Palkinnot mahasyövän geeniekspression allekirjoituksia peräisin laser kaapata mikrodissektion versushistologic macrodissection

Palkinnot mahasyövän geeniekspression allekirjoituksia peräisin laser kaapata mikrodissektion versus
histologinen macrodissection
tiivistelmä
tausta
Mahasyöpää näytteistä saadaan histologisen macrodissection sisältävät suhteellisen suuren strooman sisältöä, joka voi vaikuttaa merkittävästi geeniekspressioprofiilien. Erot geenin ilmentyminen allekirjoituksen peräisin macrodissected mahasyövän näytteitä ja allekirjoitus saadaan eristetty mahasyöpä epiteelisolujen samasta koepaloja käyttäen laser-capture mikrodissektion (LCM) arvioitiin niiden mahdollisen kokeellisen harhat.
Menetelmät
RNA eristettiin pakastetusta kudosnäytteistä mahasyövän koepaloja 20 potilasta käyttäen sekä histologisen macrodissection ja LCM tekniikoita. RNA LCM sovellettiin uutta kierrosta T7 RNA vahvistusta. Expression profilointi tehtiin käyttämällä Affymetrix HG-U133A taulukot. Tunnistettujen geenien ilmentymisessä allekirjoituksia kustakin kudoksesta käsittelymenetelmän verrattiin joukko geenejä sisällä kromosomialueita todettu satamaan kopioluvun poikkeamia kasvain näytteistä array CGH ja proteiineihin aiemmin tunnistettu olevan yli-ilmentynyt mahasyövän.
tulokset
Geenit osoitettu olevan lisääntynyt kopiomäärä mahasyövän todettiin myös yliekspressoituvan näytteistä saadaan macrodissection (LS P
arvo < 10 -5), mutta ei array data generoidaan käyttämällä mikrodissektion . Joukko 58 aiemmin havaittujen geenien yli-ilmennetään mahasyövässä myös rikastunut geenin allekirjoituksen tunnistaa macrodissection (LS P
< 10 -5), mutta ei allekirjoitusta tunnistaa mikrodissektion (LS P
= 0,013). Sen sijaan, 66-geenit aikaisemmin raportoitu ali-ilmentynyt mahasyövän rikastuneet geenin allekirjoitus tunnistetaan mikrodissektion (LS P
< 10 -5), mutta ei allekirjoitus tunnistetaan macrodissection (LS P
= 0,89).
Johtopäätökset
kasvain näytteenottotekniikka jännittää microarray tuloksia. LCM voi olla herkempi keräämiseen ja käsittelyyn menetelmä potentiaalisten tuumorisuppressorigeenin ehdokkaita mahasyövässä käyttämällä ilmaisua profilointia.
Taustaa
Merkittävä tavoite mikrosiruanalyysi on tunnistaa eri tavalla ilmaistuna geenien osajoukkoja kliinisen näytteet vastaamaan erityisiä hoitomuotojen kasvaimen alatyyppejä. Kuitenkin, kvantitatiivinen ilmentymisen erilaisia ​​analyysi syövän kliininen näytteitä, joilla on korkea strooman pitoisuus on haastavaa, koska suhde epiteelikasvainsolut stroomasoluihin voi vaihdella suuresti. Kontaminoivia strooman voi hämmentää microarray-pohjainen ilmaisun ja kopion numero analyysejä. Laser capture mikrodissektion (LCM) on arvokas tekniikka, joka mahdollistaa yhden eristää epiteelisolut stroomasolut, mikä rikastuttaa varten epiteelin sisältöä. Näytteen määrän ja RNA saadaan LCM on usein varsin rajallinen, kuitenkin, ja vaatii vahvistusta vaihe tuottaa riittävästi materiaalia microarray analyyseja. Tämä vahvistus prosessi voi bias tuloksia ja johtaa vinossa joukko erilaisesti ilmaistaan ​​geenien [1]. Histologinen macrodissection (otetuista näytteistä kudosleikkeiden ohjaavat mikroskooppinen analyysi värjätty sarja jakso) tarjoaa suuremman määrän näytemateriaalin verrattuna LCM, jotka voivat tarpeettomaksi ylimääräisen kierroksen RNA vahvistusta. Kuitenkin macrodissected näytteet sisältävät huomattavasti enemmän stroomasolulinja sisältöä kuin näytteet saadaan mikrodissektion.
Aiemmat tutkimukset ovat verranneet näitä kahta kudosta käsittelymenetelmiä kliinisten syöpänäytteissä. Saatujen tutkimustulosten perusteella 14 peräsuolen adenokarsinooma näytteitä, Bruin ym
. suositaan macrodissection yli mikrodissektion koska suhteellisen pieni osuus strooman komponenttien macrodissected näytteet tämän kasvaimen tyypistä ja esijännitetty geenin ilmentymisen tulokset mikropaloitelluista näytteistä, koska vahvistus RNA tarvitaan näiden näytteiden [2]. Toisaalta, Klee et al
. ehdotti, että mikrodissektion profilointi yksilöimään useita erilaisesti ilmaisi geenien ei muuten löydy käytettäessä pehmopaperikoneen näytteenotto, saatujen tietojen perusteella 10 keuhkon adenokarsinooman ja 6 vieressä normaali näytteet [3]. Nämä tutkimukset rajoitti pienestä otoksesta, ja siksi vaativat lisävalidointia. On myös epäselvää, onko geenit tunnistetaan yksilöllisesti käyttäen mikropaloitelluista näytteet edustavat hyödyllisiä biomarkkereita. Bias johtuvat RNA vahvistus on verrattava eduksi rikastaa näytteiden epiteelin sisällön Harkittaessa onko mikrodissektion on edullista ilmentymisen profilointiin kasvainten korkea strooman sisältöä, kuten maha- tai haiman adenokarsinooman.
Mikrodissektiomenetelmiä on erityisen hyödyllinen rikastamiseksi mahalaukun syövän saadut kasvainsolut endoskooppinen biopsianäytteissä, erityisesti diffuusi-tyypin mahalaukun syövän, joka koostuu hajallaan kasvainsolujen sekoitetaan tulehdussoluja ja fibroosia. Lasku ilmaantuvuus mahakarsinooman US tällä vuosisadalla näyttää olevan pääosin peräisin laskua suoliston leesioita, kun taas esiintyminen diffuusi tyyppi uskotaan pysyneen samana [4]. Näytteiden saatu LCM, Wu et al
. raportoitu että pahanlaatuisia versus hyvänlaatuisten maha- epiteelisolujen voitaisiin erottaa tarkkuudella 99% perustuen 504 geeniä ennustaja [5]. Tämä ennustaja sisältyy tunnettuja geenejä ilmaistu mahalaukun epiteelin lukien Trefoil tekijät 1, 2, ja 3 [5]. Käyttämällä LCM, Jinawath ym
. tunnistettu 46 geenejä, jotka voivat edustaa erillisiä mole- allekirjoitukset kaksi histologista tyyppiä mahasyövän - diffuusi-tyyppi ja suoliston-tyypin syöpien [6]. Ei kuitenkaan ole tehty tähän mennessä suoraan vertaamalla macrodissection vs
. LCM menetelmiä käyttäen samoja mahasyövän näytteistä.
Tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet arvioimaan eroja ekspressioprofiileja peräisin samasta kasvaimia, jotka käsiteltiin sekä macrodissection ja LCM varten microarray analyyseja. Ottaen huomioon vaikeudet validointi kaikkien differentiaalisesti ilmentyvien geenien tunnistettiin käyttäen kunkin näytteen keräämisen, vertasimme identifioitujen geenien kautta microarray analysoi proteiinien kanssa, joiden tiedetään yliekspressoituvan mahasyövässä. Lisäksi olemme määritettävä, onko geenien ilmentymistä yksilöity kunkin allekirjoituksen korreloi muutoksiin geenin kopioluku jotka tunnistettiin joukko vertaileva genominen hybridisaatio (CGH) samasta kasvaimia. Aiemmat tutkimukset mahalaukun syövän ovat osoittaneet korkea korrelaatio array CGH ja ilmaisun array data [7]. Kopioi numero muutoksia arvioitiin käyttämällä macrodissected kasvaimen DNA välttääkseen bias koko perimän DNA vahvistusta. Olemme edelleen määrätietoisesti onko geeni allekirjoitukset saimme kustakin näytteestä keruu ja käsittely menetelmä rikastettiin proteiineja, jotka on aiemmin raportoitu väärin säädellystä geenien mahasyövässä. Tuloksemme osoittavat, että LCM menetelmä on herkempi tunnistaa geenejä, jotka ovat ali-ilmentynyt syövän verrattuna normaaliin kudokseen (mahdolliset tuumorisuppressorien), kun taas macrodissection tunnistaa useampia geenejä, jotka ovat yli-ilmentynyt syövän. Siksi macrodissection ja LCM mikrodissektion on tarpeellista tutkimiseen eri osa syövän biologian. Tool Menetelmät
Potilaat
Kaksikymmentä potilasta, jotka analysoitiin tässä tutkimuksessa on osa 96 potilaalla, jotka osallistuivat tutkimuksen, ja joiden näytteet käytettiin ilmaisua harjoitussetti kehittää chemo-vasteen ennustaja [8]. Osa ilmaisun ja CGH array tietoja heidän macrodissected näytteistä on aiemmin raportoitu [8, 9]. Näytteen keräys, käsittely ja seuranta tehtiin mukaisesti protokollan hyväksymä Institutional Review Board (IRB) National Cancer Center Hospital Goyang, Korea (NCCNHS01-003). Kaikki potilaat allekirjoitti IRB-hyväksytty tietoisen suostumuksen muodossa. Kelpoisuus tutkimukseen osallistumiseen mukana seuraavat parametrit: 1) ikä ≥ 18 vuotta; 2) histologisesti varmennettu mahalaukun adenokarsinooman; 3) kliinisesti dokumentoituja kaukainen etäpesäke; 4) ei ole aikaisempaa tai samanaikaista pahanlaatuisia kasvaimia kuin mahasyöpä; 5) ei ole aiempaa kemoterapiaa, joko adjuvanttia tai palliatiivinen; ja 6) riittävä tehtävä kaikkien tärkeimpien elinten. Potilaat saivat sisplatiinia 60 mg /m 2 IV päivänä 1 ja fluorourasiilia 1000 mg /m 2 IV päivinä 1-5 of 3 viikon aikataulu.
Tissue käsittely
Ennen macrodissection, kasvain näytteet oli mediaani kasvain ytimet 50% (kvartiiliväli, 30-60%). Macrodissection suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [10]. Macrodissection johtaa keskimäärin 60% kasvaimen ytimien ylhäällä dian (kvartiiliväli, 60-72,5%). Sillä mikrodissektion, kasvain ja normaalin kudoksen näyte kryoleikkeet leikattiin 10 um, ja säilytettiin jäädytettynä -80 ° C: ssa. Dioja oli kuivattu käyttäen nukleaasitonta HistoGene (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) reagenssit mukaan valmistajan suositusten. Mikrodissektion suoritettiin käyttäen PixCell II (Arcturus Bioscience, Mountain View, CA). Kuivuminen ja LCM rajoittui 15 minuuttia tai vähemmän kustakin näytteestä kerätään. Kaikkiaan 10.000 laser laukausta (spot koko 15 pm halkaisijaltaan) kerättiin CapSure Macro LCM Caps jokaisesta näytteestä. RNA eristettiin käyttäen PicoPure RNA: n eristäminen Kit (Molecular Devices). Lyhyesti, epiteeli- soluja inkuboitiin 50 ul: aan uuttopuskuria 0,5 ml mikrosentrifuugiputkeen 42 ° C: ssa 30 minuutin ajan. DNaasia (QIAGEN, Valencia, CA) käsittely suoritettiin suoraan puhdistus sarakkeessa, ja RNA eristettiin käyttäen eluutiotilavuus 8 ui (Molecular Devices). Viisi ui RNA mikropaloitelluista solupopulaatioiden muutettiin biotinyloitu, antisense-cRNA tavoite, käyttäen Affymetrix kahden syklin merkintöjä menetelmällä (Santa Clara, CA). Kaikki biotinyloitu tavoitteet olivat hajanaisia ​​ja 15μ
g kutakin hybridisoitiin HG-U133A GeneChip- mikrosirut valmistajan ohjeiden protokollaa. Skannatut array kuvat tarkistettiin ja muutettiin viestittää tietoja käyttämällä Affymetrix MAS 5,0 algoritmia.
Array CGH
Genominen DNA uutettiin näytteistä käyttämällä TRI-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA), mukaan valmistajan protokollaa, ja lisäksi puhdistettiin käyttämällä QIAamp DNA Micro Kit (QIAGEN). Array CGH kokeita, Agilent 4x44k HD-CGH mikrosirut, jotka sisältävät 44000 ominaisuuksia (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) käytettiin. 0,5-1 ug kasvaimen genomisista DNA-näytteistä ja sama määrä ihmisen genomi-DNA: ta useilta anonyymi naaras luovuttajien (Promega, Madison, WI), digestoitiin Alul (50 yksikköä) ja RsaI (50 yksikköä) ja 2 tunnin ajan 37 ° C: ssa . 5 ui Random Primer sekoitettiin pilkottu DNA-templaatin. Viittaus ja näyte-DNA leimattiin käyttämällä Agilent Labeling Kit PLUS, joka sisältää 5 x puskuria, 10x dNTP, Cy-3/5 dUTP (1,0 mM), ja Exo-Klenow Fragment. Koetin seos Cy3 leimatun näyte-DNA, Cy5 merkitty viite DNA: ta (39 ui), 5 ui ihmisen Cot-1 DNA: ta (Invitrogen), 11 ui Agilent 10 x salpaava aine ja 50 ui Agilent 2 x hybridisaatiopuskuria denaturoitiin 95 ° C: ssa 3 minuutin ajan ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Koetin levitettiin array käyttäen Agilent mikrosirujen hybridisaatio kammioon, ja hybridisoitiin 21 tuntia 65 ° C: ssa pyörivässä uunissa 20 rpm. Arrays pestiin mukaan valmistajan suositusten, upotetaan Agilentin vakauttamiseen ja kuivauksen ratkaisu, ja skannataan käyttäen Agilent 2565AA DNA-siru skanneri. Agilent Scan Program ohjausohjelman 7,0 ja Agilent Feature Extraction Ohjelmiston 9.5.1 käytettiin tietojenkäsittelyä. Array CGH Aineisto analysoitiin Agilent CGH Analytics ohjelmiston (versio 3.5.14). ADM-2 algoritmi kynnys 6, jossa sumea nolla ja keskittämistä päälle, käytettiin tunnistamaan poikkeamaa. Kriteerit poikkeamaa suodatusta oli vähintään antureista 5, pienin keskimääräinen absoluuttinen log 2 suhde on 0,5, ja enintään poikkeavuuksia 1.000.000. Poikkeavuuksien tunnistettu kunkin näytteen listattiin ja graafisesti.
Mahasyöpää geenien kirjallisuudessa
Voit luoda käyttäjän määrittämän geeniperimä meidän geenin vertailun analyysien etsittiin PubMed tietokannasta geenien kanssa mahasyövän soluspesifisestä proteiiniin ilmaisua käyttäen avainsanat "mahasyöpä", "immunohistokemia" ja "yli-ilmentynyt" tai "menetys ilmaisun". Meidän geeniperimä vertailun analyysit, geeni symbolit mahasyövän geenejä kartoitettiin koetin asettaa tunnukset HG-U133A array (http: //www. NetAffx. Com). Oli 178 ( "ilmentynyt") ja 327 ( "menetys ilmaisun") artikkelit PubMed ajankohtana kirjallisesti.
Tilastollinen analyysi ilmaisun array tietojen
Affymetrix HG-U133A geeniekspressiota microarray data analysoitiin geeniperimä vertailu analyysialgoritmeja of BRB ArrayTools (versio 3.8, National Cancer Institute, http: //Linus. nci. NIH. gov /BRB-ArrayTools. html) [11]. Geeni asettaa vertailijatyökalulla analysoi käyttäjän määrittämiä geenin sarjat ero ilmentymisen keskuudessa ennalta määriteltyjä luokkia (ts
., Syöpä vs
. Normaali) lähteen aineisto. Käyttäjän määrittämät geenin sarjaa käytettiin tässä tutkimuksessa sisältävät U133A koetinsarjojen vastaavat geenien kopioluvun muutos ja vastaavat mahasyövän geenien kirjallisuudessa. Geenejä, joiden kasvain /normaali log 2-suhde on suurempi kuin 0,5 vähintään yhdessä 20 potilaan näytteitä sisällytetty luetteloon geenien kopio vahvistuksenkertojan. Samoin geenit kopioluvun tappio (log 2 suhde < -0,5) listattiin. Nämä käyttäjän määrittämät geenin sarjaa analysoitiin ero ilmaisun välillä 20 syöpänäytteissä ja 6 normaalia näytettä (esim
., 3 macrodissected ja 3 mikropaloitelluista näytettä).
Kunkin lähteen aineisto, P
-arvo on lasketaan kullekin geeni korreloivan ilmentymisen taso ero ilmaisun välillä ennalta määriteltyjä luokkia, synnytetään sijoittui geeni luettelo tietyn BRB-ArrayTools projekti. Jotta joukko N ​​
geenien, pienimmän neliösumman (LS) tilastoa määritellään keskimääräinen negatiivinen luonnollinen logaritmi P
-arvot sopivan yhden geenin univariate testit [12]. Yhteenveto tilastollinen lasketaan, että yhteenveto näistä P
arvot koko käyttäjän määrittämiä geeniperimä; yhteenvedossa tilastotieto on keskimääräinen log (P
) varten LS tiivistelmä siitä, kuinka P
arvot poikkeavat yhtenäinen jakelu LS [12]. Yhteenvedon tilastotieto liittyy jakautumista yhteenvetotilasto satunnaisotoksia N
geenejä, näytteet näistä edustettuna jono. Tässä N
on joukko geenejä käyttäjän määrittämiä geeniperimä. 100000 satunnainen geeni sarjaa otettiin näytteet laskea tähän jakeluun. LS P
arvo on osuutta satunnainen sarjaa N
geenien pienempiä keskimäärin yhteenvetotilastoja kuin LS yhteenvedot, jotka on laskettu todellisia tietoja.
BRB-ArrayTools arvioidaan LS P
arvot rikastamista 4-geenin sarjaa meidän mahasyövässä transcriptome allekirjoitus tunnistetaan kussakin kudoksessa käsittelymenetelmän seuraavasti. Ensinnäkin, jotta verrata 2324 liittyvien geenien kopioluku vahvistuksen kanssa mahasyöpä transcriptome allekirjoitus tunnistetaan mikrodissektion, LS tilastotieto 2324 monistettujen geenien arvioitiin laskemalla keskimääräinen negatiivinen luonnollinen logaritmi P
arvot yhden geenin univariate testit erilainen ekspressio kunkin 2324 geenien välillä 20 mikropaloitelluista mahasyövässä näytteet ja 6 normaalia näytettä. Sitten BRB-ArrayTools laskettu osuus satunnainen sarjaa 2324 geenien pienempiä keskimäärin yhteenvetotilastoja kuin LS yhteenvedot, jotka on laskettu todellisia tietoja (LS P
arvo). Mahasyövän transcriptome allekirjoitus tunnistetaan mikrodissektion verrattiin myös 677 liittyvien geenien kopiomäärä menetys, 58 proteiineja raportoitu yliekspressoituvan mahasyövässä, ja 66 proteiinit raportoitu ali-ilmentynyt mahasyövän, vastaaviin LS P
arvot. LS P
arvo alle 0,01 pidettiin merkittävänä. Samat analyysit toistettiin mahasyövän transcriptome allekirjoitus tunnistetaan macrodissection menetelmällä.
Immunohistokemia
TFF1 immunohistokemia suoritettiin käyttäen kirurgisia tai endoskooppinen biopsia kudosnäytteitä 16 mahasyöpäpotilaista (16 syöpä ja 2 vierekkäistä normaali kudosnäytteitä), ja 4 tervettä vapaaehtoista, jotka eivät sisälly tähän DNA-siru tutkimuksessa. Karkeasti-normaali mahan limakalvon kudos kerättiin mahalaukkua terveiden vapaaehtoisten avulla sokea koepala tekniikka, jossa tietoon perustuvan suostumuksen [9]. Parafinoidut formaliinikiinnitetyt kudoksen diat (4 pm paksu) värjättiin 13734-1-AP (ProteinTech Group, Chicago, IL) on 01:50 60 min huoneenlämpötilassa ja Envision anti-kani-piparjuuri-peroksidaasi (K4003, DAKO , Carpinteria, CA) 30 minuutin ajan RT: ssä. Reaktio visualisoidaan diaminobentsidiiniä (K3468, DAKO) ja vasta- värjättiin hematoksyliinillä. TFF1 ilmentyminen arvioitiin puolikvantitatiivisesti 200x
suurennos, joka perustuu prosenttiosuus positiivisesti värjäytyneiden solujen ( "-" = immunovärjääminen ≤ 10% soluista, "+" = 11-50%, "++" = 51 75%; "+++" = 76-100%) [13, 14]. Immunovärjäyksen ilman primaarista vasta-ainetta ja normaalia mahalaukun epiteelin kontrollina kudoksen microarray toimi negatiiviset ja positiiviset kontrollit, vastaavasti [15]. Sytoplasmisen tahra joka oli yksiselitteisesti syvempi kuin tausta laskettiin positiiviseksi.
Tulokset
määrittäminen maailmanlaajuinen geenin ilmentymisen allekirjoitusta macrodissected ja LCM näytteet
Taulukko 1 delineates kliinis-patologinen potilaiden ominaisuuksiin ja vapaaehtoisten sisällytetty tähän mikrosirujen tutkimus. Microarray tiedot saatiin sekä LCM ja macrodissected näytteitä samasta 20 koepaloja (kuvio 1A). Vaikka hyväksyttävä laatu, microarray tietoja LCM näytteistä oli yleensä pienempi "läsnä call" kuin macrodissected näytettä (tuloksia ei ole esitetty
). Pääkomponenttianalyysin maailmanlaajuista geeniekspressiomalleja peräisin mikro- ja makrotason leikellään syöpien, ja normaali näytteet osoittivat selvään kunkin otoksen (kuvio 1 B). Mediaani Pearsonin korrelaatio kahden käsittelymenetelmät oli 0,75 (kvartiiliväli, 0,71-0,81) .table 1 kliinis-patologinen ominaisuudet potilailla ja vapaaehtoisilla sisältyvät mikrosiruanalyysi

Potilaat (n = 20)
Vapaaehtoiset (n = 6)
Baseline kliinis-patologisten ominaisuuksien
Ikä vuoden
mediaani
59
52
kvartiiliväli
54-69
43-61
Sex - no. (%) B Mies
16 (80%) B-3 (50%) B Nainen
4 (20%) B-3 (50%) B Suorituskyky (PS ) - no. (%) B ECOG1 PS 0 tai 1
20 (100%) B Histologinen tyyppi - no. (%) B Laurenin suoliston
6 (30%) B Laurenin hajanainen
14 (70%) B sijainti primäärivamma - no. (%) B Ylempi 1/3
4 (20%) B Lähi 1/3
6 (30%) B Alempi 1/3
10 (50%)
Distant etäpesäke - no. (%) B 20 (100%) B hoito ja tulos
solunsalpaajahoito - no. (%) B Sisplatiini /Fluorouracil
20 (100%)
Kokonaiselossaoloaika - kuukausi.
Mediaani
8,0
kvartiiliväli
5,6-14,7
aika taudin etenemiseen - kuukausi.
mediaani
3,5
kvartiiliväli
2,3-6,2
1Eastern Cooperative Oncology Group
Kuvio 1 (A) tutkimus järjestelmä näytteiden keruun ja mikrosirujen käsittely (B) Principal komponentti analyysi geeniekspressioprofiilien mikro- ja makrotason leikeltiin kasvain näytteet 20 mahasyöpäpotilaista ja 6 normaali näytteitä terveillä vapaaehtoisilla.
taulukot 2 ja 3 esittävät geenien yli-ilmennetään mikro- ja makrotason leikellään mahasyövän näytteet ominaisuuksien hallintaan P
< 10 -6. Solujen morfologia
(AIF1, E2F1, E2F3, KIR2DL1, KIRREL, NPR1, RUNX2, TRIO
) oli kaikkein rikastettu toiminnallinen luokka 42 geenien yli-ilmentää siinä mikropaloitelluista näytteissä verrattuna normaaliin näytteet (ominaisuus valinta P
< 10 -6) yksilöidyt Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (taulukko 2). Kasvaimen morfologia
(APOE, BIRC5, CD14, COL1A1, COL1A2, Cyr61, FKBP1A, IL8, MCAM, MIF, RHOB
) oli kaikkein rikastetun toiminnallinen luokka joukossa 73 geenit yli-ilmennetään siinä macrodissected näytteistä (ominaisuus valinta P
< 10 -6) IPA (taulukko 3). Soluväliaineen geenejä, kuten COL6A2, COL1A1, COL1A2
, ja COL5A2
olivat näkyvämpi macrodissected näytteitä ja oletettavasti myötävaikuttanut stroomasoluihin. Taulukossa 4 on esitetty geenejä ali-ilmentynyt mikro- ja makrotason leikellään mahasyövän näytteitä ominaisuuksien hallintaan P
< 10 -6.Table 2 Geenit yliekspressoituvat mikropaloitelluista mahasyövässä at ominaisuuksien hallintaan P
< 10-6
Gene

FC1

Gene

FC

BMP3
38.52
HIST1H4C
6.3
BGN
30.3
LEPRE1
5.9
TRIO
18.5
ETNK2
5.6
GADD45GIP1
17.2
TRIP6
5.3
MIER2
16.7
FAM125B
5.3
KIFC3
16.4
NPR1
5.3
217318_x_at
13.7
DSCC1
5.3
217219_at
13.2
CLUL1
5.0
RUNX2
12.5
HMGB3
4.5
SMARCD1
12.0
E2F3
4.3
KIRREL
12.0
AIMP2
4.2
215621_s_at
12.0
ATAD5
4.0
GRM2
10.0
E2F1
3.8
FJX1
10.0
FKSG49
3.7
AIF1
10.0
DVL2
3.7
THY1
9.1
TIPRL
2.9
CARD10
9.1
EIF2C3
2.9
SIM2
9.1
NAT10
2.8
AIF1
9.1
MED27
2.7
APOBEC3G
8.3
PIN4
2.7
RHAG
8.3
CTPS
2.6
1fold muutos, määritellään seuraavalla lausekkeella suhde syövän normaaliksi (= syöpä /normaali) B 2Kaikki näistä geeneistä oli vääriä löytö asti < 0,001.
Taulukko 3 Geenit yliekspressoituvat macrodissected mahasyövässä at ominaisuuksien hallintaan P
< 10-6
Gene

FC1

Gene

FC

LY6E
24.42
SRM
6.7
IL8
22.7
NGLY1
6.7
CA12
20.0
RHOB
6.3
SBNO2
19.2
ACTN1
5.9
UBE2S
17.2
LOXL2
5.9
CYR61
17.2
COL5A2
5.9
ANGPT2
15.9
TRIM28
5.6
COL6A2
14.3
218982_s_at
5.6
BOP1
13.2
C7orf44
5.3
COL1A1
13.2
UBE2C
5.3
LPL
13.0
CEP76
5.3
MFGE8
12.8
BIRC5
5.3
APOE
12.2
PNO1
5.0
G6PC3
10.9
FSTL1
5.0
215900_at
10.3
GRINA
4.8
NUP62
10.0
MRTO4
4.8
MRPL4
10.0
STC1
4.8
GNL3L
10.0
MRPL12
4.5
MCAM
9.1
FKBP1A
4.5
PDLIM7
9.1
IFI30
4.5
216472_at
9.1
KPNA6
4.3
ACTN1
9.1
216532_x_at
4.3
BYSL
9.1
CENPI
4.2
GNAI2
8.3
PPM1G
4.2
NCAPH2
8.3
ICT1
3.7
CD14
8.3
SFRS14
3.6
EXOSC4
8.3
CTPS
3.6
OBFC2B
8.3
IMP4
3.3
PPP1R15A
7.7
UBE2G2
3.2
COL1A2
7.7
ISG20L2
3.2
GPX1
7.7
EIF4A1
3.1
MIF
7.7
HDGF
2.6
NME1
7.1
PSMD14 2.6
PPIL2
7.1
220856_x_at
2.4
CCDC85B
7.1
CNOT3
2.4
SPARC
6.7
GLT25D1
2.0
C8orf55
6.7
1fold muutos, määritellään seuraavalla lausekkeella suhde syövän normaaliksi (= syöpä /normaali) B 2Kaikki nämä geenit olivat vääriä löytö asti < 0,001.
Taulukko 4 Geenit ali-ilmentynyt mikro- ja makrotason leikellään mahasyövän at ominaisuus valinta P
< 10-6
mikropaloitelluista

Macrodissected

Gene

FC1

Gene

FC

HPGD
-25.02
208498_s_at
-11.1
HRASLS2
-20.0
SIDT2
-7.7
ABCC3
-20.0
MUC5AC
-5.9
SLC25A37
-16.7
CTAGE5
-5.0
ABHD2
-14.3
GNA11
-3.8
VIPR1
-10.0
ARFIP1
-3.4
CYTIP
-9.1
214316_x_at
-3.3
GALNT6
-9.1
222149_x_at
-3.3
SULT1A2
-9.1
OAS1
-8,3
PDCD4
-7,1
NR3C2
-7,1
DOCK6
-6,3
SULT1A1
-5,9
ZFYVE26
- 5.9
213212_x_at
-5,6
DSCR3
-5,3
TMEM131
-5,3
ECHDC2
-5,0
DENND1B
-5,0
KIAA0141
-4,8
RNF103
-4,8
PDCD4
-4,5
CABIN1
-4,5
222371_at
-4,3
RRBP1
-4.0
CC2D1A
-3,8
216438_s_at
-3,8
SGSM3
-3,8
ARPC2
-3,7
TRAK1
-3,6
GNA11
-3,6
PAFAH1B1
-3,4
CNDP2
-3,2
SPOP
-3,1
PARP4
-3,1
ERLIN1
-2,9
1fold muuttua, määritellään negatiivinen ilmaisun suhteen normaalista syöpään (= - (normaali /syöpä)) B 2Kaikki näistä geeneistä oli vääriä löytö asti < 0,001.
vertailu ilmaisun ja array CGH data
Array CGH analyysi suoritettiin käyttäen genomista DNA: ta macrodissected sisältävät näytteet > 50% kasvainsoluja (perusteet, joita aiemmissa tutkimuksissa [16, 17]), koska riittävää DNA voitiin saada ilman koko genomin vahvistusta edellyttämällä mikropaloitelluista näytteitä. Koko genomin DNA vahvistus voi mahdollisesti ottaa käyttöön keinotekoista harha array CGH tuloksiin [18]. Kuviossa 2 on taajuus DNA kopioluvun poikkeamia joukossa kaikki 20 näytettä. Meidän kopiomäärä poikkeavuus data oli yleisesti yhdenmukainen aiemmin raportoitujen tietojen [7, 16, 17, 19-23]. Neljä 20 potilasta oli monistuminen CHR8 q24.13-q24.21 (126357475-128822596), joka sisältää MYC
onkogeeni. Toiseksi yleisin vahvistus lokuksessa oli CHR 17 q21.2 (36109939-36230163), joka monistettiin 3 potilaalla. Seitsemän potilaista ei ollut havaittavissa kromosomipoikkeavuuksien. Nämä 7 näytteet sisälsivät mediaani 70% kasvainsoluja, kun taas muut 13 potilasta oli keskimäärin 60%: kasvainsoluja (P
arvo = 0,1). Näin ollen, ei ole havaittavissa kromosomipoikkeavuuksia 7 näytettä ei johtunut alhaisempi kasvainsolujen näissä näytteissä. Kuvio 2 graafinen kuva havainnollistaa prosenttia taajuus koettimien havaittu (aberraatioita) kaikkien 20 näytettä.
Oli 2324 ainutlaatuinen geenejä, jotka liittyvät kopioluvun saada ainakin yksi 20 potilasta, ja 677 liittyvien geenien kopioluku menetys. Käyttämällä geeniperimä vertailun analyysien vertasimme nämä geeni, joissa on meidän transcriptome allekirjoituksia, joita eri näytteen eristäminen menetelmiä. Oletimme, että säädeltyyn liittyvien geenien kopioluku poikkeavuudet ovat todennäköisemmin mukana tiedon tuottajia onkogeneesille sijaan yksinkertaisesti "sivullisia." Näin ollen 2324 geenit sisältyvät alueisiin kopioluvun voitot analysoitiin suhteessa niiden ilmentyminen array tiedot saadaan käyttämällä macrodissection menetelmää (ominaisuuksien hallintaan P
< 0,05). Päällekkäisyys välinen luettelo geenien alueilla vahvistus ja rikastamiseen niiden ilmentymistä näytteissä, jotka oli macrodissected oli tilastollisesti merkitsevä (LS P
arvo = 10 -5; katso Menetelmät tilastollinen kuvaus). Tämä yhdistys ei havaittu kun ekspressiotietojen analysoitiin mikropaloitelluista näytteistä (ominaisuuksien hallintaan P
< 0,05; LS P
arvo = 0,41) (kuvio 3A). Näin ollen oli vahvempi yhdistyksen välillä rakenteessa kopioluvun vahvistuksen ja geenin ilmentymisen vain näytteissä, jotka oli macrodissected. Esimerkiksi MYC
, useimmin monistettu geeni meidän potilaan näytteitä määritettiin merkittävästi yliekspressoituvan macrodissected näytteissä, mutta ei niitä, jotka olivat microdissected, vaikka tämä tulos saattaa johtua suhteellisen pieni otoskoko tai heterogeenisyys sisällä kasvain. Kuvio 3 lukumäärä geenien päällekkäisyyden LCM ja macrodissected ilmaisun array aineistot ja array CGH tietoja samoja 20 potilasta.
Luettelo 677 geenien havaittiin alueilla, joilla DNA: n kopioiden määrä menetys todettiin ainakin yksi 20 tutkimuksessa potilaat. Ilmaisu Näiden geenien analysoitiin makro- ja mikrotason leikeltiin array aineistoja. Merkittävä assosioitunut geenien menetys kopioluvun ja niiden ilmaisun sekä makro- ja mikrotason leikeltiin näytteitä. (LS P
arvoja, 0,009 ja 0,006 varten LCM ja macrodissected näytteet, vastaavasti) (kuvio 3B).
Concordance geenin allekirjoituksia geenejä aiemmin raportoitu liittyvän mahasyöpä
PubMed kirjallisuudesta Haku suoritettiin tunnistaa aiemmin raportoitu yli- ja ilmaisi geenien ja proteiinien mahasyövän (avainsanat: immunohistokemia, mahasyöpä, ja ilmentynyt ja tai menetyksen lauseke). 58 proteiinien yli-ilmentynyt mahasyövän tunnistettiin tällä tavalla. Geenien ilmentyminen Näiden 58 proteiinit todettiin rikastettu ekspressiotietojen näytteistä keräämien macrodissection (LS P
< 10 -5), mutta ei rikastus ilmentyminen 58 geenien havaittiin näytteissä kerättiin mikrodissektion (LS P
= 0,013). Sen sijaan 66 proteiineja raportoitu ali-ilmentynyt mahasyövän rikastuneet ilmaisun array tietoja kerätyistä näytteistä mikropreparoinnilla (LS P
< 10 -5), mutta ei näytteistä keräämien macrodissection (LS P
= 0,89) (taulukko 5) .table 5 Mahasyöpää geenien kirjallisuudessa, jotka ilmentyvät eri välillä 20 syöpä ja 6 normaalia näytteitä ominaisuuksien hallintaan P
< 0.05 mukaan microarray data generoidaan käyttämällä kudos- käsittelymenetelmän
yli-ilmentynyt geenien syövän
ali-ilmentynyt geenien cancer

LCM&Macro1

LCM

Macro

LCM&Macro

LCM2

Macro

APOE
EGFR
AKT1
ANXA10
ANXA7
CDKN2B
AURKA
HGF
ANXA2
CASP6
BAD
FHIT
CCNE1
MET
CALR
CASP7
HLA-B
CDC20
RhoA
CCNB1
CDH1
HLA-E
CDC25B
TNS4
EEF2
CTNNA1
HLA-G
CXCR4
ESM1
GSN
PRSS8
E2F1
HF1A
HLA-F
PTEN
EGR1
MINA
IQGAP2
SDHB
Grb2
PHB
KCNE2
SH3GLB1
HK2
Klf4
TFF1
ICAM1
MUC6
INHBA
WR
LOXL2
Smad4
MCM3
PTMA
SPARC
1Previously raportoitu ilmentynyt proteiineja mahasyövän jotka myös yli-ilmentynyt meidän mikropaloitelluista (LCM) ja macrodissected syöpänäytteissä verrattuna normaaliin näytteiden
2Previoulsy raportoitu ali-ilmentynyt proteiineja mahasyövän jotka myös ali-ilmentynyt meidän mikropaloitelluista (LCM) syöpä näytteitä, mutta ei macrodissected syöpänäytteissä
validointi microarray tietojen
voidakseen vahvistaa meidän microarray data, suoritimme immunohistokemiallinen analyysit geeni tunnistettu ali-ilmentynyt in mikropaloitelluista syövän näytteissä 16 potilaalla ja 4 vapaaehtoisia, jotka eivät olleet mukana DNA-siru tutkimuksessa. TFF1
valittiin tähän immunohistokemiaa validointitutkimuksella koska se on merkittävästi ali-ilmentynyt että LCM näytteistä (P
= 0,0036), mutta ei macrodissected näytteistä (P
= 0,09) verrattuna normaaliin mahalaukun limakalvon. TFF1 immunoreaktiivisuus syövän arvioitiin -, +, ++, ja +++ 7 (43,8%), 3 (18,7%), 4 (25,0%), ja 2 (12,5%), vastaavasti. Sen sijaan kaikki 6 normaalin mahan limakalvon näytteet (4 tervettä vapaaehtoista ja 2 viereisistä normaaleista kudosnäytteistä) säilötty TFF1 immunoreaktiivisuus (+++) (kuvio 4). Siten mahasyöpä näytteissä oli huomattavasti pienempi TFF1 immunoreaktiivisuus kuin normaali mahan limakalvoa, yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien [13, 14] (P
chi-neliö = 0,007). Kuva 4 Edustavia TFF1 immunohistokemiallisella värjäyksellä tulokset (A) mahalaukun adenokarsinoomaa osoittaa menetys TFF1 ilmaisun, ja (B) normaali mahan limakalvoa terveen vapaaehtoisen ilmentävien TFF1 mahalaukun epiteelisolujen. (Suurennus = 200x)
Nämä tulokset osoittavat, että macrodissection perustuva geenien ilmentyminen analysoidaan ylitti geenin ilmentymisen analyysit LCM-näytteiden tunnistamiseksi geenien yli-ilmentynyt mahasyövän.

• BariSurg tutkimus: Hiha gastrectomy versus Roux-en-Y mahalaukun ohitusleikkaus lihavilla potilailla, joilla on BMI 35-60 kg /m2 - Monikeskustutkimusta satunnaistettu potilas ja tarkkailija sokea yhden…
• Expression profiilia musiineja (MUC2, MUC5AC ja MUC6) Helicobacter pylori tartunnan preneoplasti- ja neoplastisia ihmisen mahalaukun epithelium