Rooli γ-glutamyylitranspeptidaasin patogeneesissä Helicobacter suis ja helikobakteeri-infektioita

Rooli γ-glutamyylitranspeptidaasin patogeneesissä Helicobacter suis
ja Helicobacter pylori
infektioita
Abstract
Helicobacter
(H.
) suis
voi asuttaa vatsaan sikojen sekä ihmisillä, mikä aiheuttaa krooninen gastriitti ja muita mahalaukun patologisten muutosten kuten mahahaava ja limakalvo-liittyvässä imukudoksessa (MALT) lymfooma. Äskettäin virulenssitekijä H. suis
, γ-glutamiinihappotranspeptidaasi (GGT), on osoitettu olevan tärkeä rooli induktio ihmisen mahalaukun epiteelisolujen kuolemaa ja modulaatio lymfosyyttien lisääntymisen riippuen glutamiinia ja glutationin hajoamista. Esillä olevassa tutkimuksessa merkitystä GGT patogeneesissä H. suis
infektiota tutkittiin hiiren ja mongoliangerbiili malleja. Lisäksi suhteellinen merkitys H. suis
GGT verrattiin kuin helikobakteeri
GGT. Merkittävä ja eri panos GGT H. suis
ja helikobakteeri
nähtiin kannalta bakteerien kolonisaation, tulehdus ja herätti immuunivastetta. Toisin kuin helikobakteeri
Δggt
kantoja, H. suis
Δggt
kannat kykenivät colonizing mahassa tasoilla verrattavissa WT kantoja, vaikka ne indusoi huomattavasti vähäisempää mahalaukun tulehdusta hiirillä. Tämä on tunnettu siitä, että pienemmät numerot T- ja B-solut, ja alemman tason epiteelisolujen proliferaatiota. Yleensä verrattuna WT-kantaa infektio, GGT
-mutanttikannoista H. suis
laukaisi alhaisempi Th1 ja Th17 allekirjoitus sytokiiniekspressiota. Korostunut ylössäätely B-lymfosyytin kemoatrak- CXCL13 havaittiin, sekä eläimillä tartunta WT ja GGT
-mutanttikannoista H. suis
. Mielenkiintoista on, H. suis
GGT on osoitettu vaikuttavan glutamiini aineenvaihduntaan mahalaukun epiteelin läpi downregulation glutamiini kuljettimen ASCT2.
Johdanto
Helicobacter
(H.
) pylori
on gram-negatiivinen bakteeri, joka kolonisoi vatsan yli puolet maailman väestöstä. Infektio tämän bakteerin voi aiheuttaa gastriitti, mahahaava tauti, mahalaukun adenokarsinooman ja limakalvo-liittyvässä imukudoksessa (MALT) lymfooma [1-3]. Sitä paitsi H. pylori
, ei-H. pylori
helicobacters (NHPh) on myös havaittu vatsassa ihmisten ja näiden bakteerien aiheuttaa samanlaisia ​​mahalaukun sairauksia. Riski sairastua mahalaukun MALT-lymfooma on korkeampi aikana NHPh infektion verrattuna infektio helikobakteeri
[4-9]. H. suis
on yleisin mahalaukun NHPh ihmisillä. Siat ovat luonnollinen isäntä tämän bakteerin, jossa esiintyvyyden saavuttaa 90% tai enemmän [10] ja todennäköisesti, sikojen ja mahdollisesti myös sianlihaa ovat tärkeimmät ihmisen H. suis
infektion [4,11-13].
H. suis
infektio näyttää jatkuvan elämän, ainakin sioilla ja jyrsijöiden käytetään malleina ihmisen infektiot [14]. Sioilla infektio aiheuttaa kehittäminen gastriitti ja vähentää painonnousun. Lisäksi bakteeri näyttää olevan merkitystä kehitettäessä haavaumia ei-glandular pars oesophagea [15]. Hiirillä ja mongoliangerbiili malleja ihmisen mahalaukun sairauksien, kokeellinen H. suis
infektio aiheuttaa vakavia maha- patologian [4,16,17], mukaan lukien gastriitti, perietaalisolun kuolion ja kehittämiseen mahalaukun MALT-lymfooman kaltaisia ​​vaurioita, jotka muistuttavat havaitut vauriot H. suis
infektoiduista ihmisiin.
Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että tämä bakteeri puuttuu homologia useiden virulenssitekijöistä helikobakteeri
, kuten Sytotoksiini liittyvät geenit
patogeenisyyssaarekkeen ( CAG
PAI) ja vakuoleja Sytotoksiini (VacA) [18]. Olimme kuitenkin pystyy tunnistamaan γ-glutamiinihappotranspeptidaasi (GGT) tärkeänä virulenssitekijä H. suis
. Tämän entsyymin on kuvattu aiheuttaa mahalaukun epiteelisoluvauriota [19] ja modulaatio lymfosyyttien lisääntymisen [20] kautta vuorovaikutus entsyymin, jossa on kaksi sen substraattien, L-glutamiinia ja pelkistetty glutationi, joten se ensimmäinen tunnistettu ja tutkittu H. suis
virulenssideterminantti.
rooli GGT aikana helikobakteeri
infektion in vivo
on tutkittu hiirillä. Ristiriitaisia ​​päätelmiä on tehty siitä, miten tärkeää GGT Kolonisaatiopotentiaalin. Jotkut ryhmät ovat osoittaneet, että H. pylori
GGT tarvitaan jatkuva infektio hiirillä [21], kun taas toiset ovat tehneet päinvastoin päätelmät [22]. Lisäksi on saatu todisteita, että Helicobacter
GGT on ratkaiseva virulenssitekijä osallisena immuunijärjestelmän veronkierron ja immuunijärjestelmän toleranssi [23-25].
Nykyisin ei tiedetä, miten H. suis
GGT vaikutteita aikana H. suis
infektion in vivo
. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli laajentaa edelliseen in vitro
havaintoja H. suis
GGT, ja tutkia roolia tämän virulenssitekijäksi patogeneesissä H. suis
infektion in vivo
. Samaan aikaan meidän joiden tarkoituksena on verrata sen suhteellinen merkitys kuin GGT H. pylori
. Nykyisen kokeet suoritettiin BALB /c-hiirissä ja ulkosiittoiset Mongolian gerbiilit, koska nämä eläinmalleissa on todellakin osoitettu olevan arvokkaita työkaluja roolin tutkimiseksi Helicobacter
lajien mahalaukun patologian. Tyypillisesti Mongolian gerbiilit, nopeampaa ja vakavia kehitys mahavaurioita voidaan havaita verrattuna hiiriin [4,26,27].
Materiaali ja menetelmät
eläinten ja bakteerikantoja
Kuusikymmentä 4-viikko- vanha, naispuolinen erityiset-taudinaiheuttajista vapaat (SPF) BALB /c-hiiriä ostettiin Harlan NL (Horst, Alankomaat). Kaksikymmentäviisi 4 viikon ikäiset, naaraat SPF ulkosiittoinen Mongolian gerbiilit (CRL: MON) saatiin Charles River Laboratories (Lille, Ranska).
Varten H. suis
infektio hiirillä ja Mongolian gerbiilit, kanta HS5cLP käytettiin. Tämä kanta on eristetty vuonna 2008 mahasta teurastamon sika [28]. Kokeisiin Helikobakteeri
infektion Mongolian gerbiilit, kanta PMSS1 [29] käytettiin, koska tämä kanta ei ole ollut in vivo
sopeutumista hiirillä, toisin kuin hiiren mukautettu kannan SS1. BALB /c-hiiriä, H. pylori
kanta SS1 [29] on käytetty, koska kanta PMSS1 on aiemmin osoitettu ei voi asuttaa vatsan BALB /c-hiirten [29].
Rakentaminen isogeenisten GGT
mutanttikantoja H. suis
ja H. pylori
isogeenisiin H. suis GGT
mutanttikanta (HS5cLPΔggt
) valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [20]. Isogeenisissä GGT
mutanttikanta H. pylori
saatiin käyttäen samaa strategiaa kuin luominen H. suis
isogeenisiin GGT
mutantti, paitsi että kanamysiiniresis- kasetti sijaan käytetään kloramfenikoliresistenssi kasetti [20]. Hyvin lyhyesti, poistetaan GGT
vuonna helikobakteeri
SS1 ja PMSS1 otettiin käyttöön alleelinen vaihto käyttämällä pBluescript II SK (+) phasmidivektori (Agilent Technologies, Kalifornia, USA), jossa ~ 440 emäsparia 5 ' end ja ~ 430 emäsparia 3 'end kohdegeenin ja kanamysiiniresistenssin kasetti plasmidista pKD4 [30] ligoitiin läpi PCR-välitteistä strategian 2 sykliä käänteisellä PCR: llä ja fuusio-PCR [20]. Kaikki käytetyt alukkeet PCR-välitteisen rakentaminen rekombinanttiplasmideja on esitetty taulukossa 1.
Tulokseksi saatu plasmidi monistettiin XL1-Blue MRF 'E. coli
(Agilent Technologies) ja käytetään itsemurha plasmidin H . pylori
SS1 ja PMSS1 (ystävällinen lahjoitus Sara Lindén ja Anne Muller, vastaavasti). Helikobakteeri
SS1 GGT
mutantti (SS1Δggt
) ja helikobakteeri
PMSS1 GGT
mutantti (PMSS1Δggt
) saatiin elektrotransformaatiolla [31] tai luonnollinen muutos [32 ] edellä kuvatulla tavalla. Lopuksi, bakteerit valittiin Columbia-agarmaljoilla (Oxoid, Basingstoke, UK), jossa Vitox täydennysosa (Oxoid), 5% (v /v) defibrinoidulla lampaan verta (E & O Laboratories Ltd, Bonnybridge, UK), ja kanamysiiniä (25 ug /ml). Levyjä inkuboitiin 5-9 päivää. Isogeenisissä GGT
mutantit tarkastettava GGT aktiivisuuden määritys [19], PCR ja nukleotidin sequencing.Table 1 käytetyt alukkeet rakentamiseen Helikobakteeri GGT isogeenisiin mutanttikannoilla
Primer nimi
Sequence (5'3 ')
Primer käyttää
pBlue lineaarinen Fwd 1
GGGGATCCACTAGTTCTAGAGCG
linearisointi plasmidin
pBlue lineaarinen Rev1
CGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAG
linearisointi plasmid
HpGGT-flank_fusion1F
CTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGTAACCGGTAAAATCAACACGGACGC
Amplification Helikobakteeri GGT
ja osittainen alku- ja loppupään reunustavat geenien
HpGGT-flank_fusion1R
CGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCGCGCTCTTATAAAAAGAAGCCGC
Amplification helikobakteeri GGT
ja osittainen alku- ja loppupään reunustavat geenien
pBluelinear_Hpggtflank1F
CCAAGGAAAGAATTTTAATCCTATTTAG
linearisointi rekombinanttiplasmidin
pBluelinear_Hpggtflank1R
CTGTTTTCCTTTCAATCAACAATAATC
linearisointi rekombinanttiplasmidin
Hpkana_fusion_1F
ATTATTGTTGATTGAAAGGAAAACAGATGATTGAACAAGATGGATTGC
Amplification kanamysiiniresistenssigeeni
Hpkana_fusion_1R
CTAAATAGGATTAAAATTCTTTCCTTGGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAG
monistaminen kanamysiiniresistenssigeeni
T7 prom3
TAATACGACTCACTATAGGG
Sequencing
M13R
caggaaacagctatgac
Sequencing
Viljelyolosuhteet bakteerikantojen
Villityypin (WT) H. suis
kanta HS5cLP kasvatettiin 48 tuntia kuten aiemmin on kuvattu [29]. HS5cLPΔggt
bakteerit kasvatettiin samoissa olosuhteissa kuin kanta HS5cLP, paitsi että viljely levyjä täydennettiin kloramfenikolia (30 ug /ml), kuten aiemmin on kuvattu [20].
WT H. pylori
kannat SS1 ja PMSS1 kasvatettiin Columbia-agarmaljoilla, joka sisälsi 5% (v /v) defibrinoidulla lampaan verta 48-72 tunnin ajan 37 ° C: ssa mikroaerobisissa olosuhteissa kuin aiemmin on kuvattu [29]. Tämän jälkeen pesäkkeet poimittiin ja niitä viljeltiin Brucella-liemessä, johon Vitox (Oxoid) ja 5% vasikan sikiön seerumia (HyClone) on pyörivä ravistelijassa mikroaerobisissa olosuhteissa (16 h, 125 rpm). SS1Δggt
ja PMSS1Δggt
kantoja viljeltiin samoissa olosuhteissa kuin vastaava WT paineita maljoilla kanamysiiniä (25 ug /ml).
Koejärjestely
Saapuessaan, kuusikymmentä BALB /C-hiiriä ja kaksikymmentäviisi Mongolian gerbiilit jaettiin 5 ryhmään, ja eläinten annettiin sopeutua uuteen ympäristöön 1 viikko. Eläimet inokuloitiin vatsansisäisesti 3 kertaa 48 tunnin välein. Eläimet ryhmästä 1 ja 2 (molemmat hiiret ja Mongolian gerbiilit) ympättiin Brucella liemi sisälsi 8 ​​x 10 7 elävien bakteereiden kantojen HS5cLP ja HS5cLPΔggt
, vastaavasti. Eläimet ryhmässä 3 ja 4, ympättiin Brucella liemi, joka sisälsi 3 x 10 8 elävien bakteereiden kantojen SS1 ja SS1Δggt
(hiiret) tai 1 x 10 9 elävien bakteereiden kantojen PMSS1 ja PMSS1Δggt
(gerbiilit). Eläimet viidennessä ryhmässä ympättiin Brucella liemi ja toimi infektoimattomien valvontaa. Hiiriä, on 4 viikkoa, 9 viikkoa ja 6 kuukautta infektion jälkeen (pi), 4 eläintä kustakin ryhmästä tapettiin katkaisemalla kaula isofluraanianestesiassa. Sillä Mongolian gerbiilit, kaikki eläimet tapettiin 9 viikkoa pi. Vatsat eläimet resektoitiin jatkokäsittelyä varten kuten aiemmin on kuvattu [27,29].
Eläinkokeet hyväksyttiin eettisen komitean eläinlääketieteellinen tiedekunta, Gentin yliopisto, Belgia (EC2013 /29).
histopatologisia tutkimuksia ja immunohistokemia (IHC)
Kolme pitkittäisliuskoilla mahalaukun kudosta hiiristä ja Mongolian gerbiilit leikattiin ruokatorven pohjukaissuoleen suurempaa kaarta pitkin. Kudos kiinnitettiin 4% fosfaattipuskuroidussa formaldehydi, prosessoidaan tavanomaisilla menetelmillä ja parafiiniin valomikroskopiaa. Viisi leikesarjojen 5 um leikattiin. Ensimmäinen osa värjättiin hematoksyliinillä /eosiinilla (H &E) pisteet aste gastriitti mukaan päivitetty Sydney System joitakin muutoksia [33]. Sen jälkeen deparaffinization ja nesteytykseen loput osat, lämmön aiheuttama antigeeni haku suoritettiin sitraattipuskurilla (pH = 6,0). Jotta endogeenisen peroksidaasin salpaamiseksi aktiivisuus ja epäspesifiset reaktiot, kaikki levyt inkuboitiin 3% H 2O 2 metanolissa (5 min) ja 30% vuohen seerumia (30 min), vastaavasti. Sillä erottelu T- ja B-lymfosyytit, CD3 ja CD20-antigeenejä värjättiin rataosuuksilla kaksi ja kolme, käyttäen polyklonaalista kanin anti-CD3-vasta-aineen (1/100; DakoCytomation, Glostrup, Tanska) ja polyklonaalisella kanin anti-CD20-vasta-ainetta (1 /25; Thermo Scientific, Fremont, USA), tässä järjestyksessä. Jaksoissa jatkokäsitteli kanssa Envision + System-HPR (DAB) (DakoCytomation) käytettäväksi kanin ensisijainen vasta-aineita. Neljäntenä ja viidentenä jakso, epiteelisolujen lisääntymistä ja lukumäärä parietaalisolujen määritettiin IHC värjäys, käyttäen hiiren monoklonaalisella anti-Ki67-aineella (1/25; Menarini Diagnostics, Zaventem, Belgia) ja hiiren monoklonaalinen anti-vety kalium ATPaasi β-alayksikön (H + /K + ATP) vasta-aine (1/25 000; Abcam Ltd, Cambridge, UK), tässä järjestyksessä. Myöhemmät visualisointi tehtiin Envision + System-HPR (DAB) (DakoCytomation) käytettäväksi hiiren ensisijainen vasta-aineita. Kvantifiointi T-solujen, B-solujen ja epiteelisolujen suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [4]. Lyhyesti, numerot kuuluvien solujen määritelty solupopulaatioiden (T-solut, B-solut, ja epiteelisolut) määritettiin laskemalla positiivisten solujen viisi satunnaisesti valittua High Power Fields (suurennus: x 400), sekä antrumissa että korpuksessa alue .
jotta voidaan arvioida mahdollista kehittymistä pseudopyloric metaplasiaa aiheuttama Helicobacter
infektio, Alcian blue-perjodihappo- Schiff tahra värjäys (AB /PAS) suoritettiin.
kvantifiointi kolonisoitumaan bakteerien vatsassa hiiret ja Mongolian gerbiilit
Strips mahalaukun kudoksesta, joka sisältää kaikki alueet hiiriä ja erillisiä kappaleita (antrumiin ja corpus) ja Mongolian gerbiilit säilytettiin 0,5 ml RNAlater
ratkaisu (Ambion, Austin, TE, USA) -70 ° C kunnes RNA ja DNA: n uuttaminen. Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) käytettiin määrittämään lukumäärän colonizing bakteerien mahalaukun kudoksesta edellä kuvatulla [29,34].
RNA ja käänteinen transkriptio
qRT-PCR: ää käytettiin määrittämään geeni-ilmentymisen mahalaukun kudoksen hiirillä ja Mongolian gerbiilit. Kokonais-RNA uutettiin käyttämällä RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Saksa) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Pitoisuus RNA: ta mitattiin käyttäen NanoDrop spektrofotometrillä (Isogen Life Science, PW De Meern, Utrecht, Alankomaat). Puhtaus RNA arvioitiin kanssa Experion automatisoitu elektroforeesi järjestelmän avulla StdSens RNA sirut (Bio-Rad, Hercules CA, USA). RNA-pitoisuus kaikista näytteistä säädettiin 1 ug /ul, ja cDNA syntetisoitiin heti RNA-puhdistuksella käyttäen iScript ™ cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad).
Suunnittelu ja validointi alukkeita ja määrittäminen geeniekspression
taloudenhoito geenit H2afz, PPIA
ja HPRT
sisällytettiin referenssinä geenien hiirillä [29]. Sillä Mongolian gerbiilit, joukko viite geenien testattiin perustuu siihen, että ne ovat laajalti käytetty muilla eläinlajeilla. Alukkeet suunniteltiin perustuen konservoituneisiin alueisiin ACTB, β-aktiini, RPS18
, GAPDH
, HPRT1
, SDHA
ja UBC
täydellinen tai osittainen koodaavat sekvenssit saatavilla ihmisille, sioille, hiiret ja rotat.
mRNA: n ilmentymisen tasoja erilaisten sytokiinien (IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-17, IL-1β, IL-6, IL-10), on aikaisemmin osoitettu ilmentyä erilailla aikana H. suis
infektio, sekä muista geeneistä (Foxp3, CXCL13, ASCT2, ATP4a, ja ATP4b) kvantitoitiin käyttämällä SYBR Green RT-PCR iQ ™ SYBR Green Supermix. Reaktiot suoritettiin käyttäen CFX96 RT-PCR System on C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad), kuten aiemmin on kuvattu [29]. Kaikki reaktiot suoritettiin 12 ui määriä sisälsi 0,05 ui kutakin aluketta (1,25 pmol /ul), 6 ui iQ ™ SYBR Green Supermix, 3,9 ui HPLC vettä ja 2 ui cDNA: ta. Kokeellinen ohjelma koostui 95 ° C: ssa 15 min, jota seurasi 40 sykliä denaturointi 95 ° C: ssa 20 s, pariutuminen 60 ° C: ssa 30 s, ja pidennys 72 ° C: ssa 30 s. Kynnyssyklinä arvot (Ct) normalisoitiin geometrinen avulla viittaamalla geenien ja normalisoitu mRNA-tasojen kaikkien kohdegeenien laskettiin käyttäen menetelmää 2 -ΔΔCt [35].
Koska ei ollut saatavilla geenin tietoa Forkhead /winged helix transkriptiotekijä (Foxp3) ja kemokiinin CXC ligandin 13 (CXCL13) päässä Mongolian gerbiilit, alukkeet suunniteltiin perustuen konservoituneisiin alueisiin Foxp3 ja CXCL13 täydellinen tai osittainen koodaavat sekvenssit saatavilla ihmisille, sioille, hiiret ja rotilla samaa strategiaa kuin yllä on kuvattu. MRNA ekspressiotasot Foxp3 ja CXCL13 määritettiin käyttämällä samaa menetelmää kuin edellä on kuvattu. Sekvenssi-informaatio kaikkien alukkeiden hiirille ja Mongolian gerbiilit on esitetty taulukoissa 2 ja 3.Table 2 Luettelo geenien ja käytetyt alukkeet qRT-PCR Mongolian gerbiileillä
Gene
Primer

Sequence (5'3 ')
referenssit
Foxp3
mielessä
GCCCCTMGTCATGGTGGCA
tutkimus
antisense
CCGGGCCTTGAGGGAGAAGA
CXCL13
mielessä
GAATGGCTGCCCCAAAACTGAA
tutkimus
antisense
TCACTGGAGCTTGGGGAGTTGAA
GAPDH
mielessä
AACGGGAAGCTCACTGGCATG
Tämä tutkimus
antisense
CTGCTTCACCACCTTCTTGATGTCA
HPRT1
mielessä
GCCCCAAAATGGTTAAGGTTGCA
tutkimus
antisense
TCAAGGGCATATCCAACAACAAAC
RPS18
mielessä
CGAGTACTCAACACCAACATCGATGG
Tämä tutkimus
antisense
ATGTCTGCTTTCCTCAACACCACATG
IL-1β
mielessä
GGCAGGTGGTATCGCTCATC
[64]
antisense
CACCTTGGATTTGACTTCTA
IFN-γ

mielessä
CCATGAACGCTACACACTGCATC
[65]
antisense
GAAGTAGAAAGAGACAATCTGG
IL-5
mielessä
AGAGAAGTGTGGCGAGGAGAGACG
[27]
antisense
ACAGGGCAATCCCTTCATCGG
IL-6
mielessä
GAGGTGAAGGATCCAGGTCA
[66]
antisense
GAGGAATGTCCTCAGCTTGG
IL-10
mielessä
GGTTGCCAAGCCTTATCAGA
[27]
antisense
GCTGCATTCTGAGGGTCTTC
IL-17
mielessä
AGCTCCAGAGGCCCTCGGAC
[64]
antisense
AGGACCAGGATCTCTTGCTG
ATP4b
mielessä
GGGGGTAACCTTGAGACCTGATG
[27]
antisense
AAGAAGTACCTTTCCGACGTGCAG
β-aktiini
mielessä
TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA
[66]
antisense
CCAGACAGCACTGTGTTGGC
Taulukko 3 geenien ja alukkeita käytettiin qRT-PCR hiirillä
Gene
Primer
Sequence (5'3 ')

Referenssit
IL-1β
mielessä
GGGCCTCAA AGGAAAGAATC
[29]
antisense
TACCAGTTGGGGAACTCTGC
IFN-γ

tunne
GCGTCATTGAATCACACCTG
[29]
antisense
TGAGCTCATTGAATGCTTGG
IL-4
mielessä
ACTCTTTCGGGCTTTTCGAT
[29]
antisense
AAAAATTCATAAGTTAAAGCATGGTG
IL-10
mielessä
ATCGATTTCTCCCCTGTGAA
[29]
antisense
CACACTGCAGGTGTTTTAGCTT
IL-17
mielessä
TTTAACTCCCTTGGCGCAAAA
[29]
antisense
CTTTCCCTCCGCATTGACAC
Foxp3
mielessä
GCCCCTMGTCATGGTGGCA
tutkimus
antisense
CCGGGCCTTGAGGGAGAAGA
CXCL13

tunne
CTCTCCAGGCCACGGTATT
[67]
antisense
TAACCATTTGGCACGAGGAT
ATP4a
mielessä
TGCTGCTATCTGCCTCATTG
[68]
antisense
GTGCTCTTGAACTCCTGGTAG
ATP4b
mielessä
AACAGAATTGTCAAGTTCCTC
[68]
antisense
AGACTGAAGGTGCCATTG
HPRT
mielessä
CAGGCCAGACTTTGTTGGAT
[29]
antisense
TTGCGCTCATCTTAGGCTTT
PPIA
mielessä
AGCATACAGGTCCTGGCATC
[29]
antisense
TTCACCTTCCCAAAGACCAC
H2afz
merkityksessä
CGTATCACCCCTCGTCACTT
[29]
antisense
TCAGCGATTTGTGGATGTGT
tilastollinen
erot kolonisaation kapasiteetti analysoitiin käyttämällä ei-parametrinen Mannin-Whitneyn U
testi. Erot lymfosyyttitunkeutumisella, sytokiiniekspressiota ja IHC analyysi arvioitiin yksisuuntaisella ANOVA seuraa Bonferroni jälkikäteen testi. Tilastolliset analyysit tehtiin SPSS Statistics 20 ohjelmisto (IBM). Pareittain vertailut tehtiin kunkin ajankohdassa ja yhdistettyjen tietojen avulla aikaan kerrostumista tekijä. P
-arvot olivat alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä. Kaikki tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Kaikki luvut luotu GraphPad Prism5 ohjelmistoa (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA).
Tulokset
Colonization tiheys
Kaikki ohjaus eläimet olivat negatiivisia Helicobacter
. Tulokset sairastuneet eläimet osoittivat, että WT H. suis
voi jatkuvasti asuttaa hiiren vatsaan kolonisaation pitoisuuksina kuin 5,42 x 10 4 (± 1,46 x 10 4) bakteeria /mg mahalaukun kudosta jopa 6 kuukautta pi (kuvio 1 C). Helikobakteeri
kanta SS1 osoitettiin asuttaa hiiren vatsa halvempaan bakteerien tiheys, on 1,68 x 10 3 (± 1,73 x 10 3) bakteereja /mg kudosta 6 kuukauden pi (kuva 1C, p
< 0,05). Kuva 1 välinen korrelaatio bakteerikolonisaatiota kapasiteetin ja tulehdus pisteet vatsassa hiirien ja Mongolian gerbiilit. Kolonisoimista kapasiteetti näkyy log10 arvot H. suis
tai helikobakteeri
per mg kudosta, määritettiin qRT-PCR corpus hiirten (A-C) ja antrum Mongolian gerbiilit (D). 0, ei tunkeutumisen mononukleaaristen ja /tai polymorfonukleaarisiin soluja; 1, hyvin lieviä hajanainen tunkeutumisen mononukleaaristen ja /tai polymorfonukleaarisiin soluja tai läsnäolo yksi pieni (20-50 solua) yhteenlaskettu tulehdussolujen; 2, lievä hajanainen tunkeutumisen mononukleaaristen ja /tai polymorfonukleaarisiin soluja tai läsnäolo yksi pieni (50-200 solua) yhteenlaskettu tulehdussolujen; 3, kohtalainen hajanainen tunkeutumisen mononukleaaristen ja /tai polymorfonukleaarisiin soluja ja /tai läsnä on 2-4 tulehduksellinen aggregaattien; 4, diffuusin tunkeutumisen mononukleaaristen ja /tai polymorfonukleaaristen solujen ja /tai läsnä on vähintään viisi tulehduksellinen aggregaatteja. HS vs. HSM: Colonization: p
> 0,05; Tulehdus: p
< 0,05. SS1 vs. SS1m: Colonization: p
< 0,05; Tulehdus: p
< 0,05. PMSS1 vs. PMSS1m: Colonization: p
> 0,05; Tulehdus: p
< 0,05. HS: eläimet tartunnan WT H. suis
srain HS5cLP; HSM: eläimet tartunnan H. suis
kanta HS5cLPΔggt
; SS1: eläimet tartunnan WT helikobakteeri
SS1; SS1m: eläimet tartunnan helikobakteeri
SS1Δggt
; PMSS1: eläimet tartunnan WT helikobakteeri
PMSS1; PMSS1m: eläimet infektoitiin H. pylori
PMSS1Δggt
.
Mielenkiintoista, H. suis
kanta HS5cLPΔggt
kykeni asuttaa corpus mahan hiirten samassa määrin kuin WT-kantaa, ja tämä havaittiin kaikkina ajankohtina (kuviot 1A-1C). Sen sijaan, H. pylori
kanta SS1Δggt
on osoitettu olevan alentunut kolonisaatio kapasiteetin hiirillä kaikilla kolmella ajankohtina (kuviot 1A-1C, s
< 0,05). Samanlaisia ​​kolonisaatio tiedot osoitettiin antrumin Helicobacter
tartunnan-hiiret kaikissa kolmessa ajankohtina (tuloksia ei ole esitetty).
Sekä HS5cLP ja HS5cLPΔggt
kanta onnistuneesti colonized antrum ja korpus vatsaan Mongolian gerbiilit vaikka kolonisaatio hinnat olivat huomattavasti alhaisemmat corpus verrattuna antrumiin. Mitään tilastollisesti merkittäviä eroja ei havaittu molempien kantojen (kuvio 1D, s
> 0,05). Helikobakteeri
kanta PMSS1Δggt
kykeni asuttaa antrum ja korpus mahan samalla tasolla verrattuna PMSS1 (kuvio 1D, p
> 0,05), vaikka 2 out 5 Mongolian gerbiilit olivat negatiivisia läsnäolo PMSS1Δggt
korpuksessa mahan (tuloksia ei ole esitetty).
Infektio aiheuttama tulehdus
kaikki verrokkihiiriin ja gerbiilit oli normaalia mahalaukun histomorphology kaikkina ajankohtina. Korrelaatio tulehdus tulokset ja bakteerikolonisaatiota näkyy kuvassa 1.
Verrattuna hiiriä WT-kannan infektio, infektio H. suis
rasitusta HS5cLPΔggt
yleensä aiheuttama huomattavasti vähäisempää tulehdusta sekä antrum (p
< 0,01) ja corpus (p
< 0,01), kun taas vain corpus alueella (p
< 0,01), infektio helikobakteeri
rasitusta SS1Δggt
aiheuttama vähemmän tulehdus, verrattuna nähty WT kannan tartunnan hiirillä. 6 kuukauden pi, corpus alueella 2 ulos 4 hiirten HS5cLP infektio sisälsi suuria imukudoksen aggregaatteja tai imukeräsissä mukana tuhoaminen normaalin limakalvon arkkitehtuuriin (kuvio 2A), joka ei havaittu eläimillä muista ryhmistä. Kuva 2 H &E-värjäystä mahan kohdat Helicobacter infektoiduissa hiirillä ja Mongolian gerbiilit. Edustaja mikrokuvia H &E-värjätyt leikkeet kuvassa otettiin hiiriä suun kautta inokuloitu H. suis
HS5cLP (A), H. suis
HS5cLPΔggt
(B), H. pylori
SS1 ( C) ja helikobakteeri
SS1Δggt
(D) 6 kuukauden inokulaation ja Mongolian gerbiilit suullisesti altistettiin H. suis
HS5cLP (E), H. suis
HS5cLPΔggt
(F ), helikobakteeri
PMSS1 (G) ja helikobakteeri
PMSS1Δggt
(H) 9 viikkoa istuttamisen jälkeen. Nuolet osoittavat läsnäolo tulehdussolujen, tulehduksellinen aggregaatteja, lymfosyyttinen infiltraatio, tai lymfosyyttinen follikkelia. HS: eläimet tartunnan WT H. suis
kanta HS5cLP; HSM: eläimet tartunnan H. suis
kanta HS5cLPΔggt
; SS1: eläimet tartunnan WT helikobakteeri
SS1; SS1m: eläimet tartunnan helikobakteeri
SS1Δggt
; PMSS1: eläimet tartunnan WT helikobakteeri
PMSS1; PMSS1m: eläimet tartunnan helikobakteeri
PMSS1Δggt
; WT: villin tyypin. Alkuperäinen suurennus: 100 ×.
Varten Mongolian gerbiilit, infektio HS5cLP tai PMSS1 aiheuttama vakava antrum-hallitseva gastriitti muodostumista lymfosyyttisen aggregaatteja lamina propriassa ja /tai osa-mahalaukun limakalvo (kuviot 1D, 2E ja 2G ). Merkittäviä eroja ei havaittu WT ja mutanttikanta H. suis
suhteen indusoiman tulehdusreaktion antilooppirotilla (kuviot 1D, 2E ja 2F), vaikka kaikki eläimet tartunnan rasitusta HS5cLP osoittivat tulehdusta corpus alueella , kun taas tämä oli vain tapauksessa jotkut eläimet tartunnan HS5cLPΔggt
(tuloksia ei ole esitetty). Yhdessä gerbil tartunnan H. suis
rasitusta HS5cLP, voimakas tulehdusreaktio havaittiin, jossa yli 65% pinta-alasta lamina propriassa ja submukoosan antrum oli tiheään soluttautunut tulehdussolujen sulatettu lymfaattisessa aggregaatteja ja imukeräsissä (Additional tiedosto 1).
tulehdus aiheuttama helikobakteerin
rasitusta PMSS1Δggt
antrumin gerbiilit oli lievempi verrattuna nähty WT sairastuneiden eläinten (p
< 0,05) (kuviot 1D, 2G ja 2H).
tulehdussolujen infiltraatiota
yleensä kasvua T-solujen määrä havaittiin corpus (kuvio 3A, p
< 0,05) hiirillä tartunnan H. suis
rasitusta HS5cLP ja helikobakteeri
rasitusta SS1 kaikilla kolmella ajankohtina. Verrattuna hiiriin tartunnan WT H. suis
, HS5cLPΔggt
aiheuttama alemman T-soluvaste corpus 6 kuukauden pi (p
< 0,01). H. pylori
kanta SS1Δggt
indusoi vähentää T-soluvasteen corpus alueella (p
< 0,01) verrattuna WT tartunnan saaneet eläimet, sekä 9 viikkoa ja 6 kuukautta pi (kuvio 3A). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin antrum hiirten (tuloksia ei ole esitetty). Kuva 3 kvantitatiivinen analyysi määritelty solupopulaatioiden kanssa immunohistokemiallisesti.

• Trimetopriimi-sulfametatsiinin ei parantaa paranemista rauhastilavuus mahahaava hevosilla sai omepratsolin: satunnaistettu, sokaisi, kliininen study
• Pyyhkäisyelektronimikrosko- havaintoja siili vatsa mato, Physaloptera clausa (Spirurida: Physalopteridae)