 ug /ml) käytettiin seulomaan stabiilisti transfektoidut kloonit. Ekspression PKM2 proteiinia tutkittiin Western blot-analyysi käyttäen vasta-ainetta vastaan ​​PKM2 vahvistaa kykyä konstruktien estää kohdegeenin ilmentymisen; nämä kokeet toistettiin kolme kertaa. Soluviljelmät valmistettiin lepotilassa kasvattamalla niitä konfluenssiin, ja väliaine korvattiin tuoreella alustalla, joka sisälsi 0,5% seerumia, 1 päivä. EGF 100 ng /ml lopullinen konsentraatio käytettiin solujen stimulaatio. EGF saatiin Cell Signaling Technology.}

Stable knockdovvn PKM2 ja yli-ilmentyminen PKM2

plasmidi, joka sisältää RNA-interferenssi-sekvenssi, joka kohdistaa PKM2 geenin BGC823, SGC7901 ja AGS soluissa oli rakennettu. Sense-oligo varten siPKM2 sekvenssi oli 5'-CACCGCGGCAAGATTTATGTGGAACGTGTGCTGTCCGTTCCACGTAGATCTTGCTGCTTTTT-3 ', ja antisense oligo oli 5'-GCATAAAAAGCAGCAAGATCTACGTGGAACGGACAGCACACGTTCCACATAAATCTTGCCGC-3'. BGC-823, SGC-7901 ja AGS-solut transfektoitiin pcPUR + U6-siPKM2 tai pcPUR + U6-siRenilla (kontrolli) ja valittu puromysiiniresistenttejä klooneja. Western blot -analyysi suoritettiin vahvistamiseksi PKM2 tukahduttaminen. Plasmidi, joka sisälsi PKM2 cDNA-sekvenssi saatiin Invitrogen. BGC-823, SGC-7901 ja AGS-solut transfektoitiin pcDNA6.0-PKM2 tai pcDNA6.0-mock (kontrolli) ja valittu blastisidiini-resistenttejä klooneja. Western blot -analyysi suoritettiin vahvistamaan PKM2 ilmaisua.

Protein Extraction ja Western blot -analyysi

Solut suspendoitiin uudelleen lyysipuskuriin, joka sisälsi proteaasi-inhibiittori cocktail, ja uutettiin proteiinit erotettiin käyttämällä 8-10% SDS-PAGE-geeleillä. p-Tubulin käytettiin latauskontrollina. Vasta-aineita E-kadheriinin ja p-E-kadheriinin saatiin Epitomics. Fosfo-EGFR (Tyr1068), fosfori-PLCγ1 (Tyr783), fosfori-AKT (Ser473), fosfori-Gab1 (Tyr627), fosfori-c-CBL (Tyr700), ja fosfori-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) vasta-aineiden saatiin Cell Signaling Technology.

RNA uuttaminen, käänteistranskriptio ja Real-time PCR

Kokonais-RNA uutettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen, CA, USA). Sitten näytteet käsiteltiin DNaasi 15 min huoneen lämpötilassa, ja RNA puhdistettiin edelleen käyttäen RNA-puhdistus (Qiagen, CA, USA). Käänteisen transkription (RT) reaktio ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi suoritettiin käyttäen käänteistranskriptaasia (Bio-Rad) ja 2 ug kokonais-RNA: ta. Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi suoritettiin ABI 7500 (Applied Biosystems), ja geeni-ilmentymisen tasot kunkin yksittäisen näytteen normalisoitiin GAPDH. Keskimääräinen suhteellinen geenin ilmentyminen määritettiin ja erot laskettiin käyttäen 2 ^{-ΔΔCt menetelmä agaroosigeelielektroforeesilla. RT-PCR-aluke sekvenssejä, olivat seuraavat: sense 5'TGTGGGAATCCGACGAATG-3 'ja antisense 5'GTCATATGGTGGAGCTGTGGG-3' N-kadheriini; sense 5'- CGGGAATGCAGTTGAGGATC-3 'ja antisense 5'AGGATGGTGTAAGCGATGGC-3' E-kadheriinin; sense 5'- TGTATGGGGAACTGCTGACA-3 'ja antisense 5'GCGTTCATCCTCATCGAAGT-3' varten MMP7; sense 5'CGACAGTCAGCCGCATCTT-3 'ja antisense 5'-CCCCATGGTGTCTGAGCG-3' GAPDH.}

proliferaatiomääritystä

Solujen proliferaatio mitattiin käyttäen Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kamimashiki -gun, Kumamoto, Japani) mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, solut siirrostettiin neljä 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 2 x 10 ^{3 solua /kuoppa. Yksi levy otettiin ulos samaan aikaan joka päivä sen jälkeen, kun solut olivat tarttuneet kuoppiin. Absorbanssi mitattiin mikrolevylukijalla aallonpituudella 450 nm. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena.}

TranswellTM Invasion ja haavan paraneminen Analyysit

siirtokuoppaan invaasio määritykset suoritettiin 8,0-um huokosia inserttejä 24-kuoppaisen transwell levylle. Tyvikalvon hydratoitiin 500 ui seerumitonta RPMI 1640 tai F12K väliaineen 30 min ennen käyttöä. Sillä invaasiomääritys, mahasyövän solulinjat lisättiin ylempään kammioon on siirtokuoppaan 0,5 mg /ml kollageenia tyyppi l (BD Bioscience, San Jose, CA) -pinnoitettu suodattimia. RPMI 1640 tai F12K väliaineessa, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia ja 1% kutakin antibioottia lisättiin alempaan kammioon. BGC ja 7901 soluja inkuboitiin 36 tuntia. AGS: soluja inkuboitiin 24 tunnin ajan. Hyökkääviä solut kvantitoitiin jälkeen Gentian violetti värjäys. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja tiedot ilmaistiin keskiarvoina. Arpeutumisprosessit Määritys suoritettiin 6-kuoppaisille levyille. Kasvainsoluihin, joka sisälsi 10% FBS: ää ympättiin 6-kuoppaisille levyille (Corning, CA). Soluviljelmät valmistettiin lepotilassa kasvattamalla niitä konfluenssiin, ja väliaine korvattiin tuoreella alustalla, joka sisälsi 0,5% seerumia, 1 päivä. Haavojen yksikerroksista tehtiin steriilillä pipetinkärjet. Sitten EGF: n kanssa 100 ng /ml lopullinen konsentraatio käytettiin solujen stimulaatio. Sitten solut pestiin PBS: llä ja päivitetään kanssa, joka sisälsi 10% FBS: ää. Valokuvat otettiin 0 ja 24 tuntia. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena.

Ethics lausunto

Tutkimus hyväksyi eettinen komitea (nro: 20081012) Zhongshanin sairaalan sidoksissa Xiamen University, Xiamen, Fujian, Kiina, ja saimme kirjallinen suostumus lausunnot kaikkien osapuolten mukana tässä tutkimuksessa.

valmistaminen kudosnäytteiden

Kasvaimen kudosnäytteiden kerättiin 15 eri mahasyöpä potilailla, joille tehtiin parantava resektion Zhongshanin sairaala, Xiamen University, Xiamen, Kiina. Itsenäinen sarja, joka vastaa vierekkäisten noncancerous kudosten 15 samoista potilaista kerättiin samanaikaisesti. Kaikki kudosnäytteet otettiin talteen ja jaetaan kahteen osaan heti tuumorin resektion. Yksi osa kerättiin nestetyppeen ja säilytettiin -80 ° C: ssa, kunnes RNA: n ja proteiinin uuttamalla. Toinen osa fiksoitiin 4% formaldehydiä ja upotettiin parafiiniin histologista analyysiä (hematoksyliinillä eosiinilla ja IHC värjäytyminen). Kaikki näytteet varmistettiin patologinen diagnoosi (histopatologisen diagnoosi perustui WHO: n kriteerien). Kaikki kokeelliset tapaukset ryhmiteltiin sopimuksella-kaan International Union Against Cancer Kasvain-Node-Metastasis (TNM) pysähdyspaikan järjestelmä (uudistettu 2002).

immunohistokemia

Neljän mikronin paksuinen parafiinileikkeillä oli joko värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H &E), tai analysoitiin PKM2, p-ERK1 /2 ja E-kadheriinin ilmentymisen immunohistokemiallisesti. Immunohistokemia suoritettiin menetelmien mukaisesti, jotka olivat valmistajan suosittelemia. Reaktiot tehtiin näkyviksi käyttämällä diaminobentsidiiniä kromogeenisen substraatin. Leikkeet vastavärjättiin käyttäen hematoksyliinillä ja sitten tyhjennetään ja asennettu. Keskimääräinen tiheys (IOD /alue) havaittiin eri positiivinen alueilla 15 ihmisen mahasyövän yksilöt Image-Pro Plus ohjelmisto.

TILASTOANALYYSI

Tilastolliset analyysit tehtiin SPSS v13. 0 (SPSS, Inc.) ohjelmiston. The Independent-Samples T Test ja korrelaatioanalyysiä käytettiin vertaamaan tietoja. Kaikki arvot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD. Erot katsottiin tilastollisesti merkitsevä P
< 0,05.

Tulokset

ehtyminen PKM2 mainosvideosuosituksia Cell Migration and Invasion BGC823 ja SGC7901 solut sisältävät EGF Stimulation

ilmentymisen PKM2 proteiinin mahasyövän solulinjoissa BGC823, SGC7901 ja AGS arvioitiin käyttäen Western blot-analyysi. Nämä solulinjat osoittivat korkeaa PKM2 ilmentymisen. Sitten vakaa mahasyövän solulinjoja, joilla on muuttunut PKM2 ilmaus perustettiin käyttäen RNA-interferenssi (PKM2 Knockdown) on BGC823, SGC7901 ja AGS soluja. Kuten on esitetty kuviossa. 1A BGC823, SGC7901 ja AGS solulinjoissa PKM2 pudotus perustettiin. Havaitsimme, että proliferaatio väheni BGC823 ja AGS solujen jälkeen PKM2 oli tyhjentynyt (Fig. 1 B). Nämä tulokset ovat yhtäpitäviä aiempien tutkimusten kanssa.

vaikutuksen tutkimiseksi PKM2 solun muuttoliikettä ja invaasiota, käytimme vakiintunut haavan paranemista ja siirtokuoppaan määrityksiä luonnehtia soluliikkuvuus vasteen BGC823 ja SGC7901 solujen . Konfluentin kerros soluja inkuboitiin ensin yön yli väliaineessa, naarmu haava otettiin käyttöön, alustaa, joka sisälsi sopivin annos EGF (100 ng /ml) lisättiin stimuloida muuttoliike sekä prosenttiosuus haavan sulkemista havaittiin 24 tunnin kuluttua ( Kuva S1). Tunkeutuvat solut kvantitoitiin 36 tuntia sen jälkeen, kun EGF: ää (100 ng /ml) lisättiin alempaan kammioon. Tulokset osoittavat, että hoito BGC823-sipk ja SGC7901-sipk solujen EGF jälkeen naarmu haava ja siirtokuoppaan huomattavasti haavan paranemista (Fig. 1 C, D) ja hyökkäys (Kuva. 1 E, F) verrataan kontrollisoluihin.

ehtyminen PKM2 Vähentynyt E-kadheriinin ilmentyminen ja tehostettu toiminnasta EGR /EGFR Loppupään signalointipolkujen PLC-γ1 ja ERK1 /2

Tutkiakseen mekanismi muutoksia solujen maahanmuuton ja invaasion jälkeen knockdovvn PKM2, analysoimme ilmaisun jäsenten Ca ^{2 +: sta riippuvainen soluadheesiomolekyylien perheen ja metalloproteinaasien. Olemme havainneet, että E-kadheriinin proteiinin ilmentymisen tasot laskivat BGC823 ja SGC7901 soluja PKM2 ilmentyminen väheni (Fig. 2A).}

taso E-kadheriinin mRNA: ta ja fosforylaation E-kadheriinin määritettiin BGC823 ja SGC7901 solujen PKM2 ehtyminen arvioida, onko havaittu ero E-kadheriinin ilmentymisen tapahtui esi- tai translaation jälkeen. Havaitsimme alas-säätely E-kadheriinin mRNA ja fosforylaatio lisääntyy, joka indusoi endosytoosin E-kadheriinin, in PKM2-köyhdytettyä soluja (Fig. 2A, B). Olemme myös havainneet, että ilmentymisen taso N-kadheriinin proteiini lisääntyi BGC823 ja SGC7901 solulinjoissa, kun PKM2 oli kulunut loppuun (Fig. 2A).

Solujen migraation ja invaasion pitkälti säädellä EGFR toimintaa. Analysoida, EGFR osallistuu maahanmuutto- ja hyökkäys BGC823 ja SGC7901 soluja, nämä solut käsiteltiin EGF, joka sitoutuu EGFR ja aktivoi alavirran signalointireittejä. EGR-hoito johti fosforylaatio EGFR ja myöhemmin aktivoinnin PLCγ1, AKT ja ERK1 /2 väyliä (Fig. 2C). Huomasimme, että PLC γ1 oli korkeampi aktiivisuus PKM2-köyhdytettyä soluissa kuin YK-köyhdytettyä solujen jälkeen joko lyhyt tai pitkä (24 h) inkubointi EGF. Kuitenkin, ei ollut merkittävä ero AKT-vaikutusta välillä PKM2 vaje solujen ja un-köyhdytettyä soluissa. PLCγ on keskeinen säätelijä solumigraation alavirtaan RTK signaloinnin [11]. Fosforylaatio tyrosiinitähde 783 PLCγ1 on kriittinen sen aktivointi [12]. PLCγ1 aktivointi tehostettu solun liikkuvuus, ja tämä vaikutus havaittiin haavan naarmu ja siirtokuoppaan määritykset, kuten havaitaan kuviossa. 1C.

vieressä tutkittiin vaikutusta EGFR-ligandin ilmentymistä MMP käyttäen RT-PCR: llä BGC823-sipk ja SGC7901-sipk soluissa verrattuna niiden kontrollisoluihin. Hoito EGFR ligandin, EGF, parannettu ilmaisu MMP tasolla transkription BGC823 ja SGC7901 soluja. Kuitenkin, ei ollut ilmeisiä eroja ekspressiotasot MMP2 ja MMP9 välillä PKM2-köyhdytetyn soluja ja niiden valvonta-soluja (tietoja ei esitetty). MMP7 ilmentyminen säädellään ylöspäin PKM2-köyhdytettyä solujen EGF hoitoon (Fig. 2D). ERK /MAPK reitit kriittisiä rooleja EGFR ligandin indusoiman MMP7 ilme. Lisäksi ilmeinen lisääntyminen ERK1 /2 vaikutus havaittiin, kun 0 h ja 24 h hoidon EGR PKM2-köyhdytettyä soluissa.

ehtyminen PKM2 Heikennettyä motiliteettia AGS Solut ja toiminnalliset muutokset Pelastettuaan PKM2 mahasyövän Cell Lines

ilmentyminen E-kadheriinin proteiinin mahasyövän solulinjoissa BGC823, SGC7901 ja AGS arvioitiin Western blot -analyysillä. BGC823 ja SGC7901 solulinjat ilmentävät E-kadheriinin. Sen sijaan, AGS soluista puuttuu E-kadheriinin ilmentymisen (Fig. 3A).

vaikutuksen tutkimiseksi PKM2 Knockdown solun muuttoliikettä ja hyökkäyksen AGS soluissa, käytimme vakiintunut haavan paranemista ja transwell määrityksissä luonnehtivat solun liikkuvuus. Konfluentin kerros soluja inkuboitiin ensin yön yli väliaineessa, haavan naarmu otettiin käyttöön, alustaa, joka sisälsi EGF (100 ng /ml) lisättiin stimuloida muuttoliike sekä prosenttiosuus haavan sulkemista havaittiin 24 tunnin kuluttua. Tunkeutuvat solut transwell määrityksessä määrä määritettiin 24 tunnin kuluttua EGF: ää (100 ng /ml) lisättiin alempaan kammioon. Yllätykseksemme huomasimme, että hoito AGS-sipk solujen EGF jälkeen haava naarmu ja siirtokuoppaan merkittävästi vähensi haavan sulkemista ja hyökkäyksen verrataan ohjausyksikön solujen (Fig. 3B, C). Oli näkyvästi eroja BGC823 /SGC7901 ja AGS soluja.

havainnollistamiseksi edelleen roolia PKM2 solun liikkuvuudessa, teimme PKM2 pelastamiseen kokeissa. Me taked stabiilisti transfektoitu menetelmää käyttäen yli-ekspressioplasmidivektoriin pcDNA6.0-mock ja pcDNA6.0-PKM2 käsittelemään BGC823 ja AGS soluja, jotka vakaa knockdown PKM2. Ilmaisu p-EGFR, E-kadheriinin näkyivät PKM2 pelastamiseen kokeita (Fig. 3d). Havaitsimme, että kun PKM2 ilmaisu talteen, fosforylaatio EGFR on pienentynyt huomattavasti BGC823 soluissa ja lisääntynyt AGS-soluissa. Lisäksi soluliikkuvuus on BGC823 solujen vähentynyt ja AGS solut laski jälkeen PKM2 pelastamiseen (Fig. 3E). Selventää mekanismia näiden erojen, me analysoitiin aktiivisuus EGF /EGFR-signalointireitin.

PKM2 Tehostettu toiminnasta EGR /EGFR Downstream signaalireaktioteissä AGS Solut ja korreloi ERK Aktiivisuus Mahalaukun syöpä näytteet

analysoida, EGFR voi olla mukana migraation ja invaasion AGS solujen, nämä solut käsiteltiin EGF, joka sitoutuu EGFR ja aktivoi alavirran signalointireittejä. EGF-hoito johti fosforylaatio EGFR ja myöhemmin aktivoitumisen loppupään EGFR reittejä, mukaan lukien PLCγ1 ja ERK1 /2 väyliä (Fig. 4A). Huomasimme, että toiminta PLCγ1 ja ERK1 /2 oli suurempaa soluissa, joissa PKM2 ei tyhjentynyt kuin PKM2-köyhdytettyä solujen jälkeen joko lyhyt tai pitkä (24 h) inkubointi EGF. Tämä tulos on päinvastainen kuin mitä oli havaittu BGC823 ja SGC7901 soluja; in AGS soluissa, PKM2 tuli pelata kannustimena ja edistää solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Me tutkimme seuraavaksi MMP7 ilmaisua käyttäen RT-PCR AGS-sipk solujen ja ohjaus soluja. Hoito EGF parannettu MMP7 ilmentymisen tasolla transkription AGS-pu6 soluissa, mutta ei AGS-sipk solut (Fig. 4B). Aktiivisuus ERK1 /2 oli ilmeisesti suurempi AGS-pu6 soluissa verrattuna AGS-sipk solujen jälkeen 0 h ja 24 h hoito EGF (Fig. 4A).

Seuraava suoritettu immunohistokemiallinen (IHC) analyysien tutkia E-kadheriinin ilmentymisen, PKM2 lokalisointi ja ERK1 /2 fosforylaatiota leikesarjojen 15 ihmisen mahasyövän näytteitä käyttäen vasta-aineita validoitu erityispiirteet. Kuvio 4C esittää, että tasot E-kadheriinin ilmentymisen, ERK1 /2-fosforylaation, ja sytoplasminen PKM2 ilmentyminen korreloi toistensa kanssa. Lisäksi havaitsimme korkea ERK1 /2-fosforylaation tumassa syöpäsoluja E-kadheriinin ilmentymisen. Alueilla ERK1 /2 fosforylaation, löysimme myös korkeampia PKM2 ilmaisua. Emme kuitenkaan ei löytänyt fosforylaatiota ERK1 /2 alueilla positiivinen E-kadheriinin ilmentymisen (Fig. 4C). Korrelaatio analyysi keskuudessa PKM2, E-kadheriinin ja P-ERK1 /2 suoritettiin käyttäen Image-Pro Plus ohjelmisto (Fig. 4D). Keskimääräinen tiheys (IOD /alue) äänitettiin eri positiivinen alueilla 15 ihmisen mahasyövän yksilöitä. Löysimme merkittävä korrelaatio PKM2 ja E-kadheriinin in E-kadheriinin-positiivisia alueita. Lisäksi oli merkittävä korrelaatio PKM2 ja p-ERK1 /2 in E-kadheriinin-negatiivisia alueita.

Keskustelu

invasiivisen ja metastaattisen vaiheen syövän etenemisen korreloi huonon kliinisen ennustetta ja edustaa kaikkein valtava este onnistuneen hoidon. Soluliikkuvuus ja invasiivisuus ovat tunnuspiirteistä pahanlaatuisia kasvaimia, jotka mahdollistavat kasvainsolut kulkeutumaan viereisiin kudoksiin tai rajoittamalla tyvikalvoissa ja matriiseina. Solun liikkuvuus tarvitaan fysiologisten prosessien haavan paranemisen ja organogeneesin ja patologisen prosessin tuumori-invaasio [13]. Invasiivisia kasvainsolut on tunnusomaista väärin säädeltyyn solujen liikkuvuuteen vasteena solunulkoisten signaalien kasvutekijöiden ja sytokiinien. Ihmisen kasvaimet ilmentävät korkeita kasvutekijöiden ja niiden reseptorien, ja monenlaisia ​​pahanlaatuisten solujen näyttävät osoittavan autocrine- tai parakriiniseen-stimuloidun kasvun. Niistä kaikkein hyvin tutkittu kasvutekijä reseptori järjestelmissä on EGF-reseptorin perhe [14]. Signaalit solunulkoiseen ympäristöön sanella solun liikkuvuus. Monet kasvutekijöitä, mukaan lukien ligandit, jotka toimivat läpi epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR), parantaa solun liikkuvuus [15]. Vähintään kaksi erillistä solunsisäiset signaalireitit tarvitaan EGFR-välitteisen solun liikkuvuus: reitit käyttäen PLC γ ja MAP-kinaasin kautta. PLC γ-aktiivisuuden on parantaa solun liikkuvuus kautta liikkeelle aktiini-muuttamalla proteiinien inaktiivinen kalvoon liittyvä lokalisointi aktiiviseen osa-kalvo solun tukirangan maa [16]. Erk MAP-kinaasien välittävät signaaleja tumaan sekä signaalit, jotka säätelevät solujen matriisi yhteyksiä.

kadheriineja käsittävät suuren perheen solu-solu-adheesion molekyylejä, jotka sisältävät klassisen, desmosomien, ja epätyypilliset kadheriineja. E-kadheriinin, joka ilmentyy pääasiallisesti epiteelisoluissa, on adheesioproteiini, joka koodaa CDH1 geeni ja joka toimii useita prosesseja, mukaan lukien kehitys, kudoksen eheyden, solumigraatio, morfologia, ja napaisuuden [17], [18], [19]. E-kadheriinin on myös tuumorisuppressorina jonka ilmentymistä usein vähennetään tai vaiennettu, ja sen uudelleen ilmentyminen voi aiheuttaa morfologisia palautuvaa [20], [21]. EGF-riippuvaista aktivoitumista EGFR on raportoitu inhiboida E-kadheriinin tartunta-riippuvaisella tavalla, joka estää ligandista riippuvan aktivaation erilaisia ​​reseptorityrosiinikinaaseja. N-kadheriinin, koska hyökkäys promoottori, usein upregulated. Ilmaisu N-kadheriinin epiteelisoluissa indusoi muutoksia morfologia fibroblastisella fenotyypin, mikä tekee solujen enemmän liikkuvaksi ja invasiivisia. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että syöpäsolut ovat säädelty N-kadheriinin lisäksi menetys E-kadheriinin. Tämä muutos kadheriiniekspressiota kutsutaan "kadheriinin kytkin".

Havaitsimme alas-säätely E-kadheriinin mRNA ja fosforylaatio lisääntyy, joka indusoi endosytoosin E-kadheriinin, in PKM2-köyhdytettyä soluissa. Olemme myös havainneet, että N-kadheriinin ekspressiotaso lisääntyi vuonna BGC823 solulinjassa kun PKM2 oli tyhjentynyt. Knockdovvn PKM2 edistetään solumigraation ja hyökkäyksen BGC823 ja SGC7901 solujen EGF stimulaatiota. Lisääntynyttä aktiivisuus EGFR on kriittinen tekijä määritettäessä solun liikkuvuus ja invaasiokyvyssä BGC823 ja SGC7901 soluja. Oletimme, että alas-säätely E-kadheriinin ilmentymisen tehostettu fosforylaation EGFR ja aktivoitu loppupään signalointireittejä, jotka sisältävät PLCγ1 ja ERK1 /2. PLC γ aktivointi parantaa solun liikkuvuus, ja ERK1 /2 aktiivisuus on keskeisessä asemassa MMP7 ilme.

Matrix (MMP) ovat sekaantuneet syövän eteneminen ja metastaasit, koska niiden soluväliaineen (ECM) -proteolytic aktiivisuus [22]. MMP-7 on raportoitu tuottaa mahalaukun karsinooma solujen ja liittyy merkittävästi aggressiivinen patologiset fenotyypit mahasyövän [23]. MMP-7 voi aktivoida pro-MMP-1, on vahva stromelysiinin kaltainen aktiivisuus ja heikentää liukenematonta elastiinia tyypin IV kollageeni, laminiini-1, fibronektiini, proteoglykaanien ja liivatteen [24]. ERK /MAPK reitit kriittisiä rooleja EGF aiheuttaman MMP7 ilmaisun [25].

E-kadheriinin on solu-adheesion glykoproteiinin tunnettu ensimmäistä kertaa ihmisen solulinjoissa Shimoyama et al [26]. Sen tehtävä mahasyövässä kehityksen määritteli ensimmäisenä Guilford ym [27]. On huomattava korrelaatio E-kadheriinin ilmentymisen ja luokan kasvaimen erilaistumista, sekä histologinen tyyppi mukaan Laurén ja WHO luokituksia. Potilaat, joilla on E-kadheriinin-positiiviset kasvaimet ovat merkittävästi paremmat 3- ja 5-vuoden eloonjäämisluvut kuin potilailla, joilla on E-kadheriinin-syöpäkasvain [28]. Perinnöllinen diffuusi mahasyövän (HDGC) on harvinainen autosomaalinen dominantti oireyhtymä, joka johtuu suurelta osin ituradan mutaatioita ja deleetioita CDH1 geeni liittyy iällä, histologisesti hajanainen, sinettisormus-rengas solutyyppiä mahasyövän [29], [30].

Lim JY et ai raportoi, että PKM2 ilmentyminen korreloi voimakkaasti mahasyövän erilaistumista. Eriytetyn syöpätyypit ilmaista enemmän PKM2 proteiinia kuin erilaistumattoman tyyppejä; Sitä vastoin korkeamman PKM2 ilmentyminen korreloi lyhyempi eloonjäämisaste riippumattomia vaiheessa signet-rengas solu syöpiä. PKM2 ilme saattaisi olla haitallinen ennustetekijä varten sinettisormus-rengas solukarsinoomat, joista puuttuu E-kadheriinin [7]. Nämä tulokset ovat sopusoinnussa tutkimuksemme mahasyövän soluissa. BGC-823, SGC-7901 ja AGS solulinjat ovat eri eriytetty tyyppejä. E-kadheriinin ilmentymisen olemassa SGC-7901 ja BGC-823 solulinjoissa; sen sijaan, AGS solut, jotka ovat peräisin pahanlaatuista mahalaukun adenokarsinooman kudoksen ja ei ole E-kadheriinin-välitteisen soluadheesion [31]. Havaitsimme, että knockdovvn PKM2 edisti muuttoliike ja hyökkäyksen SGC-7901 ja BGC-823 solulinjoissa mutta esti näiden ominaisuuksien AGS solulinjassa. Toinen ryhmä on ilmoittanut, että pyruvaattikinaasia tyyppi M2 ylössäädellään kolorektaalisyövässä ja knockdovvn PKM2 tukahdutetaan leviämisen ja migraatio paksusuolensyöpä RKO-solujen [32]. Tiedämme, että RKO soluista puuttuu ilmentymistä E-kadheriinin [33]. Immunohistokemiallista (IHC) analyysi osoittaa, että tasot E-kadheriinin ilmentymisen, ERK1 /2-fosforylaation, ja sytoplasminen PKM2 ilmentyminen korreloi toistensa kanssa. Löysimme korkeatasoinen ERK1 /2 fosforylaation tumassa syöpäsolujen ilman E-kadheriinin ilmentymisen mutta korkeatasoinen PKM2 ilmaisua.

Hypoteesimme että PKM2 vaimentaa solun liikkuvuus ja invaasio, kun E-kadheriinin on esittää. Tämä uusi toiminto PKM2 voi olla merkitystä palautuva estyminen solun liikkuvuus ja hyökkäyksen alkuvaiheessa mahasyövän kun solut ovat positiivisia E-kadheriinin ilmentymisen. Etenemisen aikana kasvaimen, puute tai hyvin alhainen ilmentyminen E-kadheriinin indusoi aggressiivinen toiminto PKM2 kasvain. Biologisen roolin PKM2 kehittämisessä näiden kasvainten on edelleen selvittämättä.

tukeminen Information
Kuva S1.
ilmentyminen EGFR-proteiinin mahalaukun syövän solulinjat BGC823, SGC7901 ja AGS arvioitiin käyttäen Western blot-analyysi. AGS solut osoittivat korkeampaa EGFR kuin kaksi muuta solulinjat. Ei ole mitään merkittävää eroa BGC823 ja SGC7901 soluja (kuvio S1A). BGC-pu6 solujen ja BGC-sipk soluja käsiteltiin eri annoksilla EGF. 40 minuutin kuluttua havaitsimme tason fosforylaatio EGFR. Löysimme korkein fosforylaation annoksen 100 ng /ml (kuvio S1B). Siksi päätimme annos 100 ng /ml sopivin ehdokas. Transvvell- koe osoitti myös vahvempi kyky tunkeutua martrigel vuonna BGC823 soluissa (kuvio S1C).
Doi: 10,1371 /journal.pone.0067542.s001
(TIF) B

• PLoS ONE: geneettisiä variantteja in epidermaalisen kasvutekijän reseptori Pathway Geenit ja vaara Ruokatorven Okasolusyöpä ja mahasyövän kiinalainen Population
• PLoS ONE: Small Molecule R1498 niin hyvin siedetty ja oraalisesti aktiivinen kinaasiestäjän maksasyövän ja mahasyövän Treatment kautta Targeting Angiogeneesi ja Mitosis Pathways