Inhibitio mahalaukun H, K-ATPaasiaktiivisuutta ja mahalaukun epiteelisolujen IL-8 eritystä pyrrolitsiini johdannainen ML 3000

estyminen mahalaukun H, K-ATPaasiaktiivisuutta ja mahalaukun epiteelisolujen IL-8 eritystä pyrrolitsiini johdannainen ML 3000
Abstract
tausta
ML 3000 ([2,2-dimetyyli-6- (4-kloorifenyyli) -7-fenyyli-2,3-dihydro-1 H-pyrrolitsiini-5-yyli] etikka- happo) on inhibiittori sekä cyclooxygenase ja 5-lipoksigenaasin in vitro, ja lupaava uutena steroideihin kuulumaton tulehduskipulääke (NSAID). Toisin kuin perinteiset NSAID jotka liittyvät mahan ulserogeenisiä vaikutuksia, ML 3000 aiheuttaa vähän tai ei lainkaan vaurioita mahan limakalvon, vaikka se merkittävästi painaa mahan prostaglandiinisynteesiä. Tool Menetelmät
Osana pyritään selvittämään mekanismit mahan säästäviä ominaisuuksia ML 3000, tutkimme vaikutuksia ML 3000 on H, K-ATPaasi aktiivisuutta in vitro, on hapon kertyminen eristetyissä mahalaukun parietaalisoluissa, ja IL-8 eritystä mahan epiteelisolujen kulttuuriin.
tulokset
SCH28080-herkkä H, K-ATPaasin aktiivisuuden erittäin puhdistettua sian mahalaukun mikrosomeissa annoksesta riippuvalla inhiboi ML 3000 (IC 50 = 16,4 uM). Inhibitio oli palautuva, ja tunteeton ML 3000 happamoitumisen pH-alueella 2,0-8,0. Kanin mahan parietaalisoluissa,
ML 3000 annosriippuvaisesti inhiboi histamiinin stimuloimaa hapon kerääntyminen (IC 50 = 40 uM) ja forskoliinin stimuloimaa hapon kerääntyminen (IC 50 = 45 uM). Lopuksi ihmisen mahalaukun adenokarsinooman (AGS) solut, ML 3000 annosriippuvaisesti esti sekä lähtötilanteesta ja IL-1β-stimuloidun (20 ng /ml) IL-8 eritystä IC 50s 0,46 uM ja 1,1 uM.
Johtopäätös
Tulokset osoittavat, että ML 3000 vaikuttaa hapon erityksen mekanismeja alavirtaan cAMP käyttöön histamiinin indusoimaa H 2-reseptorin aktivaation, että se estää suoraan H, K-ATPaasin spesifinen aktiivisuus, ja että lähtötilanteen mahalaukun epiteelisolujen IL-8 sekretorisen inhibitio saattaa välittää ML 3000 inhibitio 5-lipoksigenaasin aktiivisuutta. Olemme päätellä, että nämä mahan toiminta estävä data voi taustalla mahalaukun säästäviä ominaisuuksia ML 3000.
Taustaa
farmakologiset ominaisuudet steroideihin kuulumattomien tulehduskipulääkkeiden (NSAID) syntyvät niiden tukahduttaminen prostaglandiinisynteesin arakidonihaposta [1] . Esto mahalaukun prostaglandiinin synteesien liittyy kuitenkin vähentynyt mahalaukun limakalvon verenkiertoa, joilla on samanaikaisia ​​limakalvon herkkyyttä ajankohtaisista vahinkoa erilaisia ​​ärsyttävien [2]. Lupaava farmakologinen strategia välttää mahalaukun komplikaatioita NSAID hallinto keskittyy samanaikainen cyclooxygenase ja 5-lipoksigenaasin inhibitio, jonka tavoitteena on tukahduttaa leukotrieenisynteesin. 5-lipoksigenaasin muuntaa arakidonihapon leukotrieenien, joista leukotrieeni B4 on kemotaktinen valkosoluja ja vaikutetaan siten tulehdusmekanismeja johtavat ruoansulatuskanavan haavaumat [3]. Pyrrolitsiini johdannainen ML 3000 ([2,2-dimetyyli-6- (4-chlorophen-yyli) -7-fenyyli-2,3-dihydro-1 H-pyrrolitsiini-5-yyli] etikka- happo) on inhibiittori sekä syklo-oksigenaasi ja 5-lipoksigenaasin in vitro [4, 5], ja lupaava uutena NSAID. ML 3000 vähentää mahalaukun prostaglandiini E2: n synteesiä rotan mahassa ja verta, vaikka merkittävää inhibitiota mahan tai veren leukotrieeni B4 synteesiä ei havaittu [6]. Tärkeintä on, ML 3000 ei ole vaikutusta leukosyyttien kiinnittyminen mesenteerisissä venules, eikä aiheuta mahalaukun limakalvon vauriota [6].
Eläinmalleissa, ML 3000 todettiin olevan farmakologisesti hyvänlaatuinen. Siten yhdiste ei vaikuttanut rotan liikunnallista aktiivisuutta tai heksobarbitaalia aiheuttama uni, ei ollut sydän- tai hengityksen vaikutuksia rotalla ja koiralla oli ilman vaikutusta hermolihassairauksiin toiminto kissoilla, ja aiheutti ei mahalaukun vaurioita eikä peristaltic häiriö [7]. ML 3000 herätti heikko spasmogeeniset vasteen marsun sykkyräsuolen, ja aiheutti pienen ohimenevä väheneminen virtsaneritystä rotilla [7]. Genotoksisuustutkimukset osoittavat, että ML 3000 ei ole vaikutusta geenimutaatio taajuuksilla bakteereilla tai nisäkässoluissa, on suunnittelematon DNA-synteesi, tai taajuus kromosomipoikkeavuuksien rotan luuytimen soluja [8]. 14C-leimattua ML 3000 jakelu- ja erityselimiin rotilla osoittavat enterohepaattisen kierron ja glukuronidikonjugaatio ML 3000 [9].
Farmakologinen profiili ML 3000 kuten tutkittu eläinmalleissa osoittaa tulehdusta, kipua lievittävä, kuumetta alentava, astma- ja-aineina aktiivisuus annostuksella, joka ei aiheuta mahan vahinkoa [4, 10]. Akuutti ja krooninen tulehdusta ominaisuudet ML 3000 tutkittiin adjuvanttia indusoidusta rotan käpälän turvotuksen mallissa [11] osoittavat, että vaikka indometasiini on hieman voimakkaampi kuin anti-inflammatorinen aine, ei mahalaukun vaurioita todettiin ML 3000 jopa 100 mg /kg /vrk po, kun taas ulcerogenic annos (UD 50) indometasiinia oli 7 mg /kg /vrk po
Mahalaukun haavauma aiheuttama NSAID rajoittaa merkittävästi hyödyllisyyttä näiden lääkkeiden. On selvää, että yhdistelmä tulehdusta ja mahalaukun säästävä osoittamat ominaisuudet ML 3000 tekee tämän yhdisteen houkuttelevan ehdokkaan jatkotutkimuksiin. Kaksi mahalaukun limakalvon toimintoja, jotka tärkeitä rooleja mahahaava ovat erityksen ja interleukiini-8 eritystä. Erityksen estäjät ovat kaikkein korkeasti määrätty lääkitys, mikä fysiologinen sanonta "Ei happoa, ei haavaa". Farmakologiset tai patofysiologisia rikkomisiin mahalaukun limakalvon esteet takaisin diffuusio HCl johtaa nopeaan heikkenemiseen mahalaukun epiteeliyksiker- ja seurauksena haavaumia limakalvon. Esto erityksen antagonismin perietaalisolun histamiini H2-reseptori (simetidiini), tai suoralla kovalenttisella johdannaisten ja inaktivaation mahalaukun protonipumpun (omepratsoli, lansopratsoli, rabepratsoli, esomepratsoli, jne) on rutiinia paranemisen ja edistämiseen paranemista mahalaukun haavaumat. Siten mahalaukun säästävä vaikutus ML 3000 voi liittyä erityksen inhibitio yhdisteellä.
Täydentävä mahalaukun säästävä vaikutus ML 3000 voi käsittää modulaation mahahapon eritystä pro-inflammatorinen sytokiini IL-8. Aspiriini aiheuttama mahalaukun vahinko on raportoitu liittyvän lisääntynyt antral IL-8 [12]. Ulcerogenic Helicobacter pylori
on osoitettu nopeuttavan ja amplitudi IL-8 eritystä sekä in vitro että in vivo [13-15], ja jopa säännellä IL-8-geenin ilmentymisen [16]. Vastaavia IL-8 prosecretory vaikutukset nähdään seurauksena IL-1β stimulaation mahalaukun epiteelisolujen. Vertailu vaikutusten ML 3000 ja muiden tulehduskipulääkkeiden seuraavilla mahalaukun sekretorinen toiminta saattaa selvittämiseksi mekanismi, jonka ML 3000 estää mahalaukun limakalvon haavaumia.
Selkeyttämiseksi mekanismit mahalaukun säästäviä ominaisuuksia ML 3000, me tutki vaikutusta ML 3000 on kaksi mahalaukun limakalvon sekretorisen toimintoja roolit ulcerogenesis: suolahapon erityksen ja erityksen tulehduksellinen sytokiini interleukiini-8. Tuloksemme osoittavat, että ML 3000 estää sika mahalaukun mikrosomaalisia H, K-ATPaasiaktiivisuutta, estää histamiini stimuloimaa happamuuden kanin mahalaukun parietaalisoluissa, ja estää IL-1β-stimuloitujen IL-8 eritystä ihmisen mahalaukun epiteelisolujen. Tool Menetelmät
Reagenssit
ML 3000 ja ZD-2138 toimittivat Forest Laboratories, Inc., New York, NY, omepratsolia annettiin AstraZeneca R & D, Molndal, Ruotsi, SCH 28080 oli Schering-Plough Research Institute, Kenilworth, NJ, TEDBC tuli Tocris Cookson, Inc., Ballwin, MO, ja NS 398 tuli Cayman Chemicals, Inc., Ann Arbor, MI. Arakidonihapon, indometasiini, asetyylisalisyylihappo, naprokseeni, PGE 2, leukotrieenien B4 ja D4, ja IL-1β olivat kaikki hankittiin Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO. Dimetyylisulfoksidiin (Sigma-Aldrich) käytettiin liuottamaan ML3000, SCH28080, ZD-2138, TEDBC, NS 398, ja indometasiini. Asetyylisalisyylihappo ja naprokseeni liuotettiin ATPaasimääritystä puskurissa (katso alla
). Arakidonihapon ja PGE 2 liuotettiin absoluuttiseen etanoliin, ja omepratsolin liuotettiin metanoliin. Leukotrieenit B4 ja D4 toimitettiin liuotettiin 70:30 sekoitus metanolia ja 17 mM ammoniumasetaatti. IL-1β liuotettiin fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (pH 7,4), 0,1% w /v naudan seerumialbumiinia. Kaikki määritykset, joissa käytetään näitä yhdisteitä sisällytetään sopivaan liuottimeen valvontaa, ja kaikki liuottimet olivat läsnä pitoisuuksina alle 1% w /v lopullisessa määrityksessä seos.
Valmistus H, K-ATPaasin
Mikrosomaalisten mahalaukun H, K-ATPaasin valmistettiin sian mahalaukun limakalvon homogenaatteja differentiaalisella ja sakkaroosi /Ficoll vaiheessa gradienttisentrifugoinnilla kuten aiemmin on kuvattu [17]. Tämä valmiste saadaan suhteellisen raskas (7% Ficoll /1,1 M sakkaroosia interface) GII mikrosomaalisia jae, joka ei osoittanut mitään viivettä K-ATPaasiaktiivisuutta, ja joka käsitti ~ 90% H, K-ATPaasi, joka perustuu densitometrian on 94 kDa SDS-PAGE-analyysi. GII mikrosomeja säilytettiin -80 ° C: ssa 20% glyserolia.
H, K-ATPaasin määritys
ATP hydrolyyttinen aktiivisuus sian mahan mikrosomeja kvantitoitiin kuten ortofosfaatti vapautumisen substraatista ATP kolorimetristä malakiittivihreän menettelyä [18] . ATPaasimääritykset suoritettiin 96-kuoppaisilla mikrotiitterilevyillä. Lyhyesti, 100 pl /kuoppa koepuskuria (60 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2 mM MgCI 2, 1 mM EGTA, ± 7,5 mM KCI, ± 50 uM SCH28080), joka sisälsi 80 ng mikrosomaalisia H, K-ATPaasin ML 3000 (10 -9 M 10 -4 M) tai muita yhdisteitä, ja 1 mM ATP: tä inkuboitiin 30 min 37 ° C: ssa. Entsymaattinen aktiivisuus pysäytettiin lisäämällä (45 ul /kuoppa) kolorimetrisen reagenssin (0,07% malakiittivihreän, 3.7 NH ​​ 2SO 4, 2,27% ammoniummolybdaattia tetrahydraat-, 0,134% Tween-20). 10 sekunnin kuluttua, värireaktio kehitettiin lisäämällä (45 ul /kuoppa) 15% natriumsitraattia. 45 minuutin kuluttua huoneenlämpötilassa, absorbanssi kuopissa 570 nm: ssä mitattiin mikrolevylukijalla.
Mittaamiseksi vaikutuksia ML 3000 happamoitumisen ATPaasi-inhibition, ML 3000 alikvootit (10 mM 5 mM Tris-HCI: ää), olivat titrattiin pH: vaihtelee 2,0-7,4: ssa 30 minuuttia. Mahalaukun mikrosomeja suspendoitiin standardin ATPaasimääritystä pH: ssa 7,4, inkuboitiin 30 min happamaksi erillä ML 3000 (16,6 uM lopullinen ML 3000 konsentraatio) ja sen jälkeen ATPaasi-aktiivisuus mitattiin edellä kuvatulla tavalla. Mitata omepratsolin inhibition H, K-ATPaasin aktiivisuuden, mahalaukun mikrosomeja suspendoitiin ATPaasimääritystä pH: ssa 6,1, inkuboitiin 30 minuutin ajan vaihtelevilla omepratsolin. Omepratsoli happamaksi pH-arvoon 6,1 oli tarpeen, jotta muodostumista estävä tiolireaktiivinen oks.idivälituotetta [19]. Mahalaukun mikrosomeja siirrettiin sitten standardin ATPaasimääritystä pH: ssa 7,4, ja ATPaasi-aktiivisuus mitattiin edellä kuvatulla tavalla. Erityiset H, K-ATPaasi aktiivisuus laskettiin erona mikrosomaalisessa ATPaasi toimintaa läsnäollessa ja ilman erityisiä palautuvia mahalaukun H, K-ATPaasi-estäjän SCH28080, ja ilmaistiin pmol P i /mg proteiinia /h. H, K-ATPaasi-aktiviteettia tuoreeltaan valmistettua sian mahalaukun mikrosomeja vaihteli 140-170 umoolia P i /mg proteiinia /h. Graafinen esitys tiedot osoittavat prosentuaalisen aktiivisuuden H, K-ATPaasin aktiivisuuden funktiona yhdisteen pitoisuuksia.
Ensisijainen Cell valmistaminen
mahalaukun parietaalisolujen eristettiin New Zealand White kanit pronaasilla /Kollagenaasikäsittelyn on fundic limakalvon seurasi rikastaminen solujen epäjatkuvan Nycodenz kaltevuudet kuten aiemmin on kuvattu [20]. Parietaalisolujen valmisteet sisälsi noin 10 7 solua /vatsaan, joista 80 ± 5% oli parietaalisolujen perustuu immunosytokemia H, K-ATPaasi-spesifinen monoklonaalinen vasta-aine.
Acid kertyminen Pitoisuus
aminopyriinin akkumulaatiota päälaen solut arvioitiin 96 ja suodatin levyt Durapore kalvoja, kuten aiemmin on kuvattu [21]. Lyhyesti, soluja esi-inkuboitiin [ 14C] -aminopyrine ja sitten 100000 solua /200 ui kuoppaa kohti inkuboitiin ilman tai testiyhdisteiden kanssa 15 minuuttia ennen inkubointia vielä 30 min puuttuessa tai läsnä ollessa 100 uM histamiinin tai 100 uM forskoliinia. Kaikki määritykset suoritettiin neljänä kappaleena. Basal aminopyriinin kertyminen määritettiin aminopyriinin kerääntyminen käsittelemättömiin soluihin vähennetään kertyminen läsnäollessa KSCN (heijastusta epäspesifistä isotooppi ansastusta). Graafinen esitys tiedot osoittavat prosentuaalinen inhibitio histamiinin stimuloimaa hapon kerääntyminen solujen funktiona yhdisteen pitoisuuksia.
Mahalaukun adenokarsinooma Solut
Ihmisen mahalaukun adenokarsinooman soluja (AGS-solut, ATCC CRL 1739), pidettiin AGS keskipitkän (Hamin F-12, 10% naudan sikiön seerumia, 100 yksikköä /ml penisilliini G: tä, 0,25 ug /ml amfoterisiini B: tä, 100 ug /ml streptomysiiniä), 37 ° C: ssa 5% CO 2/95% ilmaa inkubaattoriin ja niitä käytetään välillä kanavien 42 ja 56. tutkimuksissa IL-8 eritystä, AGS-solut maljattiin 96-kuoppaisille levyille (50000 solua /100 ul /kuoppa) ja annettiin kiinnittyä 18 tunnin ajan 37 ° C: ssa, 5% CO 2/95,% ilmaa. Sitten soluja inkuboitiin testiyhdisteiden läsnä ollessa ja ilman IL-1β 24 tuntia, jona aikana näytteitä väliaineen poistettiin kuopista ja säilytettiin -70 ° C: ssa. IL-8 pitoisuudet näytteistä määritettiin entsyymi-immunologinen määritys (Human IL-8 Duo-Set ELISA kehityksen järjestelmä, R &D Systems Inc., Minneapolis, MN). Graafinen esitys tiedot osoittavat prosentuaalisen aktiivisuuden stimuloimattomia tai stimuloitu IL-8 erityksen funktiona yhdisteen pitoisuuksia.
Tilastollinen analyysi
Kaikki kokeet suoritettiin vähintään kolme kertaa; datapisteet jokaisessa määrityksessä edustavat mittauksen keinoin triplikaattinäytteet. Datapisteet istuva kolmen parametrin logistiseen yhtälöön olivat graafisesti sigmoidisten annos-vaste käyrät käyttäen Prism tilastopaketilla (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Puolet maksimaalisesta eston pitoisuuksien (IC 50) ja IC 50 95%: n luottamusväli (CI) laskettiin myös käyttäen Prism. Datapisteitä ei sovi kolmen muuttujan logistista vedettiin niin yksinkertainen point-to-point käyriä. Keskivirhe oli mitta varianssia käytetään virheiden baareja graafinen esitys tietojen
tulokset
vaikutukset ML 3000 on H, K-ATPaasin aktiivisuuden
Mahalaukun H, K-ATPaasin aktiivisuuden annoksesta riippuvalla inhiboituu ML 3000, jossa puoli-maksimaalinen estävä pitoisuus (IC 50) oli 16,4 uM (CI = 6,84-39,3 uM) (kuvio 1A). Estoaktiivisuus ML 3000 verrattiin klassisen protonipumpun estäjä (PPI), substituoitu bentsimidatsoli omepratsoli. Kuvio 1B esittää omepratsolin vaikutusta on H, K-ATPaasin aktiivisuuden määritysolosuhteissa samat kuin kuviossa 1A; lasketut IC 50 omepratsolin oli 1,7 uM (CI = 0,26-11,3 uM). Nämä tiedot osoittavat, että ML 3000 on huomattavasti heikompi kuin omepratsolia suhteessa mahalaukun H, K-ATPaasi estävää aktiivisuutta, ainakin miljöössä tässä erityisesti vitro määritellyissä olosuhteissa. Sen määrittämiseksi, ovatko ML 3000 näkyy vertailukelpoinen happo-aktivointi ominaisuuksia, puolimaksimaalisen estopitoisuudella ML 3000 titrattiin erilaiset pH ja vaikutukset H, K-ATPaasi aktiivisuus mitattiin. Kuten kuviossa 2A, happamoituminen ML 3000 ei ollut merkittävää vaikutusta sen H, K-ATPaasi estävää profiilia. Nämä tiedot osoittavat, että ML 3000, toisin kuin omepratsolin, ei vaadi happamoitumista induktioon estävää vaikutusta. Koska PPI-lääkkeet ovat peruuttamattomia estäjiä H, K-ATPaasiaktiivisuutta, kovalenttisesti sitoutumaan katalyyttiseen α-alayksikköä, etsimme onko ML 3000 estämällä H, K-ATPaasi oli palautuva tai palautumaton. Mahalaukun H, K-ATPaasi-rikastettu mikrosomeja käsiteltiin mahdollisimman-estopitoisuudella ML 3000 ja sitten laimennettiin suurella ylimäärällä puskuria vähentää ML 3000 konsentraatio 100 uM 3,3 uM. Tulokset, kuvassa 2B, osoitti, että laimentaminen ML 3000 palautettu H, K-ATPaasiaktiivisuutta, ja ovat yhdenmukaisia ​​ML 3000 estämällä H, K-ATPaasi aktiivisuuden palautuvasti, ts., ML 3000 ei kovalenttisesti johdannaisen myöskään alayksikön mahalaukun H, K-ATPaasin, ainakin olosuhteissa esillä olevan in vitro määrityksessä H, K-ATPaasi-aktiivisuutta. Tässä suhteessa, ML 3000 on kineettisesti samanlaisia ​​SCH28080, erityisiä reversiibeli estäjä mahalaukun H, K-ATPaasi. Kuvio 1 Annos-riippuvainen inhibitio H, K-ATPaasin aktiivisuuden ML 3000 (A) ja omepratsolin (B). (A). Mahalaukun mikrosomeja suspendoitiin ATPaasimääritystä pH: ssa 7,4, inkuboitiin 30 minuutin ajan vaihtelevilla ML 3000 ja ATPaasiaktiivisuus mitattiin sitten pH: ssa 7,4. Puolen maksimaalinen estävä pitoisuus (IC50) ja ML 3000 oli 16,4 uM (CI = 6,84-39,3 uM). (B). Mahalaukun mikrosomeja suspendoitiin ATPaasimääritystä pH: ssa 6,1, inkuboitiin 30 minuutin ajan vaihtelevilla omepratsoli, ja siirretään sitten standardin ATPaasimääritystä pH 7,4 ATPaasiaktiivisuus mittausta. IC50 omepratsolin oli 1,1 uM (CI = 0,26-11,3 uM). Tiedot-kohdat osoittavat keskiarvo ± keskivirhe kolmesta itsenäisestä määrityksiin, joista kukin SCH28080 herkkien ATPaasi-aktiivisuus mitattiin kolmena kappaleena.
kuvioon 2 Vaikutus ML 3000 happamoitumisen H, K-ATPaasin aktiivisuuden (A), ja ML 3000 inhibitio H, K-ATPaasin aktiivisuuden on palautuva (B). (A) ML 3000 alikvootit (10 mM 5 mM Tris-HCl), titrattiin pH-arvoissa vaihdellen 2,0-7,4: ssa 30 minuuttia, ennen kuin Lisäksi standardi ATPaasimääritystä-puskuria (pH 7,4), joka sisälsi mahalaukun mikrosomeja. (B) Mahalaukun mikrosomeja käsiteltiin maksimaalisen-estävä pitoisuus (100 uM) ML 3000. mikrosomaalisia Sitten suspensio laimennettiin suurella ylimäärällä puskuria vähentää ML 3000 konsentraatio 100 uM 3,3 uM. Molemmissa (A) ja (B), data-kohdat osoittavat keskiarvo ± keskivirhe kolmesta itsenäisestä määrityksiin, joista kukin SCH28080 herkkien ATPaasi-aktiivisuus mitattiin kolmena kappaleena.
arakidonihappo ja prostaglandiini E 2 (PGE 2) myös esti annoksesta riippuvalla H, K-ATPaasin aktiivisuuden, kanssa IC 50 16,7 uM (CI = 8,9-31,5 pM) ja 15 uM (CI = 3,96-57,3 uM) (kuvio 3A ja 3B). Koska ML 3000 osoittaa myös 5-lipoksigenaasin inhibitio, tutkimme vaikutuksia kahdessa lipoksigenaasiestäjien on mikrosomaalisen H, K-ATPaasi aktiivisuutta. Kuvio 4A osoittaa, että 2- (1-tienyyli) etyyli-3,4-dihydroxybenzylidenecyanoacetate (TEDBC), voimakas estäjä 5-, 12-, ja 15-lipoxygenses, inhiboitu mikrosomaalisia H, K-ATPaasin aktiivisuuden IC 50 22,6 uM (CI = 6,3-81,2 uM). Sitä vastoin 5-lipoksigenaasin-spesifinen estäjä 6 - ((3-fluori-5- (metoksi-3,4,5,6-tetrahydro-2H-pyran-4-yyli) fenoksi) metyyli) kinoliinista (ZD-2138 ) oli minimaalinen vaikutus H, K-ATPaasi (~ 20%: n esto 10 -5 M) (kuva 4B). Nämä tiedot ovat yhdenmukaisia ​​mahalaukun mikrosomaalisia 12- ja 15-lipoxygenases pelissä rooli H, K-ATPaasi aktivointia, tai joilla on suora vuorovaikutus TEDBC H, K-ATPaasi alayksiköt muuttavat entsyymin konformaatioon ja siten toimintaa. On selvää, molemmat tulkinnat ovat provokatiivisia ja ansaitsevat lisätutkimusta. Kuvio 3 inhibitio H, K-ATPaasin aktiivisuuden arakidonihappoa (A) ja prostaglandiini E2: n (B). Mahalaukun mikrosomeja suspendoitiin ATPaasimääritystä pH: ssa 7,4, inkuboitiin 30 minuutin ajan vaihtelevilla arakidonihapon tai PGE2 ja ATPaasiaktiivisuus mitattiin sitten pH: ssa 7,4. IC50 arakidonihapon oli 16,7 uM (CI = 8,9-31,5 pM), ja IC50 PGE2 oli 15 uM (CI = 3,96-57,3 uM). Tiedot-kohdat osoittavat keskiarvo ± keskivirhe kolmesta itsenäisestä määrityksiin, joista kukin SCH28080 herkkien ATPaasi-aktiivisuus mitattiin kolmena kappaleena.
Kuvio 4 inhibitio H, K-ATPaasin aktiivisuuden 5-, 12-, ja 15-lipoksigenaasin estäjä TEDBC (A), ja 5-lipoksigenaasin estäjän ZD-2138 (B). Mahalaukun mikrosomeja suspendoitiin ATPaasimääritystä pH: ssa 7,4, inkuboitiin 30 minuutin ajan vaihtelevilla TEDBC tai ZD-2138 ja ATPaasiaktiivisuus mitattiin sitten pH: ssa 7,4. (A), data-kohdat osoittavat keskimääräistä SCH28080 herkkä ATPaasiaktiivisuuden mitataan kolmena kappaleena yhdessä kolmesta riippumattomasta määrityksissä; Tyypillinen tiedot esitetään. Tiedot-pisteet (B) esittävät keskiarvo ± keskivirhe kolmesta itsenäisestä määrityksiin, joista kukin SCH28080 herkkien ATPaasi-aktiivisuus mitattiin kolmena kappaleena.
Jotta vertailla H, K-ATPaasin estävä vaikutus ML 3000 muiden NSAID: ien, mittasimme vaikutuksia asetyylisalisyylihappo, NS 398, naprokseeni ja indometasiini on protonipumpun toimintaan. Kaikki neljä NSAID olivat ilman estävää vaikutusta mikrosomaalisia H, K-ATPaasi toimintaa pitoisuuksina jopa 10 -4 M (10 -3 M asetyylisalisyylihappoa) (kuvio 5A, 5B, 5C ja 5D). Indometasiinia aiemmin raportoitu estävän mahan H, K-ATPaasi on hieman korkeampi pitoisuus (K i = 0,67 x 10 -3 M) [22]. Tuloksemme selvästi erottaa ML 3000 muista tulehduskipulääkkeiden suhteen estävä vaikutus mahalaukun H, K-ATPaasiaktiivisuus; mekanistisena perustan tämän eron, ja mahdollinen korrelaatio havaittiin mahalaukun säästävää omaisuutta ML 3000, on vielä tutkittava. Kuva 5 Vaikutukset asetyylisalisyylihappo, NS 398, naprokseeni ja indometasiini on H, K-ATPaasi aktiivisuutta. Mahalaukun mikrosomeja suspendoitiin ATPaasimääritystä pH: ssa 7,4, inkuboitiin 30 minuutin ajan vaihtelevilla asetyylisalisyylihappo, NS 398, naprokseeni, tai indometasiinin ja ATPaasiaktiivisuus mitattiin sitten pH: ssa 7,4. Tiedot-kohdat osoittavat keskimääräistä SCH28080 herkkä ATPaasiaktiivisuuden mitattiin kolmena kappaleena jollakin kolmesta riippumattomasta määrityksiä; tyypilliset tulokset on esitetty kussakin tapauksessa.
Lopuksi, jotta voidaan selvittää, onko ML 3000 esto mahalaukun H, K-ATPaasi osoituksena yhdisteen vaikutukset otaksuttu toiminnallinen leukotrieeni metaboliareitit läsnä sian mahan mikrosomeissa, tutkimme vaikutuksia leukotrieeni B4 ja D4 on H, K-ATPaasi aktiivisuutta. Liukoisuus kysymykset poissuljettua tutkimalla LTB4 tai LTD4 pitoisuus on yli 1 uM. Kuten kuviossa 6A ja 6B, eikä leukotrieeni havaittu mitään estovaikutusta H, K-ATPaasin fysiologisissa konsentraatioissa (10 -9-10 -8 M); vain ei-fysiologinen pitoisuus on yli 10 -7 M ollut mitään merkittävää vaimennusta H, K-ATPaasi aktiivisuutta. Kuva 6 Vaikutukset leukotrieenien B4 ja D4 on SCH28080 herkkä H, K-ATPaasi spesifinen aktiivisuus. Mahalaukun mikrosomeja suspendoitiin ATPaasimääritystä pH: ssa 7,4, inkuboitiin 30 minuutin ajan vaihtelevilla leukotrieeni B4 tai leukotrieeni D4 ja ATPaasiaktiivisuus mitattiin sitten pH: ssa 7,4. Tiedot-kohdat osoittavat keskiarvo ± keskivirhe kolmesta itsenäisestä määrityksiin, joista kukin SCH28080 herkkien ATPaasi-aktiivisuus mitattiin kolmena kappaleena.
vaikutukset ML 3000: n vaikutusta mahalaukun parietaalisolujen histamiini-stimuloitu hapon kerääntyminen
ML 3000 annosriippuvaisesti inhiboi histamiini-stimuloiduista (100 uM) hapon kerääntyminen kanin mahan parietaalisoluissa, jossa puoli-maksimaalinen estävä pitoisuus (IC 50) 40 uM (kuvio 7A). ML 3000 myös esti annoksesta riippuvalla forskoliinin stimuloiman (100 uM) happo kertyminen kanin mahalaukun parietaalisoluista, jossa IC 50 ~ 45 uM (kuvio 7B). Nämä tiedot osoittavat, että ML 3000 vaikuttaa parietaalisolujen happoa erittävien mekanismeja alavirtaan cAMP käyttöön histamiinin indusoimaa H 2-reseptorin aktivaation. Tiedot ovat yhdenmukaisia ​​ML 3000 esto parietaalisolun erityksen johtuvat suoraa vuorovaikutusta ML 3000 kanssa mahalaukun H, K-ATPaasi. Kuitenkin discepancy välillä ML 3000 IC 50 mikrosomaalisessa rakkulat (15 uM) ja eristetyissä parietaalisoluissa (40-45 uM) esittää, että ML 3000 pääsy solunsisäisen H, K-ATPaasi osaston parietaalisoluissa voidaan hidastunut by läpäisevyys rajoitteet solukalvon. Vaihtoehtoisesti ML 3000 voidaan soveltaa sytoplasman aineenvaihdunnan muutoksia, jotka rajoittavat estävä vaikutus yhdisteen. Kuva 7 ML 3000 estää hapon kerääntyminen kanin mahalaukun parietaalisoluissa. (A) estyvän annosriippuvaisesti ML 3000 histamiinia stimuloiman (100 uM) happo kertyminen kanin mahan parietaalisoluista (IC 50 = 40 uM). (B) estyvän annosriippuvaisesti ML 3000 forskoliinin stimuloiman (100 uM) happo kertyminen kanin mahan parietaalisoluista (IC 50 = 45 uM). Tiedot-kohdat osoittavat keskiarvo ± keskivirhe neljästä toisistaan ​​riippumattomasta määrityksiin, joista kukin hapon akkumulaatiota parietaalisoluissa mitattiin kahtena kappaleena.
Lopuksi, kuten löydettiin mikrosomaalisia H, K-ATPaasin, muut NSAID: t, kuten asetyylisalisyylihappo, naprokseeni, ja NS 398 (jopa pitoisuudet 10 -4 M) ei ollut vaikutusta happo kerääntyminen eristetty kaniinin parietaalisoluihin (tuloksia ei ole esitetty) B vaikutukset ML 3000 on IL-1β aiheuttama IL-8 eritystä ihmisen mahalaukun adenokarsinooman (AGS) solut
perustason olosuhteissa, AGS-soluja (5 x 10 4 100 ul: ssa viljelyalustaa) eritetyn IL-8 aikana 24 tunnin pitoisuuteen ~ 225 pg /ml väliainetta. Kun stimuloidaan IL-1β (1 ng /ml), AGS solujen IL-8 erityksen aikana 24 tunnin lisättiin ~ 27-kertainen, pitoisuuteen ~ 6000 pg /ml. ML 3000 esti sekä lähtötilanteesta ja IL-1β-stimuloitujen IL-8 eritystä, IC 50s 0,46 uM (CI = 0,09-2,4 uM) ja 1,1 uM (CI = 0,52-2,2 uM) (kuvio 8A ja 8B ). Kuva 8 Vaikutukset ML 3000 on IL-1β aiheuttama IL-8 eritystä ihmisen mahalaukun adenokarsinooman (AGS) soluja. ML 3000 inhiboi sekä lähtötilanteesta (A) ja IL-1β-stimuloitu (B) IL-8: n eritystä, ja IC50-arvot 0,46 uM (CI = 0,09-2,4 uM) ja 1,1 uM (CI = 0,52-2,2 uM) vastaavasti. 5-lipoksigenaasin-spesifinen estäjä ZD-2138 osoitti annosriippuvaisen inhibition lähtötilanteen AGS solun IL-8 eritystä (C), jonka IC50 on 58 nM (CI = 15,6-218 nM) ja minimaalinen vaikutus AGS solujen IL-1β stimuloduista IL-8 eritystä (D). Tiedot-kohdat osoittavat keskiarvo ± keskivirhe kolmesta itsenäisestä määrityksiin, joista kukin IL-8-pitoisuudet mitattiin kolmena kappaleena.
5-lipoksigenaasin-spesifinen estäjä (ZD-2138), joka oli ilman vaikutusta mikrosomaalisia H, K-ATPaasin aktiivisuuden, osoitti annos-reagoiva esto lähtötilanteen AGS solun IL-8 eritystä (kuvio 8C), jossa IC 50 58 nM (CI = 15,6-218 nM). ZD-2138 osoitti minimaalinen vaikutus IL-1β-stimuloitujen IL-8 eritystä AGS soluja (kuvio 8D). H, K-ATPaasin inhibitiota ML 3000, jonka olemme osoittaneet esillä olevassa tutkimuksessa, ei pohjana IL-8 sekretorisen inhibitio tässä mallissa, koska immunosytokemia H, K-ATPaasi-spesifinen monoklonaalinen vasta-aine ei osoita H, K-ATPaasin ilmentymisen in AGS soluissa (tuloksia ei ole esitetty).
keskustelu
tutkimus tarjoaa tietoa vaikutuksista ML 3000 näkökohdista mahalaukun fysiologian liittyvien ulcerogenesis. Kolme kokeellisissa malleissa mahalaukun toiminta tutkittiin; korkeasti puhdistettu toiminnallinen H, K-ATPaasi (protonipumpun) eristettiin mahalaukun limakalvo teurastamon lihasikojen, eristetty kaniinin mahalaukun parietaalisoluista, ja ihmisen mahalaukun adenokarsinooman viljelmässä. Ensimmäisessä mallissa ML 3000 esti protonipumpun kanssa IC 50 16,4 uM. Protonipumpun estäjä (PPI) omepratsoli näkyy IC 50 1,1 uM samassa määrityksessä. Toisin kuin PPI-lääkkeitä, ML 3000 estävä aktiivisuus oli riippumaton pH ja oli palautuva. Valikoiva ja ei-selektiiviset NSAID ei osoittanut H, K-ATPaasi estoaktiivisuus samassa määrityksessä. Toisessa mallissa ML 3000 esti sekä histamiini ja forskoliini stimuloiman happo kertymistä (IC 50 = 40 ja 45 uM), sopusoinnussa ML 3000 protonipumpun estäminen. Kolmannessa mallissa ML 3000 esti sekä lähtötilanteesta ja IL-1β stimuloimaa interleukiini-8 eritystä AGS soluista (IC 50 = 0,46 ja 1,1 uM), vaikka jälkimmäinen vaikutus näyttää liity 5-lipoksigenaasin estävä aktiivisuus ML 3000 (kuvio 8D).
Julkaistu IC 50 omepratsolin suhteen mahalaukun protonipumpun toiminnan välillä 470 nM 36 uM olosuhteista riippuen kokeen [23-25]. Muiden protonipumpun estäjiä, picoprazole IC 50 on 2 uM [26], rabeprazole IC 50 on 72 nM [23], ja lansopratsoli IC 50 on 2,1 uM [27]. Laaja julkaistujen PPI IC 50-arvot mikrosomaalisia H, K-ATPaasi heijastaa mekanistinen tarvetta yhdisteen happamoitumista muodostumisen mahdollistamiseksi tiolireäktiivinen oks.idivälituotetta joka sitten peruuttamattomasti derivatizes H, K-ATPaasi α-alayksikön kysteiinitähdettä johtava entsyymi-inhibition.
Nämä ML 3000 tiedot myös vastakkain dramaattisesti omepratsolin esto hapon kerääntyminen eristetyissä parietaalisoluissa. Acid erityskykyä IC 50s (eristetyissä parietaalisoluissa) protonipumpun estäjät (PPI), kuten omepratsoli, rabeprazole, ja lansopratsoli ovat välillä 59 nM: sta 360 nM [27, 28]. Suurempi teho PPI-lääkkeiden yhteydessä hapon erityskykyä verrattuna mikrosomaalisia H, K-ATPaasi (IC 50s vaihtelevat 72 nM 40 uM) kuvastaa täydellisempi happoaktivaatiolla PPI eristetyissä perietaalisolun canaliculi kuin esiintyy vuonna vitro mikrosomaalisia määritykset pH: ssa 6,1 tai korkeampi.
PGE 2 tiedot ovat toisin kuin edellisessä tutkimuksessa, jossa ei estävä vaikutus PGE 2 sian mahalaukun H, K-ATPaasin [29] on raportoitu . Erot tietyn ATPaasimääritystä käytetty kyseisessä tutkimuksessa voi selittää tätä eroa. Koska ML3000 ja arakidonihappo ovat anionisia amfifiilit, niiden estäviä vaikutuksia saattaa aiheutua erityistä vuorovaikutusta H, K-ATPaasin alayksikön sitoutumiskohtien tai vähemmän erityisiä hydrofobisia vuorovaikutuksia H, K-ATPaasi-associated mikrosomaalisen kalvon lipidit, tai niiden yhdistelmän molemmat tekijät.
palautuvuus ML 3000 eston H, K-ATPaasi aktiivisuutta in vitro, kuviossa 2B, vastakohtana peruuttamaton H, K-ATPaasi esto bentsimidatsolijohdoksille kuten omepratsoli tai lansopratsoli.

• CD44 /CD24 Expression toistuviin mahasyövän: retrospektiivinen analyysi
• Suhde aterian jälkeisen muutoksia sydämen vasemman kammion toiminta, glukoosin ja insuliinin pitoisuudet, mahalaukun tyhjenemistä, ja kylläisyyden terveillä koehenkilöillä