Immunisointi immunodominantille Helicobacter suis ureaasia alayksikköä B indusoi osittaisen suojan H. suis infektiota hiirimallissa

Immunisointi immunodominantille Helicobacter suis
ureaasia alayksikköä B indusoi osittaisen suojan H. suis
infektion hiirimallissa
Abstract
Helicobacter
(H.
) suis
on sian ja ihmisen mahalaukun taudinaiheuttajista. Aiemmat tutkimukset hiirillä osoittivat, että H. suis
tartunta ei johda suojaavan immuniteetin, kun taas immunisointi H. suis
koko solun lysaatti (lysaatti) suojaa myöhempää kokeellinen infektio. Näin ollen, kaksiulotteinen geelielektroforeesi H. suis
proteiinit tehtiin seurasi immunoblottaus seerumiseos H. suis
- tartunnan hiirillä tai hiirillä, jotka oli immunisoitu lysaatin. Heikko reaktiivisuus vastaan ​​H. suis
proteiinit havaittiin infektion jälkeen seerumit. Seerumeita lysaattia-immunisoiduista hiiristä, kuitenkin osoitti immunoreaktiivisuus vasten yhteensä 19 proteiinin pisteitä, jotka tunnistettiin käyttäen LC-MS /MS: llä. H. suis
ureaasi alayksikköä B (UreB) osoitti selvin reaktiivisuutta seerumeita vastaan ​​lysaatin-immunisoiduista hiiristä ja ei havaittu kanssa seerumeista tartunnan hiirillä. Mikään seerumiseos havaittu H. suis
neutrofiiliä aktivoiva proteiini A (Napa). Suojaavan tehokkuuden intranasaalisen rokottamisen BALB /c-hiirten H. suis
UreB ja Napa, sekä rekombinanttisesti ilmaistu Escherichia coli
(rUreB ja rNapA, vastaavasti), verrattiin H. suis
lysaattia. Kaikki rokotteet sisälsivät choleratoxin adjuvanttina. Hiirten rUreB ja lysaatin aiheuttama merkittävä väheneminen H. suis
asuttaminen verrattuna rokottamattomiin H. suis
infektoituihin valvontaa, kun taas rNapA ollut merkittävää suojaavaa vaikutusta. Luultavasti, yhdistelmä paikallisen Th1 ja Th17 vastauksia, täydennetään vasta-vasteet osansa suojaava immuniteetin H. suis
infektioita.
Johdanto
Helicobacter
(H.
) suis
on maailmanlaajuinen leviäminen taudinaiheuttaja, pääasiassa siirtomaita sikoja. Infektio tällä gram-negatiivinen bakteeri on liitetty haavaumia mahan ei-glandular limakalvon [1, 2] ja aiheuttaa gastriitti ja laski päivittäinen painonlisäys [3] sioissa. H. suis
on myös yleisin ei-Helicobacter pylori Helicobacter
lajien ihmisillä, jotka kärsivät mahalaukun sairaudet [2] ja sikoja voi toimia lähteenä H. suis
infektiot ihmisillä [2, 4 ]. Valvonta H. suis
infektioiden antibiooteille perustuvaa hoitoa ei suositella osittain johtuen suurentunut riski sairastua hankitun mikrobilääkeresistenssiä H. suis
kantoja ja bakteereissa kuuluvat normaaliin sian mikrobiston [5]. Immunisaatio H. suis
voivat siten muodostaa hyvä vaihtoehto. Tähän asti kuitenkin vain harvat tutkimukset ovat koskeneet rokotuksia tätä sian ja zoonoottisten patogeenien.
Aikaisemmat tutkimukset hiirimallissa osoittivat, että H. suis
tartunta ei johda suojaavan immuniteetin, kun taas rokottaminen perustuu homologiseen (H. suis
) tai heterologinen (H. bizzozeronii
tai H. cynogastricus
) koko solun lysaatin aiheuttama väheneminen tai jopa täydellinen puhdistuma mahalaukun bakteerikannasta H. suis
[6]. Kuitenkin tämäntyyppinen rokotteiden on haittoja, mukaan lukien työlästä viljelemiseksi in vitro H. suis
, mikä johtaa vaikeuksiin tuottamaan riittäviä antigeenin. Myös kokosolulysaateista voi sisältää sekä suojaavia antigeenejä ja antigeenejä estävä suoja [7]. Tehokkaan alayksikkörokotteen saattaa olla käyttökelpoinen vaihtoehto valvonnasta H. suis
infektioita. Immunoproteomics on sopiva lähestymistapa tunnistaa nopeasti ehdokas proteiineja rokotukset ja on sovellettu tutkia ja kehittää alayksikkörokotteissa monenlaisia ​​taudinaiheuttajia [8].
Se oli käsillä olevan tutkimuksen valita H. suis
proteiineja, jotka saattavat aiheuttaa suojaavan immuniteetin H. suis
infektio. Näin ollen, H. suis
tunnistamat proteiinit immunisoitujen hiirten seerumissa H. suis
kokosolu-lysaattia ja suojattu infektiota tunnistettiin käyttämällä kaksiulotteista (2D) geelielektroforeesi ja sen jälkeen immunoblottauksella, ja LC-MS /NEITI. Sera H. suis
- tartunnan hiiriä myös, koska infektio ei johda suojaa. Tämän analyysin perusteella, Immunoreaktiivisia H. suis
ureaasi alayksikköä B (UreB) valittiin edelleen in vivo testaus. Kontrollina meidän sisälsi H. suis
neutrofiilien-aktivoiva proteiini A (Napa), mikä on kuvattu aikaisemmin mahdollisena virulenssitekijä [9], mutta ei tunnustettu immunisoitujen hiirten seerumissa, joilla kokosolu-lysaattia. Tämän jälkeen suojateho vastaan ​​H. suis
infektio kummankin alayksikkörokotteiden arvioitiin ja verrattiin H. suis
lysaatin standardoidussa hiirimallissa.
Materiaalit ja menetelmät
Bakteerikanta
kaikissa kokeissa, H. suis
kannan 5 (HS5, GenBank: ADHO00000000) käytettiin. Tämä kanta eristettiin mahan limakalvon sian menetelmän mukaisesti kuvataan Baele et ai. [10].
Eläimet
Yksi viikko ennen aloittamista kokeissa, viiden viikon ikäisiä tietyn patogeenin vapaa BALB /c-hiiret saatiin valtuutetun kasvattaja (Harlan, Horst, Alankomaat). Eläimiä pidettiin päällä steriloitiin puulastujen suodattimen häkeissä. Niitä ruokittiin autoklaavikäsiteltyä kaupallista ravintoa (Teklad 2018S, HARLAN) ja sai autoklavoitiin vettä halun
. Kaikki laboratorio- eläinkokeiden oli hyväksynyt Animal Care ja eettisen komitean tiedekunnan eläinlääketieteellisen Gentin yliopisto.
Immunoproteomics H. suis
Kaksiulotteinen geelielektroforeesilla (2D-PAGE) B HS5 kasvatettiin kuten aiemmin on kuvattu [11]. Bakteerit kerättiin sentrifugoimalla (5000 g
, 4 ° C: ssa 10 min) ja pestään neljä kertaa Hankin tasapainotettua suolaliuosta (HBSS). Yhteensä proteiineja (sekä liukenevia että liukenemattomia proteiineja) uutettiin kahdessa vaiheessa käyttäen ReadyPrep ™ Sequential Extraction Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Jotta saataisiin hyvä 2D-PAGE tulokset, homogenaatit käsiteltiin asianmukaisen lisäaineet (5 mg proteaasiestäjäseostabletit, 1 ui DNAasia I, 1 pl RNaasi A, 10 ui fosfataasi-inhibiittorit PP2 ja PP3 (Sigma-Aldrich, Steinheim, Saksa) ). Lopuksi, proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen RC DC
Protein Assay (Bio-Rad) ja proteiineja varastoitiin -70 ° C: ssa kunnes sitä tarvitaan. Yhteensä 100 ug HS5 proteiinien rehydratoitiin 200 ui nesteytys puskuria (7M ureum, 2M thioureum, 2% CHAPS, 0,2% kantaja-amfolyyttiä pH3-4, 100 mM ditiotreitoli (DTT) ja bromifenolisinistä). Näytteet passiivisesti imeytetään ReadyStrip (11 cm, pH-arvossa 3 pH-arvoon 10, Bio-Rad) ja isoelektrisellä fokusoinnilla suoritettiin Protean IEF jaosto (Bio-Rad), kuten aiemmin on kuvattu [12]. Jälkeen isoelektrisellä fokusoinnilla, liuskat tasapainotettiin 15 minuutin ajan 1,5% DTT: tasapainotuspuskurilla (50 mM Tris-HCl, pH 8,8 ja 6 M ureaa, 20% glyserolia, 2% SDS), jota seurasi toinen tasapainotuspuskurilla 4% jodiasetamidi tasapainotuspuskurissa. Geelielektroforeesi suoritettiin 10% Tris-HCl SDS-PAGE käyttäen 150 V 30 min ajan, jonka jälkeen 200V 1 tunti. Kaksi ajettiin rinnakkain: yksi värjättiin Sypro® Ruby Protein Gel värjäytymistä (Bio-Rad), kun taas toinen on käytetty immunoblottauksella (ks Western blotting kuvattu alla). Ennen värjäystä, geelit fiksattiin 10% MeOH, 7% etikkahappoa. Värjäyksen jälkeen, H. suis
proteiinit tehtiin näkyviksi käyttäen VersaDoc Imaging System (Bio-Rad).
Seerumin allasta
Kolme altaat hiiren seerumia käytettiin tässä tutkimuksessa:

seerumit immunisoiduista hiiristä H. suis
koko solun lysaatti (jäljempänä "lysaatti-immunisoidut hiiret") (n
= 10). Nämä eläimet inokuloitiin intranasaalisesti kahdesti kolmen viikon välein 100 ug: lla HS5 lysaattia + 5 ug koleratoksiinin (CT) (List Biological Laboratories Inc., Madison, NJ, USA). HS5 lysaatti valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu, mutta ilman lopullista supernatantti suodatetaan [6]. Kolme viikkoa viimeisen immunisoinnin jälkeen, kerättiin verta ja seerumit yhdistettiin. Tämä immunisointiprotokolla on osoitettu olevan (osittain) suojaava H. suis
haaste [6], ja suojaava vaikutus varmistettiin tässä alustavassa kokeessa (tuloksia ei ole esitetty).

Sera H. suis
infektoiduista hiiristä (jäljempänä 'tartunnan hiiriä ") (n
= 10). Nämä eläimet rokotettiin vatsansisäisesti 200 ui Brucella liemi pH 5, joka sisälsi 10 ^{8 juuri valmistettu H. suis
bakteerit [11]. Neljä viikkoa infektion jälkeen kerättiin verta ja seerumit yhdistettiin.}

seerumit negatiivinen kontrolli hiiriä (n
= 10). Nämä eläimet saivat HBSS nenän kahdesti kolmen viikon välein seuraa mahansisäisillä istuttamisen 200 ui Brucella liemessä pH 5 (4 viikon kuluttua viimeisen huijausta immunisoinnin). Neljän viikon kuluttua, veri kerättiin ja seerumit yhdistettiin.
Kaikki seerumit säilytettiin -70 ° C: ssa myöhempään käyttöön saakka.
Western blotting
Proteiinit siirrettiin sähköllä geeleistä nitroselluloosakalvoille (Bio-Rad), kuten muualla on kuvattu [12]. Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitoa fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) (estopuskuria), inkuboitiin yli yön (ON) laimennetulla hiiren seerumia (1/100 estopuskurissa) huoneenlämpötilassa (RT), huuhdeltiin PBS: ssä, jossa 0,3% Tween-20 (pesupuskuri) ja inkuboitiin 1 tunnin ajan RT: ssä stabiloitu vuohen anti-hiiri-immunoglobuliini G (IgG) piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua (1/1000 estopuskurilla, Pierce, Rockford, IL, USA). Pesuvaiheen jälkeen pesupuskurissa, immuunidetektio proteiinien suoritettiin parannettu kemiluminesenssidetektiolla käyttäen SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (Pierce). Geelikuvioihin skannattiin ja digitoidaan käyttäen VersaDoc Imaging System. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.
In-geeli-proteiinia ruoansulatusta ja tunnistaminen massaspektrometrialla
-geeli proteiinien sulatuksessa suoritettiin, kuten on kuvattu julkaisussa Cheung et ai. [13]. Ennen massaspektrometria eristetyt peptidit erotettiin U3000 nano-korkean erotuskyvyn nestekromatografia (HPLC) (Dionex, Sunnyvale, CA, USA), kuten aiemmin on kuvattu [14].
Tunnistetiedot peptidien suoritettiin käyttäen sähkösumutus ionisaatio kvadrupoli-lentoaika-massaspektrometrialla (ESI-Q-TOF) Ultima (Waters, Milford, MA, USA), kuten aiemmin on kuvattu [14]. Tietojen analysointi suoritettiin vasten Helicobacter
proteiini tietokannasta NCBI (146 612 koiraa) käyttäen in-house hakukoneen Mascot Daemon (2.3, Matrix Science, London, UK). Vikasietoisesta haku suoritettiin karbamidometyyli (C) kiinteiksi muutos. Karbamidometyyli (N-terminaali) ja hapetus (M) asetettiin muuttuja muutoksia. Peptidi massa toleranssi ja fragmentti massa toleranssi asetettiin 0,35 Da ja 0,45 Da, vastaavasti. Suurin kaksi miscleavages sallittiin. Proteiinit vain pitää asianmukaisesti selityksin kun merkitys oli alle 0,05 (s
< 0,05) ja ainakin yhden peptidin läpäissyt vaaditut rohkea punainen kriteerejä Mascot Daemon, mikä osoittaa, että ainakin yksi peptidi oli listalla 1 ja merkitys alle 0,05.
One-geelielektroforeesi (1D-PAGE) ja Western-blottaus rUreB
1D-PAGE 10 ug rekombinanttia H. suis
ureaasi alayksikön B (rUreB) suoritettiin kuten ovat kuvanneet Van Steendam et ai. [12]. Sera valmistelu ja Western blot -analyysit suoritettiin kuten edellä on kuvattu.
Suojavaikutus rekombinantin H. suis
proteiinien hiirimallissa
valmistaminen yhdistelmä-DNA-UreB
fragmentti, joka koodaa H. suis
UreB sekvenssi (GenBank locus tag HSUHS5_0285) monistettiin PCR: llä käyttämällä Pwo-polymeraasia oikoluku aktiivisuus (Roche, Mannheim, Saksa) DNA: sta HS5 (alukkeesta: 5'ATG AAA AAA ATC TCT AGG AAA GAA TAT G -3 "reverse-aluke: 5'-CTA GTG ATG GTG ATG GTG ATG GAA CAA GTT GTA GAG TTG AGC -3 ') ja kloonattiin proteiinin ekspressiovektoriin pET-24d. RUreB ilmennettiin E. coli
BL21 (DE3). Solut hajotettiin sonikoimalla (5 x 30 s) puskurissa, joka sisälsi 50 mM Na.PO 4 pH 7, 0,5 M NaCl, 1 M DTT: tä, 1% Triton X-100 ja 1 mM PMSF. Sentrifugoinnin (4 ° C, 20 000 g
30 min), rUreB puhdistettiin liukoisesta fraktiosta käyttämällä Ni-affiniteettikromatografialla in puskurissa, joka koostui 1 M NaCl, 50 mM PBS, 1% Triton X-100, 250 mM imidatsolia ja 10% glyserolia (His GraviTrap, GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Ruotsi), mitä seurasi geelisuodatus Superdex ™ 200 HR 16/60 -pylvääseen (GE Healthcare Bio-Sciences AB). Puhdistuksen jälkeen rUreB analysoitiin käyttäen SDS-PAGE ja Western blot-analyysillä käyttämällä anti-heksahistidiini-tag hiiren monoklonaalinen vasta-aine (Icosagen Cell Factory, Tartu, Viro). Pesuaine Triton X-100 poistettiin puhdistetusta rUreB käyttämällä Pierce Pesuaine Removal Spin pylväät (Pierce) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Proteiinipitoisuus määritettiin RC DC
proteiinin määritys (Bio-Rad).
Valmistaminen yhdistelmä-DNA-Napa
ekspressoitiin E. coli
Expression System Gateway® Technology (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) seuraavasti. Fragmentti, joka koodaa H. suis
neutrofiilien-aktivoiva proteiini A (Napa) sekvenssi (GenBank locus tag HSUHS5_0014) monistettiin PCR: llä käyttämällä Pwo-polymeraasia korjausluku aktiivisuus (Roche) DNA: sta HS5 (eteenpäin-aluke: 5 ' - CACCATG AAAGCAAAAACAGTTGATGTACTC -3 '; käänteinen aluke: 5'-TTAAGCCAAACTTGCCTTAAGCATCC -3') ja kloonattiin pENTR ™ /TEV /D-TOPO® vektori ja siirretään pDEST17 ™ kohde vektori. Valitun pDEST17 Napa plasmidi transformoitiin BL21-AI ™ E. coli
ja sen jälkeen kasvatetaan 37 ° C: ssa OD 600 0,6-1,0 Luria Broth, johon on lisätty 50 ug /ml karbenisilliiniä. Rekombinantti H. suis
Napa (rNapA) ilmentyminen indusoitiin lisäämällä 0,2% L- arabinoosia. 4 tunnin kuluttua inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa, solut kerättiin ja suspendoitiin uudelleen hajotuspuskuriin: 50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,2 mg /ml lysotsyymiä, 20 ug /ml DNAasia, 1 mM proteaasi-inhibiittoreita (Sigma) , ja 1 mM MgCl 2. Solut hajotettiin sonikoimalla (5 x 30 s). Solujätteen ja inkluusiokappaleet erotettiin sentrifugoimalla 4 ° C: ssa (20 000 g
30 min). Inkluusiokappaleet pestiin sen jälkeen kahdesti perusteella seuraavalla tavalla: pelletti suspendoitiin uudelleen kylmään hajotuspuskuriin, sonikoitiin 5 kertaa 30 s jota seurasi sentrifugointi (4 ° C, 20 000 g
30 min). Pestyt inkluusiokappaleet liuotetaan sitomispuskuriin, pH 8 (6 M guani- HCI, 20 mM Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 5 mM imidatsoli, 1 mM β-merkaptometanoli) kevyesti rotaatiossa 1 tunti huoneenlämpötilassa. Liukenematon materiaali poistettiin high speed sentrifugoimalla 4 ° C: ssa (100 000 g
30 min). rNapA puhdistettiin selkeytetty supernatantti päälle Ni-Sepharose-pylvääseen (His GraviTrap, GE Healthcare Bio-Sciences AB) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. rNapA eluoitiin eluutiopuskurilla, pH 8 (8 M urea, 20 mM Tris-HCl, 0,5 M NaCl, 0,5 M imidatsoli ja 1 mM β-merkaptoetanolia) ja ON dialysoitiin PBS: ää vastaan ​​4 ° C: ssa. Sen jälkeen, rNapA analysoitiin käyttäen SDS-PAGE: lla ja proteiinikonsentraatio määritettiin käyttäen RC DC
Protein Assay (Bio-Rad).
Immunisaatio ja infektion kokeita
kokeellinen malli on esitetty yhteenvetona kuviossa 1. Viisi ryhmää 10 hiirtä inokuloitiin nenänsisäisesti kahdesti 3 viikon välein, joka kerta 17,5 ui inokulaattia. Ryhmissä 1, 2 ja 3 ymppiä koostui HBSS 5 ug CT, joka sisälsi 30 ug rUreB, 30 ug rNapA ja 100 ug HS5 lysaattia, vastaavasti. Ryhmät 4 (lumeimmunisoitua ryhmä) ja 5 (negatiivinen kontrolliryhmä) ympättiin HBSS. Kolme viikkoa toisen intranasaalisen immunisaation, veri kerättiin pyrstö verenvuoto viisi eläintä per ryhmä ja viikkoa myöhemmin, kaikki eläimet, lukuun ottamatta negatiivista kontrolliryhmää, ympättiin intragastrisesti 200pl Brucella liemi, pH 5, joka sisälsi 10 8 toteuttamiskelpoinen H. suis
bakteerit [11]. Negatiivista kontrolliryhmää ympättiin intragastrisesti 200pl Brucella liemessä pH 5. Neljä viikkoa sen jälkeen, kun intragastrinen inokulaation, hiiret lopetettiin katkaisemalla kaula seuraavat isofluraanianestesian (IsoFlo; Abbott, IL, USA). Vuodesta lopetettiin eläimet, veri kerättiin steriiliin sydänpunktiolla, sentrifugoitiin (1000 g
, 4 ° C, 10 min), ja seerumi jäädytettiin -70 ° C: ssa myöhempään käyttöön saakka. Mahat leikattiin irti ja leikeltiin suurempaa kaarta pitkin. Puolet vatsat, kuten antrum ja silmänpohjan, pantiin välittömästi 1 ml RNA Myöhemmin (Ambion, Austin, TE, USA) ja varastoitiin -70 ° C: ssa vielä RNA- ja DNA-uutto. Pitkittäinen kaistale mahalaukun kudoksesta leikattiin ruokatorven pohjukaissuoleen suurempaa kaarta pitkin histopatologista tutkimusta varten. Kuvio 1 Kokeellinen suunnittelu rokotusten tutkimusta. Ryhmää kohti 10 hiirtä nenänsisäisesti immunisoitiin kahdesti 3 viikon välein, joka kerta 30 ug rUreB + 5 ug koleratoksiinin (CT); 30 ug rNapA + 5 ug CT, ja 100 ug HS5 lysaattia + 5 ug CT (ryhmät 1, 2 ja 3, vastaavasti). Ryhmät 4 (lumeimmunisoitua ryhmä) ja 5 (negatiivinen kontrolliryhmä) inokuloitiin nenänsisäisesti HBSS. Kolme viikkoa toisen immunisaation jälkeen, verta kerättiin 5 hiirtä ryhmää kohti, ja viikkoa myöhemmin hiiret ryhmissä 1, 2, 3 ja 4 vatsansisäisesti siirrostettiin 108 elinkykyistä H. suis
bakteereja. Ryhmä 5 oli intragastrisesti ympättiin HBSS: llä. Neljä viikkoa sen jälkeen, kun intragastrisen haaste, hiiret lopetettiin.
Kvantifiointi H. suis
mahassa
Sulatuksen jälkeen vatsa kudokset homogenisoitiin (MagNAlyser, Roche, Mannheim, Saksa) 1 ml Tri Reagent® RT (MRC, Brunschwig Chemie, Amsterdam, Alankomaat) ja DNA uutettiin inter- ja orgaaninen faasi mukaan Tri Reagent® RT valmistajan ohjeita. Bakteerien määrää mahassa määritettiin käyttäen edellä kuvattuja H. suis
erityisiä kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n (qPCR) [5].
Analyysi mahan sytokiinivasteeseen
ekspressiotasot IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-17 ja TNF-α arvioitiin qPCR käyttämällä cDNA syntetisoitiin mahan kudoksesta kuten aiemmin on kuvattu [15]. Kynnys (Ct) arvot normalisoitiin sen geometrinen keskiarvo Ct-arvot viittaus geeneistä, jonka jälkeen normalisoitu mRNA-tasot laskettiin käyttäen 2 -ΔΔCt menetelmä [16].
Mittaus seerumin vasta-ainevasteita entsyymi-immunologinen määritys (ELISA)
Protein ilmaisin ™ ELISA Kit (KPL, Gaithersburg, MD, USA) käytettiin arvioimaan rUreB-, rNapA-, ja HS5 lysaatti spesifisen IgG seerumissa. Lyhyesti, 96-kuoppaisille tasapohjaisille levyille (Nunc MaxiSorp, Nalge Nunc Int., Rochester, NY, USA) päällystettiin 2 ug /kuoppa puhdistettua rNapA, 1 ug /kuoppa puhdistettua rUreB, tai 1 ug /kuoppa H. suis
kokosolu proteiinit laimennettiin 100 ul: aan päällystyspuskuriin (24 h, 4 ° C). Kun oli salvattu 1% naudan seerumin albumiinia PBS: ssä, 100 ui 1/400 laimennettua seerumia lisättiin kuhunkin kuoppaan. Lisäpesun jälkeen, 100 ui HRP-leimattu anti-hiiri-IgG (H + L) kanssa lopullisessa konsentraatiossa 50 ng kuoppaa kohti lisättiin. Viisi minuuttia lisäyksen jälkeen 2,2'-atsino-bis (3-etyylibentsotiatsoliini-6-sulfonihappo) (ABTS) peroksidaasin substraattiliuosta, absorbanssi luettiin 405 nm: ssä (OD 405 nm).
Histopatologinen tutkimus
Pitkittäiset mahalaukun kudos nauhat fiksoitiin 4% fosfaattipuskuroidussa formaldehydi, käsitellyt standardimenetelmillä ja upotettiin parafiiniin. Arviointiin gastriitti, hematoksyliini- - eosiinilla (HE) värjätyt leikkeet 5 um sokeasti pisteytetään perustuvat aste tunkeutuvia lymfosyyttejä, plasma solujen ja neutrofiilit, käyttäen kipujanalla samanlainen Päivitetty Sydney System (asteikolla 0- 3) [17] kanssa seuraavat vaatimukset kunkin gastriitti pisteet: 0 = ei soluttautuminen mononukleaaristen ja /tai polymorfonukleaarisiin soluja; 1 = lievä diffuusi soluttautumista mononukleaaristen ja /tai polymorfonukleaarisiin soluja; 2 = kohtalainen diffuusi tunkeutumisen mononukleaaristen ja /tai polymorfonukleaaristen solujen ja /tai kun läsnä on yksi tai kaksi tulehduksellinen aggregaatteja; 3 = diffuusin soluttautumista mononukleaaristen ja /tai polymorfonukleaarisiin soluja ja /tai läsnä on vähintään kolme tulehduksellinen aggregaatteja.
Tilastollinen analyysi
Normaalius ja varianssi tietojen yhdenmukaisuutta analysoitiin D'Agostino-Pearson ja Shapiro- Wilk normaalius testi. Merkittävät erot H. suis
kolonisaation ja mRNA sytokiiniekspressiota ryhmissä arvioitiin suorittamalla yksisuuntainen ANOVA. Bonferronin monivertailutesti käytettiin post-hoc, kun yhtä suuri vaihtelut arvioitiin. Dunnettin T3 post-hoc testiä käytettiin kun ei yhtä suuri vaihtelut arvioitiin. OD 405nm tasoja ELISA ja histologista tulehdus pisteitä verrattiin Kruskall-Wallis analyysi, jota seuraa Mann-Whitneyn U
testi. Sillä muuttujien välisiä riippuvuuksia, Spearmanin rho kerroin (ρ
) laskettiin. GraphPad Prism5 ohjelmisto (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) käytettiin kaikkiin analyyseihin. Tilastollisesti merkittäviä eroja ryhmien katsottiin p
< 0,05.
Tulokset
Immunoproteomics H. suis
H. suis
proteiinit erotettiin 2D-PAGE (kuvio 2a). Sen jälkeen, kun 2D-immunoblottaus yhdistettiin seerumien lysaattia-immunisoiduista (kuvio 2b) tai H. suis
infektoiduista eläimistä (kuvio 2c), yhteensä 19 immunoreaktiivisia proteiinin kohdetta valittiin. Nämä paikat olivat sovitettu proteiini paikkoja, jotka voitaisiin nähdä rinnakkain 2D-PAGE (kuvio 2a). Pieni reaktiivisuus vastaan ​​H. suis
proteiinit havaittiin infektion jälkeen seerumit verrattuna suuri reaktiivisuus seerumeita vastaan ​​lysaatin-immunisoiduista hiiristä. Kun blot koettimena yhdistetyistä seerumeista saatu negatiivinen kontrolli hiiriä, mitään erityistä immunoreaktiivisen proteiinin kohdetta havaittiin (Additional file1). Täplät kohteisiin (n
= 19) leikattiin pois geelistä, pilkottu ja tunnistetaan LC-MS /MS-analyysi. Yksityiskohtaiset tulokset näistä proteiineista on koottu taulukkoon 1. kohteet korkeimman reaktiivisuus (spot 1-5) tunnistettiin UreB. H. suis
chaperonin GroEL, kuvataan täplät 9 ja 10 kuviossa 2a, osoitti myös vahva hybridisoimalla seerumeilla lysaatin-immunisoiduista eläimistä. Lisäksi seerumit lysaatin-immunisoidut hiiret osoittivat vahvaa reaktiivisuus vastaan ​​ureaasi lisälaite proteiini (UreH) ja ureaasi alayksikkö A (urea) (huomasi 15. 19.), joka oli vähäisempää tartunta ryhmässä. Heikko reaktiivisuus vastaan ​​suuria flagelliini Flaan (huomasi 11-13) oli läsnä molemmissa bloteissa. Kuvio 2 H. suis 2D-prote- profiili (A) ja Western blot-kaksoiskappaleen 2D-geeli reagoimaan yhdistetyt seerumit lysaatin-immunisoitujen hiirten (B) tai H. suis infektoiduista hiiret (C). 100 ug kokonaisproteiinia uutteen H. suis
erotettiin 2D-elektroforeesilla käyttämällä lineaarista pH-arvoon 3 stä 10: een gradientti ensimmäisessä ulottuvuudessa ja 10% Tris-HCl SDS-PAGE toisessa ulottuvuudessa. Erotetut proteiinit havaittiin SYPRO®Ruby Protein värjäys. Laatikkoon merkitty alueet osoittavat, jossa immunoreaktiivisia antigeenejä leikattiin geelistä ja alistettiin LC-MS /MS: llä. Tunnistetut proteiinit on merkitty paikalla numerot esitetty taulukossa 1. Laatikot ja numerot punaisella havaittiin UreB. Asema molekyylipaino (MW) annetaan oikealla, ja pH annetaan alareunassa.
Taulukko 1 Immunoreaktiiviset proteiinit H. suis tunnistetaan LC-MS /MS
Spot no.1

proteiini nimi
NCBI ID2
Gene
Pi3
MW3
No. Hyväksytty peptidit
Mascot score4
Cov. (%) 5
1
ureaasi alayksikköä B
EFX42254
ureB
5,97
62,967
117
1589
72
2
ureaasi alayksikköä B
EFX42254
ureB
5,97
62,967
80
1042
58
treonyyli-tRNA-syntetaasin
EFX41598
thrS
6,34
69,315
7
186
60
3
ureaasi alayksikköä B
EFX42254
ureB

5.97
62,967
80
903
46
4
ureaasi alayksikköä B
EFX42254
ureB
5,97
62,967
4
103
6
5
ureaasi alayksikköä B
EFX42254
ureB
5,97
62,967
4
103
6
6
30S ribosomaalisen proteiinin S1
EFX42427
rpsA
8,29
64,051
23
625
28
ki--reaktiivinen Ni /Fe hydrogenase, suuri alayksikkö
EFX41851
hydB
8,22
64,943
19
520
28
ureaasi H. heilmannii
AAA65722
8,86
25,844
8
258
26
7
metyyli-hyväksymällä kemotaksista proteiini
EFX43528
7,1
48,907
35
905
50
8
elongaatiotekijän G
EFX41637
Fusa
5,15
77,242
57
1066
55
9
chaperonin GroEL
EFX42237
groEL
5,58
58,498
150
3085
78
10
chaperonin GroEL
EFX42237
groEL
5,58
58,498
135
2647
73
ureaasi alayksikköä B
EFX42254
ureB
5,97
62,967
43
682
41
11
Flagelliini
EFX41982
Flaan
7,77
54,232
29
756
47
12
Flagelliini
EFX41982
Flaan
7,77
54,232
57
1294
62
13
Flagelliini
EFX41982
Flaan
7,77
54,232
46
1085
63
Trigger tekijä
EFX42378
tig

5.13
49,587
12
343
24
14
hydrogenase ilme /muodostumista proteiinin
EFX41790
HYPB
5,59
27,617
15
314
35
nikotinaatti-nukleotidin fosforylaasin
EFX42191
NADC
6,46
30,591
11
219
25
7-alfa-hydroksisteroididehydrogenaasi
EFX41880
6,62
28,246
6
186
24
Konservoituneet hypoteettinen erittyvä proteiini
EFX42511
hdhA
5,84
28,011
5
174
19
Hypothetical proteiini HSUHS5_0308
EFX42276
5,47
29,471
9
171
24
Peroxiredoxin
EFX42277
5,84
25,811
7
107
19
15
ureaasi apuproteiinin
EFX42255
ureH

6,79
30,447
4
106
13
16
ureaasi alayksikköä
EFX42255
urea
7,79
27,389
24
270
55
17
ureaasi alayksikköä
EFX42255
urea
7,79
27,389
28
112
45
18
ureaasi alayksikköä
EFX42255
urea
7,79
27,389
57
418
69
19
ureaasi alayksikköä
EFX42255
urea
7,79
27,389
75
568
73
1 Protein paikka vastaa asemaa geelillä ja blotteja ( katso kuva 2).
2NCBI
: National Center for Biotechnology Information.
3 Teoreettinen isoelektrinen piste (pl) ja molekyylipainon (MW).
4 Helicobacter
tiedot, Mascot tulokset suurempi kuin 40 ovat merkitseviä (p
≤ 0,05).
5% proteiinisekvenssin, joita peptideistä, jotka tunnistetaan.
Vahvistus seerumin reaktiivisuus vastaan ​​rUreB
2D-analyysin, UreB osoitti erillinen reaktiivisuutta seerumien kanssa lysaatin-immunisoiduista hiiristä, joka ei havaittu seerumeissa ei-immunisoiduista, mutta tartunnan hiirillä. Jotta voitaisiin vahvistaa nämä tiedot, 1D-PAGE ladattu rUreB suoritettiin, minkä jälkeen immunologinen seerumien kanssa lysaatin-immunisoitujen ja H. suis
infektoiduista hiirillä. 0,01. Kaikki kirjoittajat luettu ja hyväksytty lopullinen käsikirjoitus.

• Karakterisointi geenin ilmentymisen profiilien eri syöttösolut yhdistettiin hiiren vatsan osa-alueiden RNA-monistus method
• Kliinis ominaisuudet sekä varoituksia analyysi Lauren luokittelun mahalaukun adenokarsinooma China