Vatsa terveys > tutkimukset > CDK-liittyvä Cullin 1 voi edistää solujen lisääntymistä ja inhiboi sisplatiinin aiheuttama apoptoosin AGS mahasyövän solulinja

CDK-liittyvä Cullin 1 voi edistää solujen lisääntymistä ja inhiboi sisplatiinin aiheuttama apoptoosin AGS mahasyövän solulinja

CDK-liittyvä Cullin 1 voi edistää solujen lisääntymistä ja inhiboi sisplatiinin aiheuttama apoptoosin AGS mahasyövän solulinja
tiivistelmä
tausta
Mahalaukun syöpä on yleinen ja erittäin tappava maligniteetti maailmassa, mutta sen synnyssä edelleen vaikeasti. Tässä tutkimuksessa keskitymme biologisiin toimintoihin CDK liittyvän Cullin1 (CAC1
), uusi geeni Cullin perheen, mahasyövän, jotka voivat auttaa meitä edelleen ymmärtää alkuperä tämän maligniteetti.
menetelmät
AGS ja MGC803 mahasyövän solulinjoissa ja GES-1 mahan limakalvon solulinjaa valittiin tutkimukseen. Aluksi CAC1
ilmauksia, jotka solulinjat tutkittiin kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR (qRT-PCR) ja Western blot tutkimukset, sitten CAC1
pieni häiritsevä RNA (CAC1
-siRNA) suunniteltiin ja transfektoitiin AGS solulinja on suhteellisen korkea CAC1
. Kun CAC1
on vaiennettu, sarja biologiset ominaisuudet AGS solujen, kuten solujen lisääntymisen, solusyklin, apoptoosin, ja ilmauksia apoptoosiin liittyvien geenien (P53
, BCL2
ja BAX
) olivat määritetään MTT, virtaussytometrialla, qRT-PCR ja western blot, vastaavasti.
tulokset
CAC1
ilmentymisen AGS tai MGC803 oli paljon suurempi kuin GES-1. Sen jälkeen CAC1
ilmentymistä tehokkaasti masentunut RNA häiriöitä AGS soluissa, merkittävää solujen kasvun estäminen tapahtui. Lisäksi osuus käsiteltyjen solujen CAC1
-siRNA lisääntyi G1 vaiheeseen ja vähenivät S-vaiheeseen, joka osoittaa G1 solusyklin pysähtymisen. Vielä tärkeämpää on, osuudet aikaisen /myöhäisen apoptoosin AGS solut parannettu cis-diaminedichloroplatinum (sisplatiini, CDDP) käsittely, mutta vielä enemmän, sisplatiinin ja CAC1
-siRNA. Mielenkiintoista, BCL2
mRNA kopiota osoitti noin 30% laskuun sisplatiinin ryhmässä, mutta laski noin 60% vuoden sisplatiinin plus CAC1
-siRNA ryhmä. Toisaalta P53
mRNA ilmaisuja saadaan lähes kaksinkertainen kasvu sisplatiinin ryhmän lisäksi viisinkertainen lisäys sisplatiiniin plus CAC1
-siRNA ryhmä, ja BAX
mRNA-tasoja oli lähes kahden ja neljän kertaiseksi augmentation, vastaavasti. Samaan aikaan, P53
, BAX
ja BCL2
oli sama muutos kuviot western blot tutkimuksia.
Päätelmät
CAC1
voi edistää soluproliferaatiota AGS mahasyövän solulinja. Lisäksi, se voi estää AGS soluja kokee sisplatiinin indusoiman apoptoosin kautta moduloimiseksi ilmauksia P53
, BCL2
ja BAX
.
Avainsanat
Mahasyöpää CDK-liittyvä Cullin1 leviämisen Cell cycle Apoptosis tausta
Mahalaukun syöpä on yksi yleisimmistä pahanlaatuisia kasvaimia, ja toinen johtava syöpäkuolemien syy maailmassa, joka vastaa yhteensä 989600 uutta tapausta ja 738000 kuolemantapausta vuosittain [1]. Yli viime vuoden aikana on ollut tasaisesti vähentynyt ilmaantuvuus ja kuolleisuus mahasyöpäriski useimmissa maissa [2], koska valtava kehitys diagnosoinnissa ja hoitomenetelmiä. Kuitenkin, mahasyöpä edelleen suuri uhka ihmisille, erityisesti kehitysmaissa [1], ja selviytymisen kaikkien Potilaiden jälkeenkään parantava kirurginen resektio ja adjuvanttihoito on alle 40% [3].
Epidemiologiset tutkimukset ovat paljastaneet useita riskitekijöitä mahasyövän, ja molekyylibiologian tutkimus osoittaa edelleen, että mahasyövän käsittää lukuisia geneettisiä ja epigeneettiset tapahtumat, joihin klusterin onkogeenien, tuumorisuppressorigeeneille, solusyklin sääntelyviranomaisten, soluadheesiomolekyylien ja DNA korjaavien geenien [4] . Kuitenkin tarkka mekanismit mahasyövän ei ole määritelty.
CDK-associated Cullin1 on uusi geeni tunnistettu kolorektaalikarsinooma. Se kattaa avoimen lukukehyksen, joka koodaa 37 kDa proteiinin 369 aminohapon [5]. CAC1
proteiini sisältää Cullin domeenin aminohappojen 137 ja 250, ja se on siten luokiteltu jäsenenä Cullin perheen E3 ubikitiinipromoottori ligaasit [5]. Histologinen tutkimukset oli perustanut mahdollista yhteyttä CAC1
ilmaisutapoja patologisia piirteitä ja kliinisen vaiheen kolorektaalisyöpää potilaista [5]. Lisäksi CAC1
, in vitro
, ilmennettiin solusyklin-riippuvaisella tavalla korkea ekspressio myöhään G1-S-vaiheessa [5]. Erityisesti, CAC1
voisi edistää solusyklin etenemisen ja stimuloida kinaasiaktiivisuutta CDK2
[5]. Kuitenkin vähän tiedetään sen ilmentymistä ja biologiset ominaisuudet mahasyövän.
Tämä tutkimus suoritettiin ilmentymisen tutkimiseksi CAC1
ja tutkia toiminto CAC1
suorittaa mahalaukun sinoomasolulinjoja. AGS solulinja valittiin malliksi tutkimukseen, koska se ilmaistaan ​​suhteellisen korkea CAC1
, sitten CAC1
ilmentyminen oli vaiennetaan RNA-interferenssi (RNAi), ja sarjan biologisten muuttujien merkitystä solujen proliferaatiota ja sykli ja apoptoosin tutkittiin vastaavasti. Tool menetelmät
Soluviljely
Ihmisen mahalaukun syövän solulinjat (AGS ja MGC803) ja mahalaukun limakalvon solulinja (GES-1) toimitti Keski laboratorio Medical College, Xi 'an Jiaotong yliopisto, Kiina. Soluja viljeltiin RPMI 1640-alustassa (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) täydennettynä 10% vastasyntyneen vasikan seerumia (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 100 kU /L penisilliiniä, 0,1 g /l streptomysiiniä, 0,3 g /l L-glutamiinia ja 0,85 g /l NaHCO 3 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO 2.
siRNA transfektio
CAC1
-siRNA (sense- GGA UGG UGC CAU AGA UCA ATT 3 ', antisense-5 ' UUG AUC UAU GGC ACC AUC CGG3 '), CAC1
negatiivinen kontrolli siRNA (NC-siRNA, sense-5 'UUC UCC GAA RTY GUC ACG UTT 3 ', antisense-5 "ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT 3 ') syntetisoitiin kemiallisesti Shanghai GenePharma Corporation (SGC, Shanghai, Kiina). Kaikki siRNA: t sekoitettiin osaksi Iipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, USA) ja transfektoitiin mukaan siRNA transfektioprotokolla. Tehokkuutta CAC1
pudotus arvioitiin qRT-PCR: llä ja western blot testejä.
MTT-määritystä
MTT: tä (3- [4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli] -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi tiatsolyylisininen indikaattoriväriaineen) kemosensitiivisyys määritys soveltaa arvioitaessa leviämisen nopeus AGS mahan soluja. Solut ympättiin pitoisuutena 5 x 10 3 solua per kuoppa 96-kuoppalevyille. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena. Soluja inkuboitiin 24 tuntia ja jaettiin viiteen ryhmään viidellä eri hoitoja (null, NC-siRNA (60 nmol /l (nM)), siRNA (30 nM), siRNA (60nm), siRNA (90nm)) 0, 24, 48, 72 ja 96 tuntia, vastaavasti. Kaksikymmentä mikrolitraa 5 mg /ml MTT (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) kuoppaa kohti lisättiin ja solut jätettiin sisällä inkubaattoriin vielä 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa, minkä jälkeen lisäämällä 150 ui DMSO: ta. Absorbanssi väristä liuosta mitattiin täysin automatisoitu multi-tunnistus mikrolevylukijalla (Polarstar Optima, BMG Labtechnologies, Offenburg, Saksa) 490 nm: ssä.
Virtaussytometrinen analyysi
Soluja (1 x 10 5-solut /kuoppa) kerättiin 6-kuoppalevyillä 24 tuntia, ja käsiteltiin eri aineilla (null, NC-siRNA, siRNA (60nm)) 48 tuntia. Sitten he kerättiin pestään 0,01 mol /l kylmää (4 ° C) PBS pyörittämällä 800 rpm, 4 ° C: ssa 8 minuutin ajan, ja sitten kiinnitettiin 4 ° C, 75% etanolilla yön. Kiinteä solut sentrifugoitiin (kuten edellä), ja pestiin jälleen PBS: llä. Sitten soluja käsiteltiin 100 ul: lla DNaasi-vapaata, tehtiin RNaasi-(10 mg /ml) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 10 minuutin ajan. Lopuksi solut värjättiin 100 ul: lla 100 ug /ml propidiumjodidia (valoherkkä), ja inkuboitiin huoneenlämpötilassa 30 minuuttia. Solut jokaisesta näytteestä sijoitettiin Falcon-putkiin ja luettiin FAC lajittelija (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Solusyklin profiilit tulkittava B-D FAC Lajittelu Cell Quest ohjelmisto.
Apoptosis analyysi
Cells (1 x 10 5 solua /kuoppa) inkuboitiin 6-kuoppaisille levyille. 24 tunnin kuluttua niitä käsiteltiin eri aineilla (nolla, sisplatiini (10 uM), sisplatiinia (10 uM) + NC-siRNA (60nm), sisplatiinia (10 uM) + siRNA (60nm)) seerumivapaassa väliaineessa 24 tuntia, sitten kerätään solut värjättiin anneksiini V /PI käyttäen Vybrant apoptoosimäärityksessä kit nro 2 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) ja analysoitiin virtaussytometrialla.
Kvantitatiivinen reaaliaikainen käänteistranskriptio-PCR
Expression ja CAC1 mahasyövän solulinjoissa
Kokonais-RNA eristettiin eri solulinjoissa (AGS, MGC803 ja GES-1) käyttäen guanidi--fenoli-kloroformilla menetelmällä (Trizol, Invitrogen, Carlsbad, USA), ja cDNA syntetisoitiin käyttämällä PrimeScriptTM 1. Strand cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, Carlsbad, USA). Alukesekvensseissä käytetään vahvistusta suunnitellut TaKaRa (Takara Bio Inc., Shiga, Japani) luetteloon seuraavasti: forward-aluke 5'-GCA GCA TAT TCA GAA AGT TCA GA-3 '; käänteinen aluke 5'-CAT TTA CAG CCT AAT GCC TTT ACT-3 '. β-Actin
alukkeesta 5'- TGG CAC CCA GCA CAA TGA -3 '; reverse-aluke 5'- CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC -3 '. Alukkeita käytettiin säännöllisesti PCR-reaktioissa, joissa cDNA soluista, jotta voidaan arvioida niiden asianmukaisen suunnittelu ja synteesi. Tämän jälkeen PCR-tuotteet sekvensoitiin ja niiden samankaltaisuus haluttuun nukleotidisekvenssien vahvistettu. Suhteellinen määrä mRNA määritettiin käyttäen SYBR Green PCR Master Mix (AB, Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA), jossa geeni-spesifisiä alukkeita CAC1
tai β-Actin
. Kaikki vaiheet suoritettiin valmistajan protokollan. Reaaliaikainen PCR-reaktiot suoritettiin ABI 7500 -lämpösyklilaitteella (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia, USA) kanssa BioRad iQ5 ja MyiQTM Reaaliaikainen PCR Detection System (BioRad Laboratories, Hercules, Kalifornia, USA). Kolme riippumatonta PCR suoritettiin kustakin RT näytteestä. Ekspression CAC1
mRNA kussakin näytteessä normalisoitiin vastaan ​​β-aktiini
ja ilmentymisen taso laskettiin käyttäen ΔΔCT (delta delta kynnys sykli) menetelmällä.
Ilmentyminen apoptoosin liittyvien geenien AGS solulinja
RNA: n eristys ja cDNA-synteesi suoritettiin kuten edellä. Sarja alukkeet suunniteltiin ja syntetisoitiin Takara lukien P53
(eteenpäin-5 '- CCA CCA TCC ACT ACA ACT ACA T-3 ', reverse-5 '- AGG ACA GGC ACA AAC ACG-3 '), BCL2
(eteen-5 ' - CAA ATG CTG GAC TGA AAA ATT GTA-3 ', reverse-5 ' - TAT TTT CTA AGG ACG GCA TGA TCT-3 '), BAX
(eteen-5 ' - GAC ACC TGA GCT GAC CTT GG-3 '; reverse-5 ' - AGG AAG TCC AGT GTC CAG C-3 ) ja β-Actin
(eteenpäin 5'- TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3 "; kääntää 5 '- CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC -3 ') geenejä. Kuten edellä on esitetty reaaliaikaisen PCR suoritettiin kolme kertaa. PCR-tuotteet havaittiin mittaamalla emittoivat fluoresenssia lopussa kunkin reaktion aikana. Kynnys sykli vastaa jaksojen määrä tarvitaan havaitsemiseksi fluoresenssin signaali vertailutason yläpuolella. Β-Actin
geeni toimi sisäisen valvonnan reaktion.
MRNA ekspressiotasoja laskettiin 2 -ΔΔCT menetelmä ja ilmaistaan ​​suhteellisen kvantifioinnin yksiköissä. Yksityiskohtaisesti, kynnys sykliä housekeeping-geenin β-aktiini
ja kohdegeenien BCL2
, BAX
ja P53
määritettiin kullekin näytteelle ja kullekin ajanjaksolle. CT-arvot normalisoitiin (ACt) vähentämällä ekspressiotasot viitteen geenin β-aktiini
vastaavasta ekspressiotasot BCL2
, BAX
ja P53
kussakin näytteessä. Normalisoitu geenin ilmentymiseen käsiteltyjen AGS solut analysoitiin suhteessa niiden vastaavia käsittelemättömiin soluihin, joka toimi kalibraattori näytettä (ΔΔCT).
Western blot tutkimukset
Viisikymmentä mikrogrammaa kokonais-proteiinin AGS solulinja erotettiin 10% Trisglycine SDS-polyakryyliamidigeelillä ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle (BioRad, Hercules, California, USA). Blotti koetettiin hiiren monoklonaalisia vasta-aineita, mukaan lukien anti-CAC1
(GeneTex, Irvine, Kalifornia, USA, 1: 1500), anti-β-Actin
(Santa Cruz, CA, USA; 1: 5000), anti-P53
(Santa Cruz, CA, USA; 1: 2000), anti-BCL2
(Santa Cruz, CA, USA; 1: 2000), ja anti-BAX
(Santa Cruz, CA , USA; 1: 2000). Vasta-aineen sitoutumista havaittiin käyttäen Gel Blot Imaging Systems (Syngene- G: BOX, Cambridge, UK) mukaan valmistajan protokollaa.
Tilastolliset analyysit
Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS 13.0 ohjelmistoa (http: //www -01. iBM. com /ohjelmisto /analytics /SPSS /). Kukin määritys suoritettiin vähintään kolme kertaa. Tiedot ilmaistiin keskiarvona ± keskihajonta, ja Yksisuuntainen ANOVA-testi (kaksipuolinen) suoritettiin sen määrittämiseksi, erojen merkitsevyyden useita vertailuja. Tulokset katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä P
& lt; 0,05.
Tulokset
Differential ilmentymisen CAC1
mahasyövän ja limakalvon solulinjoissa
CAC1
mRNA: n ekspressio arvioitiin reaaliaikainen RT-PCR kolmessa solulinjoissa. On selvää, CAC1
on ilmaistu kussakin tarkastellaan solulinjoja (kuvio 1A). Kuitenkin AGS ja MGC803 solulinjat osoittivat korkeampaa CAC1
mRNA kuin GES-1-solulinjassa (1,0000 ± 0,0000 ja 0,9507 ± 0,0176 versus
0,4340 ± 0,0414, P
& lt; 0,05). Lisäksi, CAC1
proteiinin ilmentyminen western blot tutkimukset osoittivat samat muuttuva suuntaus kuin CAC1
mRNA: ta (kuvio 1A). Kuva 1 CAC1 ilmentymistä ihmisen mahasyövän ja limakalvon solulinjoissa. (A) Reaaliaikainen käänteistranskriptio (RT) -PCR ja western blot-analyysi CAC1
ilmaisun AGS, MGC803 ja GES-1 solulinjoissa (* edustaa P
& lt; 0,05 välillä GES-1 solulinja ja muut solulinjat). (B) CAC1
ilmentyminen tehokkaasti masentunut 60nm CAC1
-siRNA vuonna AGS solulinjassa mRNA- ja proteiini taso (* edustaa P
& lt; 0,05 välillä kontrolliryhmän ja CAC1
-siRNA ryhmä).
Endogeeniset ilmentymistä CAC1
oli vaiennetaan RNAi tekniikalla
Ohimenevä transfektio AGS solujen CAC1
-siRNA oligot (60nm) suunniteltu vastaan ​​CAC1
sekvenssi esti tehokkaasti ilmaus CAC1
. CAC1
mRNA: n ekspressio tutkittiin reaaliaikaisella RT-PCR: llä. Kuten odotettua, mRNA-tasolla ja CAC1
oli vähentynyt huomattavasti CAC1
-siRNA ryhmä (1,0000 ± 0,0000 versus
0,3583 ± 0,0244, P
& lt; 0,05), mutta ei osoittanut mitään merkitsevää eroa ohjaus ja NC-siRNA ryhmät (1,0000 ± 0,0000 versus
0,9597 ± 0,0407, P
& gt; 0,05) (kuvio 1 B). Samaan aikaan CAC1 -proteiiniekspressio myös masentunut jälkeen siRNA hoidon Western blot tutkimukset (kuvio 1 B).
CAC1
hiljentäminen estää soluproliferaatiota AGS solulinjassa
Tutkiakseen roolin CAC1
pelaa säätelyyn solujen lisääntymistä, AGS solut osoitettu lyhytaikaisella transfektiolla kanssa CAC1
-siRNA kolmen eri annoksia (30 nM, 60nm ja 90nm) tehtiin MTT-määritys. Neljän päivän sisällä, CAC1
hiljentäminen, oli selkeä estävä vaikutus soluproliferaatioon mukaan eri annoksia CAC1
-siRNA (kuvio 2). Optiset tiheydet (OD) kontrolliryhmän, NC-siRNA ryhmä ja 30 nM CAC1
-siRNA ryhmä osoitti merkittävää eroa toisiinsa (P
& gt; 0,05), mutta olivat korkeammat kuin on 60 nm ja 90nm CAC1
-siRNA ryhmissä (P
& lt; 0,05). Mielenkiintoista, solut käsiteltiin 60nm ja 90nm CAC1
-siRNA osoittivat lähes identtiset OD alusta loppuun (P
& gt; 0,05). Kuvio 2 Solujen kasvu inhiboituu seuraavan CAC1 hiljentäminen. AGS-soluja transfektoitiin ohimenevästi null, NC-siRNA ja kolme pitoisuudet CAC1
-siRNA neljä päivää, vastaavasti. Kasvuvauhdin soluista määritettiin MTT määrityksissä.
Solusyklianalyysiä
kontrolliin verrattuna, osuus käsiteltyjen solujen CAC1
-siRNA kasvoi 28% tai niin G1 /G0 vaihe (45.33 % ± 0,82% vs.
73,23% ± 3,04%, P
& lt; 0,05), ja väheni noin 36% S-vaiheessa (41,07% ± 1,07% vs.
5,40% ± 5,83%, P
& lt; 0,05), ilman merkittävää muutosta G2 /M vaiheessa (13,61% ± 0,46% vs.
21,37% ± 2,88%, P
& gt; 0,05) (kuva 3). Nämä tulokset osoittavat, että CAC1
voi edistää solusyklin etenemistä AGS solujen kautta G1 /S siirtyminen. Kuvio 3 knockdovvn CAC1- aiheuttama G1 solusyklin pysähtymisen AGS solulinjassa. Solusyklin analyysi AGS käsiteltyjen solujen kanssa tai ilman CAC1
erityisiä siRNA virtaussytometrialla. Solujen osuus oli merkittävästi kohonnut G1 vaiheessa, kun pelkistetään S-faasissa, kun käsiteltiin CAC1
-siRNA (* edustaa P
& lt; 0,05 välillä kontrolliryhmän ja CAC1
-siRNA ryhmä).
knockdovvn CAC1
lisää sisplatiinin indusoiman apoptoosin
AGS solut jaettiin neljään koeryhmään: kontrolliryhmään, sisplatiini-käsitelty (10 uM) ryhmä, sisplatiinipiikin plus NCsiRNA ryhmä, ja sisplatiinin plus CAC1
-siRNA (60nm) ryhmä. Verrattuna verrokkiryhmään, osuudet aikaisen /myöhäisen apoptoosin oli tehostettu sisplatiinihoitoon, mutta vielä enemmän sisplatiinin plus CAC1
-siRNA (2,01% ± 0,78% vs.
8,87% ± 3,65% vs.
16,69% ​​± 3,15% /0,57% ± 0,25% vs.
3,89% ± 0,15% vs.
10,01% ± 0,09%, P
& lt; 0,05) (kuvio 4A ja 4B), joka merkitsi, että knockdovvn CAC1
nopeutunut sisplatiinin indusoiman apoptoosin. Kuva 4 CAC1 hiljentäminen parannettu sisplatiinin aiheuttaman apoptoosin AGS solulinjassa. (A) vaikutukset sisplatiinin yksinään ja yhdessä NC-siRNA /CAC1
-siRNA aikaisin ja myöhään apoptoosin AGS soluja (* edustaa P
& lt; 0,05 välillä kontrolliryhmän ja käsitellyissä ryhmissä; #represents P
& lt; 0,05 välillä sisplatiini (CDDP) ryhmä ja käsiteltyjen ryhmien). (B) Apoptosis kuvioita AGS solut analysoitiin virtaussytometrialla.
Expression profiilit apoptoosiin liittyvien geenien
mRNA-tasot on CAC1
, BCL2
, BAX
ja P53
tutkittiin qRT-PCR. Inkubointi AGS solujen 10 uM sisplatiinin ja /tai 60nm CAC1
-siRNA 24 h teki mielenkiintoisen mRNA profiileja (kuvio 5A). Alle sisplatiinihoitoon, CAC1
mRNA: n ekspressio huomattavasti lisääntynyt, mutta laski matalalle tasolle, kun CAC1
-siRNA lisättiin samanaikaisesti (1,0000 ± 0,0000 versus
2,1578 ± 0,2222 versus
0,3967 ± 0,0078, P
& lt; 0,05). Verrattuna kontrolliryhmään, BCL2
mRNA kopiota osoitti 30%: n lasku sisplatiinipiikin ryhmässä, mutta laski noin 60% vuoden sisplatiinin plus CAC1
-siRNA ryhmä (1,0000 ± 0,0000 versus
0,7090 ± 0,0210 versus
0,4030 ± 0,0171, P
& lt; 0,05). Kääntäen, P53
ja BAX
transkriptipitoisuuksissa käsiteltyjen ryhmien huomattavasti parempaa. Verrattuna verrokkiryhmään, P53
lauseke saadaan lähes kaksinkertainen kasvu sisplatiinia yksin ryhmä, lisäksi viisinkertainen lisäys sisplatiiniin plus CAC1
-siRNA ryhmä (1,0000 ± 0,0000 versus
3,0187 ± 0,1738 versus
5,9957 ± 0,3926, P
& lt; 0,05); BAX
mRNA oli lähes kaksi- ja nelinkertaiseksi lisäys (1,0000 ± 0,0000 versus
3,0237 ± 0,2581 versus
4,9897 ± 0,2923, P
& lt; 0,05), tässä järjestyksessä. Kuvio 5 Expression profiilit apoptoosiin liittyvien geenien vasteena sisplatiinin yksin tai CAC1 -siRNA hoitoja. (A) Reaaliaikainen käänteistranskriptio (RT) -PCR analyysi CAC1
, P53
, BAX
ja BCL2
mRNA ilmentymistä AGS soluissa (* edustaa P
& lt; 0,05 välillä CAC1
-siRNA ryhmä ja käsiteltyjen ryhmien #represents P
& lt; 0,05 välillä sisplatiini (CDDP) ryhmä ja käsiteltyjen ryhmien). (B) Western-blottaus-analyysi CAC1
, P53
, BCL2
ja BAX
ilmentymisen AGS-soluissa.
Sitten western blot kokeita havaita proteiinin tasot näiden geenien jälkeen CAC1
knockdown. Rinnakkain edellä mainitun mRNA muuttuu, BAX
ja P53
olivat selvästi voimistunut taas BCL2
säädeltiin vähentävästi proteiinitasolla (kuvio 5B).
Keskustelu
ubikitiinistä proteasomin järjestelmä näyttelee keskeinen asema säilyttää tasapaino normaalin kasvun ja hallitsematon leviäminen valvomalla runsaasti monenlaisia ​​solun proteiinien [6]. Cullin perhe ubikitiinipromoottori ligaaseina perinteisesti koostuu CUL1, 2, 3, 4A, 4B, 5
ja 7
, on suurin luokka RING-tyyppinen E3 ligaaseina (CRL) [6]. Ilman luontainen katalyyttinen aktiivisuus, CULLINS olla tukirakenteita, että kokoamisen helpottamiseksi multimeeristen E3-ligaasia komplekseja ja siirtää ubikitiinin E2-konjugointientsyymiä alustaan. Cullin-välitteisen substraatin hajoamisen määrää erilaisia ​​soluprosesseja, kuten proliferaatiota, erilaistumista, ja apoptoosin. Kun solu sääntelymekanismit of Cullin kohtaavat huonosti tai häiriöiden, kertyminen onkoproteiineja tai liiallista hajoamista tuumorisuppressoreilla esiintyy väistämättä, mikä saattaa aiheuttaa solujen pahanlaatuisiksi ja kasvaimen kehittymisen [6]. Erityisesti cullin1
, kaikkein tunnettu jäsen Cullin perhe, oli osoittautunut on tiiviisti mukana mahasyövän, ja sen yliekspressio ennustaa huonon ennusteen potilailla mahalaukun syöpä [6, 7].
Ekspressioprofiileja syöpään liittyvien geenien heijastavat osittain niiden biologiset ominaisuudet patogeneesissä syövän. Koska uusi jäsen Cullin perheen, CAC1
ilmaisu kuviot on laajasti tutkittu aiemmassa tutkimuksessa [5]. Käyttäen cDNA-kirjaston analyysi, CAC1
ekspressio havaittiin normaali maha, ohutsuoli, paksusuoli, maksa, keuhkot, munuaiset, lihas, sydän, rintarauhasen, kohtu, aivot, perna, imusolmuke, joilla on korkea paksusuolessa ja rintarauhasen [5]. Western blot testien lisäksi havaittu CAC1
proteiinia isännässä normaalien ja syöpäsolujen linjojen [5]. Mitä tulee Tutkimuksessamme AGS ja MGC803 mahasyövän solulinjoissa oli korkeampi CAC1
ilmaisu kuin GES-1 mahalaukun limakalvon solulinjaa, jotka osoittavat, että CAC1
voi olla aktiivinen rooli mahasyövän.
geenien RNA interferenssin on tehokas menetelmä analysoida geenin toiminnan [8]. Täällä me onnistuneesti transfektoitujen NCsiRNA ja kolme pitoisuudet CAC1
-siRNA osaksi AGS soluihin. MTT-analyysit osoittivat, että leviämisen mahdollisuudet AGS solujen voimakkaasti inhiboi 60nm ja 90nm CAC1
-siRNA samassa määrin, mutta ei vaikuttaa 30 nM CAC1
-siRNA tai NC-siRNA. Oli ilmeistä, että CAC1
voisi vaikuttaa myönteisesti soluproliferaation mahasyövän, mikä oli sopusoinnussa aikaisempien tutkimusten HeLa solulinjassa [5]. MTT tutkimukset, HeLa-solut, jotka ilmentävät Flag-CAC1
tehtiin korkeampi leviämisen kyky kuin valetransfektoiduilla ohjaus solut ja solut, joita käsiteltiin CAC1
-siRNA osoitti merkitsevästi esti kasvua [5]. Mitä enemmän, reaaliaikainen RT-PCR: llä ja western blot-analyysit vahvistivat, että ilmentyminen CAC1
oli efficaciously estetty 60nm CAC1
-siRNA. Yhdessä 60nm määritettiin sopivin kokeellinen annos RNAi myöhemmissä tutkimuksissa.
Pääsääntöisesti, normaali solujen lisääntymisen riippuu asianmukaisesti ja tehokkaasti solusyklin menetelmällä, päällekkäisyyttä ja siirto geneettisen tiedon yhdestä solusta sukupolvelta. Toisin sanoen, vapautuminen solujen lisääntymistä aina sijaitsee epänormaali solusyklin. Under CAC1
-silencing olosuhteet, virtaussytometria tutkimuksessamme paljasti koholla osuus solujen G1 /G0 vaiheen ja alennettua solujen S-vaiheessa. Pohjimmiltaan CAC1
knockdown aiheuttama G1 solusyklin pysähtymisen AGS soluissa, mikä oli yhdenmukainen tulokset HeLa-solulinjasta [5]. CAC1
kykeni myös sitoutumaan CDK2
ja edistää sen kinaasiaktiivisuuden on G1 /S-vaiheeseen siirtymisen ilman huomattavasti muuttamatta ilmauksia cyclinA
, sykliini
, cyclinD1
, CDK2
, RB
, PTEN
, ja niin edelleen. [5] Oletetaan, että CAC1
masennus vaimentaa aktiivisuus CDK2
ja keskeyttää G1-S-siirtymä.
Apoptoosi on yksi tärkeimmistä biologisten ilmiöiden tunnusomaista sarja muutoksia solun morfologiassa [9]. Lisäksi apoptoosin konsertti soluproliferaation muodostaa ratkaisevan tasapainotus mekanismi, joka hallinnoi useita fysiologisia menettelyjä, kuten kudosten homeostaasin ja normaalin kehityksen [9]. Alle patologinen olosuhteissa poikkeava apoptoosi yleensä vaikuttaa paljon aloittamista ja etenemistä syövän [10-12] ja jopa vaikuttaa herkkyyttä syöpäsolujen hoitotoimenpiteiden [13].
Yksiselitteinen aktiivisuus CAC1
solukierron asetus toi esiin mahdollisuuden, että se on enemmän tai vähemmän, mukana prosessissa apoptoosin. Nykyisessä tutkimuksessa, osuus aikaisin /myöhään apoptoottiset solut lisääntyneet sisplatiinihoitoon, mutta kasvoi vielä enemmän, kun CAC1
ilmentyminen oli samanaikaisesti inhiboitui RNAi. Toisin sanoen, apoptoottista indeksit sisplatiinin ja CAC1
-siRNA ryhmä saadaan merkittävä kasvu verrattuna niihin entisen kolmeen ryhmään ja ehjät CAC1
. Kumulatiiviset tiedot viittaavat siihen, että CAC1
voivat heikentää syövän vaikutusta sisplatiinin vastustamalla sisplatiinin indusoiman apoptoosin.
Asetus apoptoosin kuitenkin perustuu verkon anti ja proapoptoottiset molekyylejä, kuten BCL2
perheen [14]. BCL2
(B-solujen KLL /lymfooma 2) on esikasvaintekijän sijaitsee geenivirhe 18q21.3, joka koodaa antiapoptoottisten 26 kDa proteiinia, joka sisältää neljä BH verkkotunnuksia (BH1 ~ BH4)) [15]. Se voi estää vapautumisen sytokromi c: n päässä mitokondrioita, mikä kumoamisesta kaspaasien aktivaatio ja lopulta inhiboimaan apoptoosia [16]. Mukaan varhainen tutkimusten yliekspressio BCL2
ajaa soluja kohti pahanlaatuisiksi [17] ja ennustaa ennustetta monissa maligniteettien [18-22]. Erityisesti mahasyövän, usein ilmaus BCL2
geeni aina tapahtunut pahanlaatuisten kudosten [23-25]. Korkea ilmentymisen tasoilla BCL2
geeni, vaikkakin korreloi vähemmän aggression mahasyöpä [26], oli paljon tekemistä lääkeresistenssin syöpäsolujen [27].
BAX
(BCL2
liittyvä X-proteiini) -geeni sijaitsee ihmisen geenivirhe 19q13.3-q13.4 [28]. Sen 21-kDa proteiinia koodaava, erityisesti, toimii proapoptoottiset jäsenenä BCL2
perhe. BAX
proteiini koostuu kolmesta BH domeeneja (BH1-, BH2- ja BH3) ja jakaa paljon homologiaa BCL2
proteiinia. Todellakin, BAX
proteiini toimii estäjänä BCL2
nopeuttaa apoptoottisen solukuoleman, muodostamalla BAX
/BCL2
kompleksit tai kilpailemalla muiden BCL2
tavoitteet [29]. Yliekspressio BAX
geeni oli negatiivinen vaikutus solujen kasvuun ihmisen mahasyövän, johtuen apoptoosin ja parantamiseksi solun kemosensitiivisyys [30]. Päinvastoin, tukahduttaminen BAX
geenin ilmentyminen indusoitiin tuumorigeneesiä mahalaukun epiteeli [23].
Sisplatiini on eräänlainen kemoterapeuttisen aineen laajalti käytetty kiinteiden maligniteetteja, mukaan lukien syöpään. On yleisesti hyväksytty, että sen pääasiallinen sytotoksinen vaikutus on DNA-vaurioita ja sen jälkeen apoptoosin induktion [31], joten varianssit apoptoosin liittyvien geenien sisplatiinin käsitellyissä soluissa penetratingly peili mekanismeista sisplatiinin indusoiman apoptoosin. Mitä Tutkimuksessamme CAC1
ilmentyminen voimistuvan sisplatiinihoitoon, mutta oli merkittävästi vaimentua siRNA hoito huolimatta edellinen sisplatiinilla. Lisäksi taustalla kasvu sisplatiinin indusoiman apoptoosin, joka seuraa CAC1
hiljentäminen ovat samanaikaisesti geenin ilmentymisen muutoksia, mukaan lukien säätelyä P53
ja BAX
sekä downregulation BCL2.
Nämä vaikutukset viittaavat siihen, että CAC1
vahvistaa sisplatiinin indusoiman apoptoosin ilmentymisen moduloimiseksi BCL2
, BAX
ja P53
.
Kuten edellä on mainittu, BCL2
on näennäisesti sijaitsee lähentymistä pari apoptoottisia reittejä, ja suhde BCL2
ja BAX
proteiini näyttää olevan lopullinen ratkaiseva siitä tulee solu toteutusvaiheessa [31]. Itse asiassa, se on BCL2
/BAX
suhde, joka ohjaa solujen herkkyys apoptoottisiin ärsykkeisiin [32, 33]. Prosessissa sisplatiinin indusoiman apoptoosin, CAC1
voivat suojella AGS soluja apoptoosin muuttamalla BCL2
/BAX
suhde, sillä CAC1
Silencing nosti esiin voimakas kasvu BAX
ja laskua BCL2
, mikä edisti esiintyminen solun apoptoosin.
Mielenkiintoista, P53
geenin AGS soluissa voimistunut kanssa sisplatiinihoitoon, erityisesti synkronimoottori tukahduttaminen CAC1
. On hyvin tunnettua, että P53
on tärkeä rooli hallinnassa solusyklin ja apoptoosin. DNA-vaurioita, jotka johtuvat sisplatiinin voivat stimuloida ilmaus P53
proteiini, joka johtaa molempien ilmentymisen loppupään P21
proteiinia ja G1 solukierron pysähtymisen [34]. Jos kohtaavat korjaamatonta DNA-vaurioita, P53
proteiini laukaisee ohjelmoidun solukuoleman [31]. Kaikki kirjoittajat luettu ja hyväksytty lopullinen käsikirjoitus.

Other Languages