PLoS ONE: Small Molecule R1498 niin hyvin siedetty ja oraalisesti aktiivinen kinaasiestäjän maksasyövän ja mahasyövän Treatment kautta Targeting Angiogeneesi ja Mitosis Pathways

tiivistelmä

Proteiinikinaasit tärkeitä rooleja kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen. Paljon estäjät ovat tehneet markkinoille ja lupaavia kliinisiä hyötyjä. Kirjoittajat raportoivat löytö uusi pienimolekyylisiä, hyvin siedetty, oraalisesti vaikuttava estäjät, R1498, majorly kohteena sekä angiogeenisten ja mitoosi väyliä hoitoon maksasolusyövän (HCC) ja mahasyövän (GC). Sarja biokemiallisten ja soluihin perustuvissa määrityksissä osoitti, että tavoite kinaasi klusterin R1498 mukana Aurora-kinaasien ja VEGFR2 et al. R1498 esti kohtalaisesti in vitro
kasvun estäminen paneelissa kasvainsolujen kanssa IC 50 mikromoolin alue. in vivo
antituumoriteholla of R1498 arvioitiin paneeli GC ja HCC vierassiirrännäiset rinnakkain verrattuna toiseen multikinaasi estäjä sorafenibi. R1498 osoittautui teholtaan ja toksisuusprofiili yli sorafenibi kaikissa testimallien kanssa > 80% kasvaimen kasvun esto ja kasvaimen regressio joissakin xenogratfts. Terapeuttinen potentiaali R1498 tuli esille myös sen tehokkuudesta kolmen ihmisen GC primaarikasvaimen johdettu ksenograftimalleja 10-30% kasvaimen regressionopeuden. R1498 osoitettiin aktiivisesti estävän Aurora aktiviteetti in vivo
, ja vähentää verisuonten muodostumista kasvaimissa. Lisäksi R1498 esitti hyvää in vivo
altistumisen ja terapeuttinen ikkuna farmakokineettisen ja annosalueen löytämiseksi tutkimuksissa. Opinnäytetyöt todisteet osoittavat, että R1498 on voimakas, hyvin siedetty, oraalisesti vaikuttava multitarget estäjä ainutlaatuisen antiangiogeeninen ja antiproliferatiivinen profiilin, ja antaa vahvan luottamuksen jatkokehitykseen HCC ja GC terapia.

Citation: Zhang C, Wu X, Zhang M, Zhu L, Zhao R, Xu K, et al. (2013) pieni molekyyli R1498 niin hyvin siedetty ja oraalisesti aktiivinen kinaasiestäjän maksasyövän ja mahasyövän Treatment kautta Targeting Angiogeneesi ja Mitosis Pathways. PLoS ONE 8 (6): e65264. doi: 10,1371 /journal.pone.0065264

Editor: Claude Prigent, Institut de Génétique et Développement de Rennes, France

vastaanotettu: 22 helmikuu 2013; Hyväksytty 23. huhtikuuta 2013 Julkaistu: 05 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: rahoittajien ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kaikki kirjoittajat ovat työntekijöitä tai entisten työntekijöiden Roche R &D Center (Kiina) paitsi Taiping Chen , joka on työntekijä CRO yritys nimeltä Crown Bioscience Inc. Peking, Kiina. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Proteiinikinaasit toimia kohteina terapeuttiselle interventiolle syövät, joka on validoitu ja todistaa menestyksekäs ja laaja soveltaminen proteiinikinaasiestäjinä useita syöpiä, joko yksin tai yhdessä hoito. Koska heterogeeninen taudin aiheuttama kertyviä monen geenimutaatioita sijaan ohjaa yksi kinaasin mutantti, syöpiä, jotka pätevät vaste Monoterapiassa ovat hyvin rajalliset. Lisäksi hankittu resistenssi kasvaimia auttamaan itseään nopeasti kiertää kemoterapiasta, sitten taudin uusiutumiseen. Monimutkainen poikkeava signalointia syövissä houkuttelee kehittämään strategioita, jotka kohdistuvat useisiin biologisia reittejä merkityksellisiä tuumoribiologiassa kuten leviämisen, etäpesäkkeiden ja anti-apoptoosin. Yksi strategia edellyttää rationaalisen lääkkeen yhdistelmiä. Esimerkiksi yhdistelmä VEGF suunnattu monoklonaalinen vasta-aine tavanomaisen kemoterapian on osoittanut merkittävän säilymisen etu rinta-, paksusuoli-, ja keuhkojen syövät [1]. Toinen strategia on kehittää yhdisteitä, jotka kattavat useita mekanismeja monoterapiana. Tällä lähestymistavalla on useita mahdollisia etuja verrattuna yhdistelmä strategioita, kuten yksinkertaisuus kehityspolkua, nopeus markkinoille, ja vähemmän päällekkäisyyttä sivuvaikutuksia. Tällä hetkellä multikinaasi estäjä sorafenibi käytetään ensilinjan hoitona pitkälle ja metastaattisen HCC kanssa parantaminen Keskimääräinen elinaika 7,9 kk (lumeryhmässä) ja 10,7 kuukautta [2]. Kuitenkin sorafenibihoidon johtaa tilastollisesti merkitsevä, mutta kliinisesti lievä, parannuksia kokonaiselinaika, aika taudin etenemiseen ja tautien torjuntaan korko [3]. Samaan aikaan perinteinen sisplatiini-pohjainen hoito on edelleen laajalti käytetty kliinisissä pitkälle ja metastaattisen GC. HER2 /neu yli-ilmentävät mahan adenokarsinooman trastutsumabi yhdistettynä kemoterapiaan pidentää mediaani kokonaiselinaika 11,1 kk (pelkkää kemoterapiaa) ja 13,8 kuukautta [4]. Vaikka companioned diagnostiset menetelmät on perustettu näytön kohde potilaiden trastutsumabi ei ole aktiivisuutta suuressa potilasryhmässä kätkeminen korkeatasoisen HER2 /neu kanssa aihetta voidaan tunnistaa [5]. Kun otetaan huomioon korkea kuolleisuus HCC ja GC ja nykyinen hoito-rajoitettu lopputulos on vielä valtava lääketieteellinen tarve molemmille syöpätyyppeihin.

Angiogeneesi syöpäsairauksien hoidossa kuten anti-VEGFR-2-vasta-aine, pienet molekyylit vastaan ​​VEGFR -2 signalointi [6], [7], ja VEGFR kimeerinen proteiini [8], on osoittautunut tehokkaaksi strategia hoitoon useiden syöpätyyppien. Lisäksi teho multikinaasi estäjien sunitinibin ja sorafenibi olisi osittain johtua VEGF signaloinnin esto [9]. Kuitenkin useat potilaat ovat luontaisesti resistenttejä tai kehittää vastustuskykyä antiangiogeeninen terapia jälkeen useita hoitojaksoa [10], [11]. Niinpä kliiniset kokeet yhdistämällä angiogeenisten estäjät ja lääkkeet vaihtoehtoisia vaikutusmekanismi odotetaan parantavan tehoa tai voittaa vastustuskyvyn antiangiogeenisen hoitoon [12]. Se on laajalti tunnustettu, että yliekspressio aurora kinaasien erilaisissa syövissä on mukana prosessissa tumorigeneesin [13], [14]. Aurora estäjä VX-680 kykeni tehokkaasti estää syöpäsolujen kasvua in vitro
ja in vivo
, ja sen jälkeen tuli kliinisissä tutkimuksissa, mikä viittaa siihen, että Aurora-kinaasit ovat druggable tavoitteet [15] .

Kun otetaan huomioon kertyviä todisteita angiogeneesin ja Aurora-kinaasien syövän ja niiden terapeuttiset arvot todistettu biologisten ja pienmolekyylisalpaajien, huomasimme estäjä, R1498, joka vaikuttaa huomattavasti keskeiset reitit angiogeneesin ja mitoosin. R1498 on ainutlaatuinen kinaasi estoprofiili, voimakas ja hyvä farmakokineettiset ja toksikokineettiset profiilit, kaikki nämä tukevat tuotteen kliinistä jatkokehitystä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Käyttö ja hoito Koe-eläinten hyväksyi Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC), Roche R &D Center (Kiina). Crown Bioscience, CRO palveluyritys sitoutunut suojelemaan potilaiden yksityisyyttä ja noudattaa kaikkia eettiset periaatteet potilaan johdettuja materiaaleja, kerätään juuri hävittää ihmisen kasvainnäytteestä, jossa IRB (paikallisen sairaalan vastaava komitea) hyväksyntä ja potilaan suostumusta koskevat vaatimukset. Kaikki solulinjat hankittiin ATCC, USA, tai Shanghai Institutes of biokemian ja solubiologian, kiinalainen Academy of Science.

yhdisteet

R1498 (puhtaus > 98%) syntetisoitiin Roche R &; D Center (Kiina). Entsymaattista määrityksiä ja in vitro
soluun perustuvissa määrityksissä, R1498 liuotettiin DMSO: 0,01 mol /l kantaliuosta. Sillä Eläinkokeissa R1498 liuotettiin 1% Klucel EF /0,1% polysorbaatti 80 /0,09% metyyliparabeeni /0,01% propyyliparabeeni vettä, valmistettiin viikoittain. Sorafenibi syntetisoitiin Roche R &D Center (Kiina) ja liuotetaan Cremophor EL /etanoli (50:50, Sigma) valmistella 5 mg /ml kantaliuosta, käärityn ja säilytetään huoneenlämmössä. Tämä kantaliuos valmistettiin tuoreena joka 3 päivä. Lopullinen annostelun liuokset valmistettiin päivänä käyttöä laimentamalla kantaliuosta ja steriloitua vettä.

Solulinjat

Kaikki solulinjat American Tyypillinen Collection Center (ATCC) ja Cell pankki, Shanghai Institutes Biokemian ja solubiologian Kiinan tiedeakatemia pidettiin 37 ° C: ssa 5% CO _{2 kosteassa ilmakehässä kasvualustaan ​​suosittelee, että myyjät ja alistettiin in vitro
määrityksissä välillä käytäviä 8~15 solulinjoja eläinten tutkimukset olivat välillä kohtia 5~10. Ihmisen napalaskimon endoteelisolujen (HUVEC) saadun Allcells (Emeryville, CA), pidettiin EGM-2 (LONZA, Allendale, NJ) ja endoteelisolujen kasvun lisäravinteet ja 10% naudan sikiön seerumia (Invitrogen, Carlsbad, CA).}

proliferaatiomääritystä

Kukin solulinja ympättiin 96-kuoppaisella kudosviljelylevyllä (Corning, NY) ennalta määrättyyn tiheys 180 ui täydellisessä elatusaineessa, joka on kiinnitetty yli yön ja käsiteltiin yhdisteellä toisen 72 h. Sitten väliaine heitettiin pois ja korvattiin 10% CCK-8 (Dojindo, Kumamoto, Japani) täydellisessä väliaineessa, sitten inkuboitiin levyjen toiset 2 tuntia. OD _{450 mitattiin SpectraMAX 190 spektrofotometrillä (MDS, Sunnyvale, CA). Tausta absorbanssi OD tyhjä vähennettiin kaikkien kuoppien. Sitten esto (IR) määritettiin seuraavalla kaavalla: IR (%) = (OD DMSO-OD yhdiste) /OD DMSO x 100%.}

VEGF: n indusoimaa HUVEC leviämisen määrityksessä HUVEC suspendoitiin 170 ui EGM-2 0,5% FBS ympättiin ja inkuboitiin yön yli. Sen jälkeen, kun solut on kiinnitetty, 10 ui 1 ug /ml ihmisen rekombinantti-VEGF: ää 165 (R &D Systems, Minneapolis, MN), lisättiin kuhunkin kuoppaan ja 20 ui yhdisteen liuokset valmistettiin EGM-2 0,5% FBS: ää. CCK-8-määritystä käytettiin edellä määrittämiseksi solujen elinkelpoisuuden.

Kinaasimääritykset

affiniteetti R1498 vastaan ​​402 kinaasien määritettiin KINOMEScan® (Ambitin Biosciences, San Diego, CA) ja tiedot esitettiin dissosiaatiovakio (Kd) -arvot [16]. Estyminen kinaasiaktiivisuutta Aurora-kinaasien ja VEGFR2 on lisäksi tunnettu siitä, Z'-Lyte kinaasiaktiivisuuden määrityksissä vastaavassa ATP pitoisuudet.

HUVEC Putken muodostumisen määritys

HUVEC-putken muodostumiseen määritys suoritettiin, kuten on aiemmin on raportoitu [17]. Lyhyesti, Matrigel ™ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ), sulatettiin 4 ° C: ssa 3~4 h. 100 ui nestettä Matrigel ™ lisättiin ennalta jäähdytetty 96-kuoppaiselle kudosviljelylevylle, ja levyä inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO _{2 kostutetussa ilmakehässä 1 h jähmettyä Matrigel ™. HUVEC-solut viljeltiin EGM-2 0,5% FBS yön yli, ja ympätään 90 ul EGM-2 0,5% FBS tiheydellä 2,2 x 10 ^{5 solua /ml Matrigel ™ päällystetty levy. Soluja käsiteltiin yhdisteellä tai vastaava määrä DMSO: ta. Levyä inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO 2 kosteassa ilmakehässä 7 tuntia, sitten solumorfologiaan vangittiin faasikontrastimikroskoopissa (IX71, Olympus, Hampuri, Saksa).}}

Western Blot

Solulysaattia valmistettiin RIPA-puskuriin ja kvantitoida bikinkoniini- happo (BCA) menetelmällä (Pierce, Rockford, IL). Kolmekymmentä mikrogrammaa proteiinia per näyte ladattiin 4~12% NuPAGE® Novex SDS-geelille (Invitrogen). Proteiini siirrettiin jota iBlot® kuivan blottauksella laite (Invitrogen) nitroselluloosakalvoille. Blokkaamisen jälkeen epäspesifinen sitoutuminen TBS /Tween 20: tä (0,1%) (TBS /T), joka sisälsi 5% rasvatonta maitoa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, kaivoa inkuboitiin fosfo-Aurora A (Thr288) (C39D8) kanin monoklonaalista vasta-ainetta ( Cell Signaling Technology, CSTij9, Beverly, MA) tai fosfo-histoni H3 (Ser10) kanin polyklonaalinen vasta-aine (CSTϊ1) (1:1000 TBS /T, joka sisälsi 3% naudan seerumin albumiinia (BSA), ja varovasti sekoitettiin 4 ° C: ssa yön yli. membraani pestiin TBS /T kolme kertaa poistamiseksi sitoutumattoman vasta-aineen ja sitten inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineen (HRP-konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG- tai vuohen anti-kani-IgG, 1:10000, KangChen Biotech, Shanghai, Kiina) 1 h huoneen lämpötilassa, vastaavasti. Proteiiniviivat visualisoitiin parannetun kemiluminesenssin (ECL) (Pierce, Rockford, IL).

Immunofluoresenssi

Solut ympättiin kammioon Levyjä kiinnitettiin 4% paraformaldehydi huoneenlämmössä, sitten läpäiseviksi 0,15% Triton-X100 TBS ja estetty 3% BSA TBS /T. ensisijainen vasta-aineita (fosfori-Aurora A (Thr288) (CSTĵ7), fosfori -Histone H3 (Ser10) (CSTϊ1) ja MPM2 (anti-fosfo-Ser /Thr-Pro) Millipore-368) inkuboitiin levyillä on märkä kammiossa 4 ° C: ssa yön yli. Toissijainen vasta-Alexa Fluor® 488 vuohen anti-kani-IgG (H + L) tai Alexa Fluor® 594 vuohen anti-hiiri-IgG (H + L) (Invitrogen) levitettiin vastaavasti yhden tunnin kuluttua levyt pestiin TBS perusteellisesti. Sen jälkeen, kun sitoutumaton vasta-aineet poistettiin, levyt kuivattiin ja asentaa DAKO antifide kiinnitysväliaine. Kuvat otettiin kiinni kanssa IX71 sopivissa heräte ja emissiosuodattimia.

virtaussytometria

DNA-pitoisuus mitattiin FACS-Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA) ja solukierron jakelu laskettiin kuten aiemmin on kuvattu [18].

tubulin in vitro
polymerointi Pitoisuus

in vitro
tubuliinin polymerisaatiota määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [18 ].

Farmakokinetiikka yhden annoksen (SDPK) tutkimus

käyttö ja hoito koe-eläimen hyväksyi Institutional animal Care ja käyttö komitea, Roche R &D Center (Kiina). Nude-hiiret (kehon paino: 19-24 g) käytettiin SDPK tutkimuksessa. Ennen farmakokineettisessä tutkimuksessa, eläimet satunnaistettiin näytteenottoa ryhmät (3 eläintä aikapistettä kohti). Kymmenen ylimääräisiä hiiriä käytettiin talteen plasman tyhjäksi kalibrointikäyriä. Hiiret pidettiin paastolla yön yli ennen suun kautta.

Verinäytteet kerättiin retro-orbital puncture ennen annosta ja 0,033, 0,083, 0.25,0.5, 1, 2, 4, 6, 8, ja 24 tuntia annoksen jälkeen. Plasmanäytteet ja annos formulaatiota säilytettiin -20 ° C: ssa, kunnes Bioanalysis. Tiedonhankinta- ja ohjausjärjestelmä luotiin käyttämällä Analyst 1.4 ohjelmiston ABI Inc. pitoisuudet plasmassa alle määritysrajan (LOQ = 1 ng /ml) nimettiin nolla. Farmakokineettiset data-analyysi suoritettiin käyttäen noncompartmental analyysi moduuleja WinNonlin Professional v5.2 (Pharsight, USA) kantavassa hyötyosuus laskettiin F (%) = (Dose _{iv × AUC po (0-∞)) /(Annos po × AUC iv (0-∞)) * 100%. Rotan, koirilla ja apinoilla SDPK, verinäytteet kerättiin kaulalaskimosta reikä.}

Vieraslajisiirteen tehotutkimuksen kanssa Cell Lines and Patient Johdetut Kasvaimet

käyttö ja hoito koe-eläimen hyväksyttiin Institutional Animal Care ja käyttö komitea, Roche R &D Center (Kiina). Kasvaimen solut ympättiin oikeaan kylkeen BALB /C nu /nu
female nude-hiiriin (5~6 viikkoa, 16~18 g, saatu Kiinan ja Britannian SIPPR /BK Lab. Animal Ltd, Shanghai, Kiina) optimaalisella tiheys perustuu meidän talon validointitutkimuksessa. Sen jälkeen kun kasvain on perustettu ja saavutettiin 100~150 mm ^{3, hiiret satunnaistettiin kymmenen hiirtä ryhmää kohti ja sai hoitoa aikataulun mukaisesti. Kasvaimen kasvu oli kolme kertaa viikossa mittauksen pituuden (L) ja leveys (W), jonka paksuus, ja lasketaan kasvaimen tilavuus (TV, mm 3) = 0,5 * L * W * W (mm) . Kasvaimen kasvun inhibitio laskettiin TGI,% = (1- (keskimääräinen tuumorin tilavuus hoidon ryhmässä ensimmäisenä päivänä, kasvaimen keskimääräinen tilavuus hoitoryhmässä päähän päivä) /(keskimääräinen kasvaimen tilavuus kontrolliryhmästä ensimmäisen päivä-kasvaimen keskimääräinen tilavuus kontrolliryhmässä päähän päivä)) x 100%. Kasvaimen regressio yksittäisen hiiren määriteltiin - tuumorin tilavuuden lopussa oli pienempi kuin kasvaimen tilavuus, kun hoito aloitettiin.}

Ihmisen primäärisen tuumorin malleja, tuoretta ihmisen mahalaukun tuumorikudokset suoraan istutettiin liikalihava diabeettinen ja sekamuotoinen immuuni-puutosta (NOD-SCID) hiiriin 5 tunnin kuluttua leikkauksen 5 mm ^{3 fragmentteja luomaan ensisijaisen -tuumoriksenografti malleja. Kukin kasvainmuoto varmistettiin ainakin kolme serial in vivo
kohdissa osoittamaan siirteen toimiminen vakauden. Kasvaimet alkaen kohdista 4-7 inokuloitiin subkutaanisesti troakaareja osaksi oikealla kylkiin BALB /C nu /nu-naaraita karvattomia hiiriä (5~6 viikkoa, 16~18 g). Hoito alkoi, kun kasvaimen tilavuuden saavutti 100~150 mm 3. Kasvain mittaus- ja toiminta protokolla oli sama kuin solulinja peräisin kasvain malli.}

immunohistokemia

8 um parafiiniin kasvainkudoksen dioja valmistettu kasvain in vivo
tehoa tutkimukset kuumennettiin kuivassa uunissa 60 ° C: ssa 1 tunnin ajan, sitten poistettiin parafiini ja hydrolysoidaan Leica Autostaineriin XL ST5010 huoneenlämpötilassa. Antigeeni haku suoritettiin 95~99 ° C sitraattipuskurissa (0,01 M, pH 6,0) lämmitetään lääketieteellisen mikroaaltouunissa 92-98 ° C: ssa 5 minuutin ajan, jäähdytettiin sitten huoneen lämpötilaan. Sitten peroksidaasi-estoreagenssia (DAKO, DK-2600, Glostrup Tanska) levitettiin sammuttamiseksi endogeenisen peroksidaasin. Levyjä inkuboitiin estää seerumissa 20 minuuttia, sitten piiriin 100 ui fosfo-Aurora A (Thr288) (C39D8) kanin mAb (CSTij9, 1:200 TBS /T) tai kanin anti-humaani-CD31 polyklonaalista vasta-ainetta ( Santa Cruz Biotech, sc-8306, Santa Cruz, CA, USA; 1:200 TBS /T) 4 ° C: ssa yön yli, sitten inkuboitiin 100 ul DAKO Kuvitella + /HRP, kani /hiiri jälkeen pestiin huolellisesti TBS. Sata mikrolitraa substraattia-kromogeenista liuosta (DAB) levitettiin objektilaseille ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 10 minuuttia. Objektilasit huuhdeltiin varovasti vesijohtovedellä 15 min. Vastavärinä ja dehydraatio suoritettiin XL ST5010 huoneenlämpötilassa. Lopuksi objektilasit peitettiin Per- mountilla kiinnitysväliaine (Fisher Scientific, Miami, FL).

annosalueen löytämiseksi ja Toksikologisen tutkimuksen

annosalueen löytämiseksi ja toksikokineettisessä tutkimus tehtiin rotilla ja Beagle koirat perustuu in vitro
metaboliittien tunnistaminen. Wistar rottia (uros: 3, nainen 3 kussakin ryhmässä, Vital River, Peking, Kiina) pidettiin paastolla yön yli, ja sitten sai testiartikkeleita kuin 0, 6,25, 50 ja 100 mg /kg kaksi kertaa päivässä per letkulla suun kautta varten 14 -päivä jatkuva hoito. Liikkuvuus havainto levitettiin päivittäin pohjalta löytää mahdollisimman suvaitsevainen annosta eläimille. Eläimiä uhrattiin D14, ja seuraavat toksikologian havainto tehtiin myös painon muutokset, kliininen havainto, ruumiinavaus, hematologian kemia ja histopatologia. Päivänä 1 ja päivänä 14, otettiin verinäytteitä kautta kaulasuoni punktio kaikista eläimistä (jos elossa, käyttämällä EDTA-K2 putket). Näytteet sekoitettiin kevyesti ja asetettiin murskattua märän jään saakka sentrifugoimalla, joka suoritettiin välittömästi. Näytteitä sentrifugoitiin noin 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa 2700 rpm. Saatu plasma erotettiin, siirrettiin ainutlaatuisesti merkitty selkeä polypropeenituubeihin jäädytetään välittömästi yli kiinteää hiilidioksidia (hiilihappojäätä), kunnes siirtyi noin -80 ° C: ssa. Kunkin eläimen verta seuraavat ajankohtina: noin 5 min, 15 min, 30 min, 1, 2, 4, 8 ja 24 tunnin kuluttua ensimmäisestä annoksesta on tiettynä päivänä. Lääkkeen pitoisuudet plasmassa määritettiin LC-MS /MS: llä. Farmakokineettinen analyysi suoritettiin käyttäen WinNonlin ohjelmistoa (versio 5.2, Pharsight Corporation, CA, USA), ja farmakokineettiset parametrit laskettiin käyttäen Non-compartmental mallin menetelmää.

Beagle koiria (noin 8-10 kuukautta, alkaen Beijing Marshall Biotekniikka Co Ltd, Peking, Kiina) tehtiin tutkimus edellä kuvattua protokollaa. Jokaisella ryhmällä on yksi uros ja naaras koira, annokset testiaineen olivat: 0, 1, 7,5 ja 15 mg /kg, vastaavasti. Käyttö ja hoito koe-eläimen hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitea, Roche R &D Center (Kiina).

Data Analysis ja tilastot

Independent t-testiä käytettiin jatkuvan datan analyysi, ja χ2 testiä sovellettiin kategorisen datan. Tiedot pidettiin merkittävinä, kun p-arvot olivat < 0,05.

Tulokset

1. Luonnehdinta R1498 kuin multikinaasi-inhibiittori

Pyrazolobenzodiazepine analoginen R1498, jossa on tukirakenne, joka perustuu fuusion bentsodiatsepiinia ja pyratsolirenkaan (kuvio 1A), on aiemmin tunnistettu olevan heikko sykliiniriippuvainen kinaasi 2 (CDK2) inhibiittori [19]. Tämä molekyyli osoitti luonne multikinaasi-inhibiittori, kun olemme analysoineet estäjä kirjasto. Kinaasin estäminen profiilia R1498 (1 uM) karakterisoitiin KINOMEScan® ATP pitoisuus noin Km kunkin kinaasin. Esto määrä R1498 on yli 80% vastaan ​​39 kinaasien ulos 402 kinaasien, mukaan lukien 359 villityypin kinaasien ja 43 kinaasin mutantit (kuvio S1). Dissosiaatiovakiot (Kd) 39 osuma kinaasien määritettiin sitten, ja kinaasien kanssa Kd < 0,2 uM oli kuviossa 1B on esitetty. Suurin osa mahdollisista osumia kuuluvat tyrosiinikinaasi (TK) perheen ja AGC perhe. Lisäksi, Z-Lyte määritys suoritettiin edelleen määrittämiseksi kinaasin inhibition aktiivisuus R1498. Tulokset osoittivat, että IC50 on R1498 olivat 25 ± 6, 67 ± 4, 167 ± 13 nM VEGFR2: n, Aurora-kinaasi A ja B, vastaavasti (kuvio 1C). Sitten meidän tutkimus keskittyi anti-angiogeenisten ja anti-mitoottisten reittejä aikuinen vaikuttaa R1498.

paneeli 16 syöpäsolulinjoja, mukaan lukien maksasyöpä, mahasyöpä ja nenänielun karsinooman solulinjoissa, käytettiin määrittämään in vitro
anti-leviämisen kyky R1498. Useimmat solulinjat perustettiin Aasian syöpiä, kuten Aasian vallalla syövät ovat keskitymme. Maksasyöpä ja mahasyöpä solulinja paneelissa olivat herkempiä R1498 kohtelun kuin nenänielun syövän solulinjat. Yleinen keskimääräinen IC50 oli 7,81, 7,55 ja 30,07 uM, joka vastaa epatocellular syöpä, mahasyöpä, ja nenänielun sinoomasolulinjoja, vastaavasti. Herkkyys johdetut solulinjat Aasian väestöstä (BEL-7402, QGY-7701 ja QGY-7703) oli verrattavissa herkkyys Hep3B joka oli peräisin valkoihoinen (kuvio 1 D).

2. R1498 Estää Aurora-kinaasien ja indusoi solukierron pysähtymisen

Aurorakinaasi esto R1498 tehtiin näkyväksi immunofluoresenssilla mahasyövässä solulinjassa SGC-7901. Suora fosforylaatiokohdat fosfo-Aurora-kinaasi A (T288) ja fosfo-histoni H3 (S10) käytettiin osoittamaan kinaasiaktiivisuutta Aurora A ja B, vastaavasti [20], [21]. Fosfo-Ser /Thr-Pro Mitoottista proteiinin monoklonaalinen(MPM2) käytettiin mitoottisen merkki (punainen) merkitsemistä mitoosi-soluja. Aurorakinaasi A (T288) fosforylaatio tapahtuu sentrosomimäärän mitoosi soluissa (vihreä). Kun soluja käsiteltiin 5 uM MR1498 24 tuntia, Aurora T288 vihreä pesäkkeitä mitoosi soluissa heikkeni tai kadonnut (kuvio 2A, ylempi paneeli), mikä osoittaa, että aktiivisuus Aurorakinaasi on käytetty pienempää upon R1498 hoitoa. Fosforylaatio histoni H3 (S10) on pääasiassa lokalisoitu sentromeerien mitoosi soluissa. Sen jälkeen, kun soluja käsiteltiin R1498, fosfo-histoni H3 (S10) väheni jyrkästi (vihreä). Tämä havainto viittasi siihen, että aktiivisuus Aurorakinaasi B laski myös alas kun R1498 hoitoa. Nämä tulokset immunofluoresenssilla vahvistettiin Western blot. Kuten kuvassa 2B, fosforylaatiota fosfo-Aurorakinaasi A (T288) ja fosfo-histoni H3 (S10) laski pitoisuudesta riippuvalla tavalla akuutissa hoitoa R1498.

Aurora-kinaasien A ja B tuottaa eri fenotyyppisiä muutoksia solusyklin. Suppressio Aurora aiheuttama solusyklin G2-vaiheen pysähtymisen [22], kun taas estoa Aurorakinaasi B raportoitu aiheuttavan polyploidia soluissa johtuen endoduplication ilman sytokineesiin [15]. Sen jälkeen, kun soluja käsiteltiin 10 uM R1498, sekä SGC-7901 (mahalaukun syöpä solu) ja BEL-7402 (hepatosellulaarinen karsinooma solu) osoitti, G2 /M-vaiheen pysähtymisen ja kertymistä polyploideja soluja. Sillä BEL-7402, solut jakelusta G2 /M vaiheita kasvoi 25,6%: sta 57,0% puolestaan ​​solut > 4 N DNA sisältöä nousi 6,7%: sta 17,6%. SGC-7901 oli herkempi, jossa G2 /M väestö kasvoi 25,2%: sta 75,5%, ja Polyploidisten solujen kasvoi 3,1%: sta 21,6% (kuvio 2C). Mikrotubulusproteiinit stabilointiaine (esimerkiksi taksoli) ja destabilizer (esimerkiksi kolkisiini) aiheuttaa G2 /M vaiheessa pidätyksen samoin. Ymmärtää onko R1498 on mikrotubulusten kohdennettu reagenssi, in vitro
tubuliinin polymerisaatiota määritys suoritettiin. Tiedot osoittivat, että R1498 ole vakiintunut eikä epävakaiksi mikrotubulusten polymeroitumisen myös kovilla R1498 pitoisuus (40 uM) in vitro
(kuvio 2D), mikä viittaa siihen, että solusyklin G2 /M pidätys ei johtunut mikrotubulusten solun tukiranka häiriö. Yhdessä nämä tiedot osoittivat, että R1498 esti Aurora-kinaasien A ja B-soluissa ja tuotti fenotyyppiset muutoksia soluissa.

3. R1498 antagonisoi Angiogeneesi kehitykseen ihmisen endoteelisoluja

Angiogeneesiä alustetaan eritystä angiogeenisen kasvutekijän kasvainsoluja, ja sitten endoteelisolujen lisääntyvät, siirtää ja muodostaa astian putkien vasteita VEGF stimulaatiota. Puuttua spesifisyys R1498 antagonisoimaan endoteelisolujen kasvua stimuloivat VEGF, ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC) altistettiin kahdelle eri ärsykkeiden, VEGF: n ja FBS, alle hoitoon R1498: ssa 72 tuntia. Alle viljelyolosuhteet sisältävän VEGF tai FBS, HUVEC osoitti eri vaste R1498. IC50 oli 89 ja 2064 nM VEGF ja FBS, vastaavasti; Näiden ehdotti, että R1498 antagonisoi HUVEC kasvua ohjaavat VEGF tehokkaampia kuin FBS (kuvio 3A). HUVEC-putken muodostumiseen määrityksessä, kun 8 tuntia altistuksen R1498, HUVEC muodostuu vähemmän ehjän putken silmää kuin DMSO käsiteltyjen ryhmien (kuvio 3B). R1498 ei vaikuttanut HUVEC proliferaatiota tämän hoidon edellytys (tuloksia ei ole esitetty).

4. R1498 estää Growth of Human Cancer ksenoqraftit

farmakokinetiikkaa yhden annoksen R1498 useita lajeja määritettiin. Puoliintumisaika aika (T1 /2) ja oraalinen hyötyosuus (Oral BA%) suosii tehotutkimuksen nude mouse (taulukko S1), jossa on kaksi kertaa päivässä suun kautta letkulla aikataulu. Paneeli ksenograftien lukien Aasian mahasyövän, maksasyöpä ja nenänielun syöpä käytettiin vertailun välillä R1498 ja toisen multikinaasi estäjä sorafenibi (kuvio 4, taulukko S2). Sorafenibi on hyväksytty ensilinjan hoito maksasyöpä [2], ja on kliinisessä tutkimuksessa kombinatorisista hoidon edennyt mahasyöpä [23]. Rinnakkainen vertailu koostui kasvaimen kasvun eston, regressio ja painon muutokset eläinten kanssa annostelun 25 mg /kg kaksi kertaa päivässä per suun. Kaikilla testatuilla ksenografteissa, R1498 osoitti parempia tuumorin kasvun esto (TGI%) yli sorafenibin. Sillä maksasyöpä, TGI% of R1498 on 10-19% enemmän kuin TGI% sorafenibia, mahasyövän, 2-12% yli TGI% sorafenibin. Regression nopeus kasvaimen sisällytettiin myös toisena terapeuttinen päätepiste. Vuonna maksasyöpä paneeli, kasvaimen regressio havaittiin BEL-7402 malli, 8/10 (80%) eläimillä oli heikentämiseen R1498 ryhmässä, kun taas 1/10 (10%) eläin oli heikentämiseen sorafenibin ryhmässä (kuvio 4, BEL-7402) . Mahasyövän paneeli, MGC-803 ja SGC-7901 ksenografteissa oli sama regressionopeuden vastauksena testiartikkeleita: 5/10 (50%) ja R1498, ja 2/10 (20%) ja sorafenibin (kuvio 4, SGC -7901; ja taulukko S2). Perustuu tehomuuttujina kaikista 7 testattu mallia, R1498 on parempi tehokkuus kuin sorafenibia samoissa hoitoaikataulun. Lisäksi R1498 osoitti hyvää tehokkuutta yhtä nenänielun -ksenograftia, TGI% ja R1498 (90%, 25 mg /kg, kaksi kertaa päivässä, per oraalisella letkuruokinnalla) oli ylivoimainen standardin hoito- syklofosfamidia (60%, 10 päivän välein, intraperitoneaalinen injektio) (kuvio 4, CNE-2). Kehon painon muutokset, jotka kirjattiin kaikissa malleissa myrkyllisyyden vertailu osoitti, että nude-hiiret osoittivat siedettävä R1498 aikana koko hoidon BEL-7402, SGC-7901 ja CNE-2 mallia, vaikka painonnousun laski hieman 10 päivän kuluttua käsittely (kuvio 4, taulukko S2). Kuitenkin sorafenibi aiheutti keskeytyksettä eläimen kehon painosta. Sillä sorafenibi käsitelty hiiri BEL-7402 ja SGC-7901 malleja, osuus kehon painon ylitti 15% lopettamisesta päivänä. Kuten taulukossa S2, R1498 osoittivat vähemmän vaikutusta hiiren kehon painoa kuin sorafenibia teki, joka ehdotti, että R1498 pidetään paremmin turvallisuusprofiili.

5. R1498 Down-säätelee fosforylaatio Aurora A ja Vascular Density vuonna Kasvain

Fosfory- Aurora A (T288) ja CD31 kasvaimia tehotutkimuksen käytettiin määritettäessä on-kohde vaikutuksesta R1498. Kasvain massa korjattu BEL-7402 vierassiirrettä tutkimuksessa valmistettiin osaksi parafiiniin dioja ja alistettiin immunohistochemisty visualisointiin angiogeneesin maker ihmisen CD31 ja Aurorakinaasi aktiviteetti merkki fosfo-Aurora A (T288). In BEL-7402 Tuumorien CD31-värjäys R1498 hoitoryhmään pieneni annoksesta riippuvalla tavalla, mikä viittasi vaskularisaation kasvaimissa estyi (kuvio 5A). Aktiivisuus Aurorakinaasi A on alennettu upon R1498 hoito, joka näkyi heikompana värjäytymisen fosfo-Aurora A (T288) in R1498 käsitellyt tuumorit (kuvio 5B).

Ihmisen primääristä mahakasvaimen peräisin ksenograftimallissa käytettiin ennustamaan tehon kliiniseen käännös. Syöpä kudoksia kolmesta erillisestä mahasyövän potilasta Siirto tehty hiiren, ja ksenografteissa rajattuja eri kasvukäyrät in vivo
. Ksenografteissa osoittivat eri vaikutus painon muutokset isännät. Hiiriä käsiteltiin R1498 (25 mg /kg) annetun ajanjakson, lopullinen TGI% saavutti 73,6 ~ 91,6%, ja regression hinnat 10~30%. Rajoitetun kehon painon muutokset ehdotti, että kasvainta kantavaan hiiret olivat hyvin sietävät R1498 (kuvio 6).

6. R1498 on hyvä farmakokineettinen profiili (PK) ja terapeuttinen ikkuna

SDPK osoitti, että hyväksyttävä hyötyosuus ja puoliintumisaika ominaisuudet R1498 keskuudessa nude hiiri, rotta ja koira (taulukko S1). Yhdistettiin maksan mikrosomeja käytettiin ennustamaan päämetaboliittien eri lajia. Rotan ja beagle koira samanlainen mikrosomipreparaatteja aineenvaihduntatuotteiden ihmisen käytettiin maksimi suvaitsevainen annos (MTD) tutkimuksen määrittää terapeuttinen ikkuna välillä tehokas ja myrkyllisiä vastuut (taulukko S4). Naisten ja miesten Rotilla eri vastaus kärjistynyt annoksia R1498.

• PLoS ONE: pyruvaattikinaasia M2 on kaksijakoinen rooli sääntelyyn EGR /EGFR Signaling via E-kadheriinin riippuvaisesti mahasyövän Cells
• PLoS ONE: ennakoiva tutkimus esiintyvyys Postoperatiivisesti laskimotromboemboliariskin Korean mahasyöpäpotilaista: selvityksen Application Länsi suuntaviivojen Aasian syöpäpotilaille