Aryylihiilivetyreseptori reitin aktivaatio lisää mahasyövän solu invasiivisuus todennäköisesti läpi c-Jun-riippuvaista induktion matriksimetalloproteinaasi-9

aryylihiilivetyreseptori reitin aktivaatio lisää mahasyövän solu invasiivisuus todennäköisesti läpi c-Jun-riippuvaista induktion matriksimetalloproteinaasi-9
tiivistelmä
tausta
Abberant aryylihiilivetyreseptori (AhR) ilmaisun ja AhR aktivointi ovat mukana mahasyövän. Kuitenkin suhde AhR aktivointi ja mahalaukun syövän etenemisessä on edelleen epäselvä. Nykyisessä tutkimuksessa käytimme 2,3,7,8-tetraklooridibentso-para-dioksiinia (TCDD), klassinen ja voimakkaimmista ligandi AhR, aktivoida AhR ja tutki vaikutusta AhR aktivointia ihmisen mahasyövän AGS solu invaasio ja tutkitaan vastaavaa mekanismia.
tulokset
voit selvittää AhR voidaan aktivoida AGS soluissa, tutkimme ilmaus CYP1A1, klassinen kohde geenin AhR jälkeen TCDD. RT-PCR: llä ja western blot-analyysi osoitti, että sekä CYP1A1 mRNA: n ja proteiinin ilmentyminen lisättiin annoksesta riippuvalla tavalla seuraavat TCDD hoidon ja AhR antagonisti resveratrolin (RSV) voisi kääntää TCDD-induced CYP1A1 ilmentymistä. Sen määrittämiseksi, onko TCDD hoitoon AGS soluissa johtaa induktion MMP-9: ilmaisu, havaitsimme MMP-9 mRNA käyttäen RT-PCR: ää ja havaitaan MMP-9: n entsymaattinen aktiivisuus käyttäen gelatiinitsymografialla. Tulokset osoittivat, että sekä MMP-9 mRNA ilmaisun ja entsyymiaktiivisuus vähitellen lisääntyi pitoisuuden kasvu TCDD median ja nämä muutokset voitaisiin kumota RSV hoito annoksesta riippuvaisella tavalla. Sen tutkimiseksi, onko AhR aktivaation aiheuttamaa MMP-9 ilmaisun ja aktiivisuuden AGS soluissa johtaa lisääntyneeseen muuttoliikkeen ja invaasio, suoritimme haavojen migraatiokokeessa ja siirtokuoppaan muuttoliike ja invaasiomääritys. Sen jälkeen TCDD hoito, vaellusetäisyydet ja siirtyminen ja hyökkäys kyvyt AGS soluja kasvoi annoksesta riippuvalla tavalla. Osoittaakseen AhR aktivaation aiheuttamaa MMP-9 ilmaisun välittyy c-Jun, siRNA transfektio suoritettiin vaientaa c-Jun mRNA AGS soluissa. Tulokset osoittivat, että MMP-9 mRNA: n ilmentymisen ja aktiivisuuden käsittelemätön kontrolli AGS solut olivat erittäin heikko; Sen jälkeen TCDD (10 nmol /l) hoito, MMP-9 mRNA ilmaisun ja toimintaa olivat merkittävästi lisätä; Tämä TCDD aiheuttama MMP-9 ilmaisun ja aktiivisuuden lisääntyminen voitaisiin poistettiin c-Jun-siRNA transfektiota.
Päätelmä
AhR aktivointi lisää mahasyövän solu invasiivisuus todennäköisesti läpi c-Jun-riippuvaista induktio MMP-9. Tuloksemme antaa käsityksen mekanismi ja toiminta AhR ja sen vaikutus mahalaukun syövän etenemisessä.
Tausta
aryylihiilivetyreseptori (AhR) on ligandiaktivoituja transkriptiotekijä perus helix-loop-helix /per-Arnt-Sim perhe. Koska ligandin, AhR on läsnä sytosoliin muodossa kompleksin, jossa on kaksi kaperoni- Hsp90s, smal proteiinin (p23), ja immunofiliini-kaltaisen proteiinin (XAP2) [1, 2]. Ligandin kuten 2,3,7,8-tetraklooridibentso-para-dioksiinia (TCDD, tehokkain ja klassisen eksogeenisen AhR ligandia) sitovia, chaperon proteiinit hajoavat ja AhR translokoituvat tumaan muodostaa heterodimeerin kanssa sen kumppanin molekyyliin aryyli- hiilivety-reseptorin ydinaseiden translocator (ARNT) [3, 4]. Tämä heterodimeeri sitoutuu spesifiseen DNA-alue, jota kutsutaan dioksiinin vaste-elementin (DRE), jossa on ydin sekvenssi 5'-TNGCGTG-3 ', ja aktivoi täten akun geenien ilmentymistä [5-7].
Historiallisesti tutkimukset ja AhR on keskitytty transkription säätelyyn geenejä, jotka koodaavat xenobiotic metaboloivien entsyymien, kuten sytokromi P450-entsyymien [8]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat läheinen suhde AhR ja maitorauhasen kasvaimen kehittymisen [7, 9]. AhR geenipolymorfismien on liitetty suurentunut keuhko- ja rintasyöpiä [10, 11]. Lisääntynyt ilmentyminen AhR on raportoitu keuhko-, rinta-, ja haiman syövät ihmisissä [7, 12, 13]. Tutkimukset viittaavat myös siihen, että konstitutiivisesti aktiivinen AhR voi edistää hepatokarsinogeneesin hiirissä [14]. Nämä tiedot osoittivat läheinen suhde AhR ja kasvaimen kehittymisen. Kuitenkin suhde AhR ja syövän etenemistä ei ole selvä.
Tuumorisolut ja metastaasit on monimutkainen prosessi, joista hajoamista soluväliaineen (ECM) ja tyvikalvon on ratkaiseva askel. Kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden vetoaa ilmaisun matriksin metalloproteinaasien (MMP) tuhota ECM ja tyvikalvon sallimaan solujen vaeltamiseen. MMP ovat ryhmä sinkki riippuvainen metallopeptidases [15-17]. Matriksimetalloproteinaasi-9: n (MMP-9) on yksi tyypin IV kollagenaasi /gelatinaasit, jotka hajottavat tyvikalvon kollageenien ja liivatteen [16]. MMP-9 on laajalti liittyy kasvaimen invaasion ja metastaasin [17]. Synteesi MMP-9 säätelevät useat kasvutekijät, sytokiinit ja hormonit [16, 18]. Tuore tutkimus liittyy TCDD liittyvää vaurioita poikkeava matriisi aineenvaihdunta [8]. Microarray tiedot osoittavat, että TCDD /AhR muuttaa geenien ilmentymistä osalliseksi matriisissa aineenvaihduntaan ja laskeuman [8]. Villano et ai [19] ja Haque et ai [18] on raportoitu, että AhR agonisti TCDD voivat aiheuttaa MMP-9 ilmentymisen huamn melanoomasolujen ja eturauhasen syöpäsoluja. Nämä tutkimukset viittaavat siihen, että MMP-9: n ilmentyminen olla yhteinen päätepiste aktivoimiseksi AhR [8, 19].
Mahasyöpä on neljänneksi yleisin maligniteetti ja toiseksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolemaan maailmassa [20]. Mahalaukun syöpäsolujen invaasiota ja etäpesäkkeiden johtavat usein huono ennuste. Useat tutkimukset, jotka liittyvät AhR aktivointi mahasyövän. Chen et al löytyi lisääntynyt ilmentyminen AhR kahdessa ihmisen mahasyövän solulinjoissa (RF1 ja RF48) microarray analyysi [21]. Ma et ai raportoi, että samanaikainen ilmentyminen AhR ja CYP1A1 korreloi mahalaukun syövän kehityksen [22]. Andersson et al havaitsivat, että konstitutiivisesti aktivoitu AhR voivat aiheuttaa vatsan kasvaimia siirtogeenisen hiiren mallia [23]. Toisessa meidän tutkimuksia, huomasimme, että AhR ilmaisun ja tumaansiirtymiseen olivat merkittävästi korkeammat mahasyövän kuin syöpää edeltävät vauriot ja normaalin mahan limakalvoa [24]. Kuitenkin suhde AhR aktivointi ja mahasyövän invaasio ja etäpesäkkeiden ole vielä selvää. Siksi tutkimme vaikutus AhR aktivoinnin ihmisen mahalaukun syöpäsoluja. Tuloksemme esitetään tässä osoittavat, että AhR voidaan aktivoida mahasyövässä AGS solujen ja AhR aktivaatio AGS soluissa indusoi MMP-9 ilmaisun ja parantaa AGS solujen maahanmuuton ja invaasion toimintaa. Lisäksi meidän tiedot osoittavat, että tämän AhR aktivaation indusoimaa MMP-9 ekspressio välittyy c-Jun.
Tulokset ja pohdinta
AhR aktivaation AGS soluissa
toisessa meidän tutkimuksissa olemme osoittaneet, että on olemassa oli korkea AhR ilmentymisen AGS soluissa [24]. Voit selvittää AhR voidaan aktivoida tässä solulinjassa, tutkimme ilmaus sytokromi P-450 1A1 (CYP1A1), klassinen kohde geenin AhR jälkeen AhR agonisti TCDD. RT-PCR: llä ja western blot-analyysi osoitti, että sekä CYP1A1 mRNA: ta (Fig. 1A) ja proteiini (Fig. 1 B) ekspressio AGS solut kasvoivat annoksesta riippuvalla tavalla seuraavat TCDD hoitoon. Sen määrittämiseksi, onko tämä TCDD aiheuttama CYP1A1 ilmaisu on AhR riippuva, ​​AhR antagonisti resveratrolin (RSV) käytettiin estämään AhR. Kuten on esitetty kuviossa. 1C ja 1D, RSV voi kääntyä TCDD-induced CYP1A1 ilmentymisen annoksesta riippuvalla tavalla. Nämä tiedot osoittivat, että AhR voidaan aktivoida AGS soluissa TCDD. Kuva 1 AhR agonistin TCDD ja AhR antagonisti RSV säännelty CYP1A11 ilmentymistä AGS soluissa. Sen jälkeen kun eri pitoisuuksilla (kuten yllä) TCDD hoidon 24 tunnin ajan, (A) RT-PCR-analyysi CYP1A1 mRNA: n ekspression pitoisuus-vaste. (B) Western blot-analyysi CYP1A1-proteiinin ilmentymistä pitoisuus-vaste. Sen jälkeen, kun yhtäaikainen käsittely TCDD (1 nM) ja RSV (eri pitoisuuksina, kuten on esitetty edellä) 24 tunnin ajan, (C) mRNA-ekspressiota CYP1A1 havaittiin RT-PCR: llä. (D) Proteiinin ilmentymistä CYP1A1 havaittiin Western blot.
AhR aktivaation AGS solut indusoivat MMP-9 ilmentymisen
Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että useat syöpäsolut, AhR agonisti TCDD aktivoi MMP-9-geenin ilmentymisen [18, 19]. Sen määrittämiseksi, onko TCDD hoitoon AGS soluissa johtaa induktion MMP-9: ilmaisu, havaitsimme MMP-9 mRNA käyttäen RT-PCR seuraavista TCDD. Kuten on esitetty kuviossa. 2A, MMP-9 mRNA: n ilmentyminen indusoitiin annoksesta riippuvalla tavalla seuraavat TCDD hoitoon. Jotta voidaan tutkia roolia AhR välittämisessä TCDD aiheuttama MMP-9 ilmaisun AGS viljelmät olivat yhdessä käsitelty TCDD ja AhR antagonisti resveratrol. Samanaikainen käyttö resveratrolin poisti TCDD-induced MMP-9 ilmaisun (kuva 2C) osoittivat, että TCDD-aktivointi MMP-9 ilme riippuu AhR. Edellä esitetyt tiedot osoittavat, että AhR aktivaation AGS soluissa indusoi MMP-9 mRNA ilmaisun. Useimmissa solutyypeissä, geenin transkription MMP-9 on indusoitavissa, ja translaation jälkeen entsyymi on välittömästi erittyy, ja aktivoidaan kysteiini-kytkimen avulla [25]. Sen määrittämiseksi, ovatko nämä muutokset geenien ilmentyminen seuraavissa AhR aktivaation aiheuttaa muutoksia MMP-9 entsyymiaktiivisuus, suoritimme gelatiinitsymografialla. Tulokset osoittivat, että MMP-9: n aktiivisuutta media on vähitellen kasvanut pitoisuuden kasvu TCDD media (kuva 2B) ja nämä muutokset voidaan kumota resveratrol hoito annoksesta riippuvaisella tavalla (kuva 2D). Nämä tiedot osoittavat, että AhR aktivaation indusoimaa MMP-9 ilmentyminen korreloi kasvun kanssa MMP-9 -aktiivisuuden. Kuvio 2 AhR agonistin TCDD ja AhR antagonisti RSV säädellään MMP-9 ilmaisun ja aktiivisuutta AGS soluissa. Sen jälkeen kun eri pitoisuuksilla (kuten yllä) TCDD hoidon 24 tunnin ajan, (A) RT-PCR-analyysi MMP-9 mRNA: n ekspression pitoisuus-vaste. (B) gelatiinitsymografialla analyysi MMP-9-proteiinin aktiivisuutta, jonka pitoisuus-vaste. Sen jälkeen, kun yhtäaikainen käsittely TCDD (1 nM) ja RSV (eri pitoisuuksina, kuten on esitetty edellä) 24 tunnin ajan, (C) mRNA MMP-9 havaittiin RT-PCR: llä. (D) proteiini MMP-9 havaittiin gelatiinitsymografialla.
AhR aktivointi lisää AGS solujen maahanmuuton ja invaasio
MMP-9 on yksi tyypin IV kollagenaasi /gelatinaasit, jotka voivat huonontaa ECM komponentteja. MMP-9 on laajalti liittyy kasvaimen invaasion ja metastaasin [17]. Tutkimukset ovat osoittaneet merkittävän korrelaation MMP-9 ilmaisun ja invasiivisuus ja imusolmuke etäpesäke mahakarsinoomat [26-28]. Sen tutkimiseksi, onko AhR aktivaation aiheuttamaa MMP-9 ilmaisun ja aktiivisuuden AGS soluissa johtaa lisääntyneeseen muuttoliikkeen ja invaasio, suoritimme haavojen migraatiokokeessa ja siirtokuoppaan muuttoliike ja invaasiomääritys. Jälkeen TCDD hoito, migraation etäisyys AGS solujen lisääntyi merkittävästi ja annoksesta riippuvalla tavalla verrattuna kontrollisolujen (P < 0,01) (kuva 3A). TranswellTM havaittiin merkittävä lisäys muuttoliikkeen (kuva 3B) ja hyökkäys (kuva 3C) kyvyt AGS kun soluja inkuboitiin TCDD pitoisuuksina 0,1 nmol /l (P < 0,01) 100 nmol /l ( p < 0,01). ole merkittävää vaikutusta muuttoliikettä ja invaasiota löytyi TCDD pitoisuus < 0,1 nmol /l (p > 0,05). Nämä tulokset osoittivat, että AhR aktivaatio lisää mahasyövän AGS solujen muuttoliikettä ja invaasiota. Hajoamista ECM ja tyvikalvon on olennainen askel kasvaimen invaasion ja metastaasin. Siihen liittyy toiminnan matriisin metalloproteinaasien (MMP). Tutkimuksemme osoitti, että AhR aktivointi voisi aiheuttaa MMP-9 ilmaisun ja entsyymiaktiivisuus, ja edistää AGS solujen muuttoliikettä ja invaasiota. Muut tutkimukset osoittivat, että AhR aktivointi voisi aiheuttaa erilaisia ​​MMP ilmaisun [19, 29]. AhR aktivointi lisää mahasyövän AGS solujen maahanmuuton ja hyökkäys voi olla myös johtua muista MMP ilmaisun lisäksi MMP-9 ilmaisun. Kuva 3 vaikutus AhR agonistin TCDD on AGS soluihin muuttoliikettä ja invaasiota. (A) Haavan paranemista migraatiokokeessa. (B) TranswellTM migraatiokokeessa. (C) TranswellTM invaasiomääritys.
C-Jun välittämä MMP-9 ilmaisun aiheuttama AhR aktivointi
mekanismia TCDD aiheuttamiin muutoksiin MMP-9 ilmaisu ei ole täysin selvä. Viimeaikaiset tutkimukset raportoitu, että TCDD voi aiheuttaa c-Jun ilmaisun [30, 31] ja c-Jun on tavoite geeni AhR [8]; promoottori sekvenssin 5'-reunustavan alueen ihmisen MMP-9-geeni sisältää c-Jun-sitoutumiskohtia [16], ja c-Jun voi indusoi MMP-9 ilmaisun [32]; transkription aktiivisuus c-Jun on merkittävä parannettuja mahasyövän [33]. Perustamalla Näiden tutkimusten ehdotimme hypoteesia, että TCDD aiheuttama MMP-9 ilmentyminen AGS soluissa välittyy c-kesäkuu Osoittaakseen tämän hypoteesin, ensin havainnut c-Jun ilmentymisen AGS soluissa TCDD hoidon, ja todettiin, että sekä c-Jun mRNA (kuva 4A ja 4C) ja proteiinia (kuva 4B ja 4D) ilmentyminen AGS solut kasvoivat annoksesta (kuva 4A ja 4B) ja ajan (kuva 4C ja 4D) riippuvasti seuraavat TCDD hoitoa, ja tämä TCDD aiheuttama c-Jun ilme voitiin varata AhR antagonisti resveratrolin (kuva 4E ja 4F). Edellä olevat tiedot osoittivat, että c-Jun on tavoite geeni AhR AGS soluissa. Edelleen osoittaa, että c-Jun voi välittää TCDD-induced MMP-9 ilmaisun, siRNA transfektio suoritettiin vaientaa c-Jun mRNA AGS soluissa. Tulokset osoittivat, että c-Jun-siRNA (lopullinen konsentraatio 50 nmol /l) transfektion lähes kokonaan poisti c-Jun ilmentymisen AGS-soluissa sekä mRNA-tasolla (kuva 4G) ja proteiinin tason (kuva 4H). Näin ollen, sen jälkeen kun c-Jun siRNA transfektio 48 tuntia, AGS solut käsiteltiin TCDD pitoisuus 10 nmol /l 24 tunnin ajan, solupelletti ja elatusaineet otettiin talteen, ja MMP-9 mRNA: n ilmentyminen ja aktiivisuus mitattiin. Kuten on esitetty kuviossa. 4I ja 4J, MMP-9 mRNA: n ilmentymisen ja aktiivisuuden käsittelemätön kontrolli AGS solut olivat erittäin heikko; Sen jälkeen TCDD (10 nmol /l) hoito, MMP-9 mRNA ilmaisun ja toimintaa olivat merkittävästi lisätä; Tämä TCDD aiheuttama MMP-9 ilmaisun ja aktiivisuuden lisääntyminen voitaisiin poistettiin c-Jun siRNA transfektion eikä saa vaikuttaa ohjaus siRNA transfektiolla. Edellä olevat tiedot osoittivat, että c-Jun välittämä MMP-9 ilmaisun aiheuttama AhR aktivaatio AGS soluissa. Kuva 4 c-Jun välittää TCDD-induced MMP-9 ilmaisun ja toimintaa. (A) TCDD indusoi c-Jun-mRNA: n ilmentymisen annoksesta riippuvalla tavalla. (B) TCDD indusoi c-Jun-proteiinin ilmentymisen annoksesta riippuvalla tavalla. (C) TCDD indusoi c-Jun mRNA: n ekspression ajasta riippuva tavalla. (D) TCDD indusoi c-Jun-proteiinin ilmentymistä ajasta riippuva tavalla. (E) RSV kumoaa TCDD-induced c-Jun-mRNA-ekspression. (F) RSV kumoaa TCDD-induced c-Jun-proteiinin ilmentymisen. (G) c-Jun siRNA hiljentää c-Jun-mRNA-ekspression. (H) c-Jun siRNA hiljentää c-Jun-proteiinin ilmentymisen. (I) c-Jun siRNA estää TCDD aiheuttaman MMP-9 mRNA ilmaisun. (J) c-Jun siRNA estää TCDD aiheuttaman MMP-9 -aktiivisuuden lisäys.
Päätelmä
Yhteenvetona esillä oleva tutkimus osoittaa, että AhR voidaan aktivoida mahasyövässä AGS solujen ja AhR aktivointi indusoi MMP-9 ilmaisun ja toimintaa, joka lopulta edistää AGS muuttoliikettä ja invaasion in vitro. Lisäksi meidän tiedot osoittavat, että tämä AhR aktivaation aiheuttamaa MMP-9 ilmaisun välittyy c-kesäkuu Koska hajoaminen ECM ja tyvikalvon on olennainen askel kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden, meidän tulokset tarjoavat käsityksen mekanismi ja toiminta AhR ja sen vaikutusta näihin prosesseihin aikana mahalaukun syövän etenemisessä. Tool Menetelmät
Soluviljely
Mahasyöpää solulinja AGS saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD), ja pidettiin RPMI 1640-alustassa (Hyclone), jota oli täydennetty 2 mM glutamiinia, 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone), 100 yksikköä /ml penisilliiniä, ja 100 ug /ml gentamysiiniä. Cellular ympäristö pidettiin 5% CO 2 ja 37 ° C: ssa. Solut kerättiin eksponentiaalisen kasvuvaiheen ja kokonais-RNA ja proteiini valmistettiin, kuten on kuvattu alla.
Solujen käsittely
TCDD ja resveratrolin ostettiin Sigma Chemical Company (Bellefonte, PA, USA). Kun oli inkuboitu 24 tuntia, solut käsiteltiin TCDD eri pitoisuuksina (0, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 nM) tai TCDD (1 nM) plus resveratrolin (0, 1, 5, 10, 20 uM) ja 24 tuntia, tai käsiteltiin TCDD (1 nM) ja eri aikaan (0, 1, 6, 24, 48, 72 tuntia), vastaavasti. Kaikki lääkkeet liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO). Ohjaus solut saivat 0,1% DMSO vain.
Sirna synteesiä
Pieni häiritsevät RNA: t (siRNA: t) syntetisoitiin ja korkean suorituskyvyn puhdistettu (Ribo Biotechnology, Guangzhou). c-Jun-siRNA: iden (sense, CCAAGAACGUGACAGAUGA-dTdT, antisense, UCAUCUGUCACGUUCUUGG-dTdT) ja ohjaus siRNA: t (sense, AGGAGAUAUUUCGAGGCUU-dTdT, antisense, AAGCUCGAAAUAUCUCCU-dTdT), jolla ei ole mitään homologiaa ihmisen minkään tunnetun geenejä, liuotettiin RNaasittomaan DDH 2O lopulliseen pitoisuuteen 20 umol /l.
Sirna transfektion
Soluja (5 x 10 5) maljattiin kuoppiin kuusi hyvin soluviljelylevyissä ja annettiin tarttua 24 tuntia. Neljä mikrolitraa Iipofectamine2000 (Invitrogen) per kuoppa lisättiin seerumittomaan Opti-MEM (Invitrogen) lopullisen kompleksinmuodostajia tilavuus 250 ui, sekoitettiin varovasti ja inkuboitiin huoneenlämpötilassa 5 minuuttia. Viisi mikrolitraa siRNA kuoppaa kohti laimennettiin 250 pl seerumitonta Opti MEM. Sekoita laimennetun siRNA-liuoksella ja laimennettiin Iipofectamine2000 varovasti ja inkuboi huoneen lämpötilassa 30 minuuttia. Iipofectamine2000 /siRNA kompleksi lisättiin kuoppiin, jotka sisältävät 1500 ui RPMI 1640 10% FBS: ää ja inkuboitiin normaalissa soluviljelmässä olosuhteissa. Kaikki määritykset suoritettiin 48 tunnin kuluttua.
RNA: n eristys ja RT-PCR
Kokonais-RNA solujen uutettiin käyttäen Qiagen RNeasy Mini Kit (Quiagen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA syntetisoitiin 1 ug: lla kokonais-RNA: sta käyttäen käänteistranskriptaasia, ReverTra AceTM (Toyobo Co, Osaka, Japani) seuraavissa olosuhteissa: 30 ° C: ssa 10 minuuttia, 42 ° C: ssa 20 minuutin ajan, 99 ° C: ssa 5 min, 4 ° C 5 min. PCR cDNA suoritettiin reaktioseoksessa (30 ui), joka sisälsi 2 ui templaatti-cDNA, 2,5 mM MgCl 2, 200 uM dNTP: itä, 0,3 uM aluketta 1 ja 2, ja 1 yksikön Taq DNA-polymeraasia (New England Biolabs). Monistus suoritettiin käyttäen seuraava ehto: 94 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 25-32 syklin (denaturoi 45 s 94 ° C: ssa, hehkuttaa 30 s, ja ne ulottuvat 30 s 72 ° C: ssa), ja sitten 72 ° C: ssa 7 min. Yksityiskohtia alukkeita, hehkutus lämpötila, monistussyklien, ja PCR-tuotteen koko kunkin geenin on lueteltu taulukossa 1. PCR-tuotteet ajettiin elektroforeesissa 1,5% agaroosigeelissä, värjättiin etidiumbromidilla ja visualisoitiin ultravioletti (UV) transilluminaattori. Kaistaintensiteettejä RT-PCR kvantitoitiin käyttäen Määrä Yksi kuvantamisen analyysin ohjelmisto. Kaistaintensiteettejä CYP 1A1, MMP-9 ja c-Jun mRNA normalisoitiin vastaaviin kaistaintensiteettejä beta-aktiini. Tiedot ilmoitettiin keskiarvona ± SD.Table 1 Alukesekvensseillä ja PCR-monistamisen olosuhteissa
Gene
Primers (5 '→ 3')

Hehkutus lämpötila (° C)
Cycles
Tuotteen koko (bp)
CYP1A1
S: CCATGTCGGCCACGGAGTT
59
32
174
V: ACAGTGCCAGGTGCGGGTT
MMP-9
S: CAACATCACCTATTGGATCC
52,5
37
480
V: CGGGTGTAGAGTCTCTCGCT
c-Jun
S : TCAGACAGTGCCCGAGAT
55.2
30
292
V: CTGCGTTAGCATGAGTTGG
Beta-aktiini
S: CTCGCTGTCCACCTTCCA
52
30
256
V: GCTGTCACCTTCACCGTTC
lyhenteet: S, sense-aluke; A, antisense-aluke
Western blot-analyysi
Solupelletit homogenoitiin hajotuspuskuria, joka sisälsi 20 mM Hepesiä, 1 mM EGTA, 50 mM β-glyserofosfaatti, 2 mM natriumortovanadaattia, 10% glyseroli, 1% Triton X- 100, 1 mM DTT: tä, ja 1 x proteaasi-inhibiittorin Cocktail (Roche, Mannheim, Saksa). Lysaattia sentrifugoitiin 13000 rpm ja 4 ° C: ssa 10 minuutin ajan. Supernatantti oli kokosolulysaattia. Proteiinipitoisuus mitattiin käyttäen BCA-proteiinimäärityksellä (Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Kolmekymmentä mikrogrammaa proteiinia kaistaa kohti, erotettiin 10% SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja siirrettiin tasapainotettiin polyvinylidiinidifluoridiin kalvon elektroforeesin. Membraanit blokattiin TBS-T-puskuria, joka sisälsi 5% (w /v) rasvatonta kuivamaitoa. AhR, CYP1A1, c-Jun ja beeta-aktiini havaittiin 2 tunnin ajan käyttäen vasta-aineita AhR (SC-5579, Santa Cruz Biotechnology, työskentely laimennus 1: 150), CYP 1A1 (AB1258, Chemicon International, työskentely laimennus 1: 500) , c-Jun (SC-1694, Santa Cruz Biotechnology, työskentely laimennus 1: 200) ja beeta-aktiini (DZ0, Cell Signaling Technology, työskentely laimennus 1: 1000). Sen jälkeen, kun sekundaarisen vasta-aineen inkuboinnin (työ- laimennus 1: 2000), parannettu kemiluminesenssin (Pierce Biotechnology, Inc.) määritettiin altistamalla röntgenfilmiä. Kaistaintensiteettejä Western blot kvantitoitiin käyttäen Määrä Yksi kuvantamisen analyysin ohjelmisto. Kaistaintensiteettejä CYP 1A1 ja c-Jun normalisoitiin vastaaviin kaistaintensiteettejä beta-aktiini. Data on ilmoitettu keskiarvona ± SD.
Gelatiinitsymografialla
Media päässä TCDD käsiteltyjen viljelmien tehtiin elektroforeesi SDS-PAGE-, jossa geeli sisältää 0,1% (w /v) gelatiinia. Geeli inkuboitiin yön yli Zn 2+ ja Ca 2+ sisältävällä puskurilla, jotta MMP takaisin niiden asianmukaisen rakenteen ja heikentää gelatiinia geelissä. Kirkas valkoisia raitoja Coomassie värjätty geeli on osoitus MMP toimintaa. Juovien voimakkuudet kvantitoitiin käyttäen Määrä Yksi kuvantamisen analyysin ohjelmisto.
Haavan paranemista migraatiokokeessa
mittaamista varten solumigraation haavan parantumisen aikana, AGS-solut ympättiin yksittäisiin kuoppiin 6-kuoppaiselle viljelylevylle. Kun solut saavuttivat konfluentin tilan, solu kerrokset haavoittui muovisella mikropipetin kärki, jolla on suuri aukko. Keskipitkällä ja roskat imettiin pois ja korvattiin 2,5 ml: lla tuoretta seerumitonta väliaineessa, joka sisälsi erilaisia ​​pitoisuuksia TCDD (0, 0,01, 0,1, 1, 10, 100 nM). Solut valokuvattiin välein 12 h kuluttua loukkaantumisesta faasikontrastimikroskopiassa. Arviointiin "haavan," viisi satunnaisesti valittua pistettä kummallakin haavan merkittiin, ja etäisyys vaakatasossa vaeltavat solujen alkuperäisestä haavan mitattiin. Tiedot ilmoitettiin keskiarvona ± SD.
TranswellTM maahanmuutto- ja invaasiomääritys
käsiteltyjä tai käsittelemättömiä kontrolli soluja ympättiin kolmena rinnakkaisena ylempään kammioon Transwell aseta (Corning, New York, NY, USA) seerumivapaassa tiheydellä 1 x 10 5 kohti. Siirrettävissä määrityksiä, elatusaineessa, joka sisältää 5% seerumia pantiin alempaan kammioon toimimaan kemoattraktanttia, ja soluja inkuboitiin edelleen 18 tuntia. Nonmigratory solut poistettiin yläkammion kaapimalla, ja solut jäljellä alapinnan sisäkkeen värjättiin 0,1% kristallivioletilla 15 minuutin ajan. Solut laskettiin mikroskoopin alla. Invasion määritykset tehtiin niin muutolle edellä kuvatut analyysit, paitsi insertit ennalta päällystetty soluväliaineen (ECM) korvaava matrigeelin (BD Biosciences) ja inkuboidaan yli 24 tunnin ajan. Kukin klooni maljattiin kolmena kappaleena jokaisessa kokeessa ja jokainen koe toistettiin ainakin kolme kertaa. Solumigraation (tai invaasio) kyky = (solujen määrä hoidetun ryhmän /solujen määrä kontrolliryhmän) x 100%.
Notes
Tie-Li Peng, Jie Chen vaikuttanut yhtä tähän työhön.
julistukset
Kiitokset
Tätä työtä tukivat seuraavat avustukset: avustuksina, National Natural Science Foundation of China (nro 30670949, nro 30671904 ja No.30871145), apurahan myönnetty uusia opettaja Kiinan valtiovarainministeriön Education (No.20070558288), joka on myönnetty avustus PhD ohjaaja Kiinan opetusministeriö (nro 20060558010), avustuksina, Natural Science Foundation of Guangdong (No.5300767 ja No.7001641).
Kirjoittajien alkuperäinen toimitti asiakirjat kuville
Alla linkkejä kirjoittajien alkuperäiset toimitti asiakirjat kuville. 12860_2008_376_MOESM1_ESM.tiff Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 1 12860_2008_376_MOESM2_ESM.tiff Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 2 12860_2008_376_MOESM3_ESM.tiff Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 3 12860_2008_376_MOESM4_ESM.tiff Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 4

• Ehdollinen selviytyminen analyysi Korean potilailla mahalaukun syövän joille parantava gastrectomy
• Toteutettavuus tehostetun toipuminen leikkauksen jälkeen mahalaukun leikkauksen: retrospektiivinen tutkimus