PLOS ONE: Livraison adénovirus du EMX2 gène supprime la croissance dans Human gastrique Cancer

Résumé

Contexte

EMX2 est un orthologue humain de la Drosophila
gène homeobox vide spiracles qui a été impliquée dans l'embryogenèse. Des études récentes suggèrent l'implication éventuelle de EMX2 dans les cancers humains; Toutefois, le rôle de EMX2 dans la carcinogenèse plus poussée.

Résultats

Dans cette étude, nous avons signalé que la régulation de l'expression des EMX2 était significativement corrélé avec le promoteur de EMX2 hyperméthylation dans le cancer gastrique. La restauration de l'expression EMX2 en utilisant un système d'administration de l'adénovirus dans des lignées cellulaires de cancer gastrique dépourvues d'expression de EMX2 endogène conduit à l'inhibition de la prolifération cellulaire et la voie de signalisation Wnt fois in vitro et dans un modèle de xénogreffe de cancer gastrique in vivo. En outre, nous avons observé que les animaux traités avec le vecteur d'expression de EMX2 adenoviral était significativement meilleure survie que ceux traités avec le vecteur vide adénoviral.

Conclusion

Notre étude suggère que EMX2 est un suppresseur de tumeur putatif cancer de l'estomac humain. Les adenovirus EMX2 pourrait avoir un potentiel en tant que nouvelle thérapie génique pour le traitement des patients atteints d'un cancer gastrique

. Référence: Li J, Lu M, Chen Z, Chen Z, Q Sheng Mu H, et al. (2012) Livraison à adénovirus de l'EMX2 gène supprime la croissance dans le cancer gastrique humain. PLoS ONE 7 (9): e45970. doi: 10.1371 /journal.pone.0045970

Editeur: Masaru Katoh, National Cancer Center, le Japon

Reçu le 13 Avril 2012; Accepté le 23 Août 2012; Publié le 21 Septembre, 2012 |

Droit d'auteur: © Li et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenue par des fonds du Programme clé national de recherche et de développement de base (973) de la Chine (2011CB910800 et 2012CB917304), la national Natural science Foundation de Chine (31170732), la Fondation des sciences naturelles de la province du Zhejiang (Y2101329), et la science postdoctorales Fondation de la province du Zhejiang (2010-BSH-031). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique est le quatrième cancer le plus fréquent et la deuxième cause la plus fréquente de décès liés au cancer dans le monde [1], [2], [3]. Bien que son incidence mondiale a diminué, l'incidence reste élevée dans les pays asiatiques [2], [4], [5]. La plupart des patients atteints de cancer gastrique sont diagnostiqués à un stade avancé [6]. En dépit de l'amélioration des stratégies de traitement [7], [8], la survie à 5 ans des patients atteints d'un cancer gastrique avancé qui ont reçu des thérapies conventionnelles reste inférieure à 30% [4]. Par conséquent, des approches alternatives sont nécessaires d'urgence.

La thérapie génique, y compris le système de distribution gène viral et non viral, est une approche prometteuse pour le traitement du cancer [9]. Parmi tous les systèmes actuellement disponibles, l'adénovirus recombinant (Ad) vecteurs sont particulièrement prometteurs. Les avantages de vecteurs Ad comprennent la capacité de produire des titres élevés, la capacité d'infecter la division et non la division des cellules de manière efficace, la stabilité du génome, et de faibles niveaux d'intégration d'ADN dans le génome de l'hôte [9], [10]. Il a été rapporté que la restauration des gènes grâce à cette approche conduit à une régression tumorale et induit l'apoptose in vivo
sans affecter les tissus normaux [11], [12], [13].

EMX2, l'orthologue humain de la Drosophila
spiracles vides (ems) gène homeobox, appartient à la famille des gènes Homeobox codant des protéines régulatrices de la transcription (homéoprotéine) essentiels pour de nombreux aspects de la croissance et la différenciation [14]. EMX2 joue un rôle essentiel au cours du cerveau [15] et le développement du squelette [16]. Les souris hébergeant des mutations homozygotes EMX2 présentent spectaculaire réduction de la taille des zones caudales-médiale, y compris cortex occipital et de l'hippocampe [17], [18], [19]. Perturbation de l'expression EMX2 peut modifier le taux de cellules souches neurales adultes [20] de la prolifération. EMX2 contrôle également la reproduction des mammifères en ajustant la prolifération des cellules de l'endomètre sans affecter la différenciation [21].

Des études récentes suggèrent l'implication éventuelle de EMX2 dans les cancers humains [22], [23], [24], [25]. Par exemple, EMX2 a été démontrée comme un suppresseur de tumeur dans le cancer du poumon et une expression basse de EMX2 est associée à une diminution de la survie globale et la survie sans récidive chez les patients atteints d'adénocarcinomes du poumon [22], [23]. Il est également signalé que l'expression de EMX2 est abondant dans l'endomètre normal des femmes ménopausées, mais absente ou réduite dans les tumeurs de l'endomètre, et les niveaux EMX2 sont corrélés négativement avec la prolifération [24], [25]. En outre, EMX2 peut réguler la tumorigenèse par voie de signalisation Wnt, un chemin critique de régulation cellulaire détermination du destin, le développement des tissus et la tumorigenèse [26], [27], [28]. EMX2 se trouve comme un répresseur directe d'expression Wnt1, et frapper vers le bas du gène EMX2 induit l'expression ectopique de Wnt1 dans le télencéphale développement et dysplasie corticale [29]. silençage épigénétique de l'expression EMX2 peut être importante pour l'activation aberrante de la voie de signalisation Wnt dans le cancer du poumon, et par conséquent la prolifération et les métastases [22]. Cependant, la fonction de EMX2 durant la tumorigenèse et le mécanisme correspondant doivent encore être élucidés. Dans cette étude, nous présentons EMX2 comme un suppresseur de tumeur putatif dans le cancer gastrique humain. Nous démontrons la régulation négative de EMX2 et sa corrélation avec l'état de méthylation de la région du promoteur du gène dans le cancer gastrique. Nous montrons également que la restauration de EMX2 en utilisant un système d'administration adenoviral inhibe la prolifération cellulaire et la signalisation Wnt in vitro
, et les résultats dans une meilleure survie d'un modèle de xénogreffe de cancer gastrique in vivo
. Nos données suggèrent fortement le potentiel thérapeutique de l'utilisation de l'Ad-EMX2 que la thérapie génique pour le traitement futur des patients atteints de cancer de l'estomac.

Matériel et méthodes de

Déclaration
éthique

Cette étude a été approuvé par le comité d'éthique de l'Hôpital Xuanwu, Université médicale de la capitale à Beijing. Un consentement éclairé écrit approuvé par le comité d'éthique, a été obtenu pour chaque patient avant le prélèvement d'échantillons de tissus.

Culture cellulaire, 5-aza-2'-désoxycytidine (CAD) /trichostatine A (TSA) Traitement et des échantillons de tissus

lignées cellulaires de cancer gastrique humaine (AZ521, AGS et MKN28) ont été obtenus à partir de la Chine Center for type Culture Collection (Wuhan, Chine). Les lignées cellulaires ont été cultivées dans Eagle modifié du milieu de Dulbecco additionné de 10% de sérum bovin fœtal, de la pénicilline et de la streptomycine à 37 ° C dans un incubateur humide avec 5% de CO _{2. Pour analyser la restauration du gène EMX2, les cellules ont été traitées avec 4 uM DAC ou 300 nM TSA (Sigma, St. Louis, USA) pendant 4 jours, avec remplacement du milieu frais contenant la même dose de DAC ou TSA quotidienne. Les cellules témoins ont été cultivées avec du milieu frais contenant du DMSO. Les cellules ont été par conséquent récoltées pour /extraction de l'ARN de l'ADN.}

Un total de 20 tissus blocs fixés au formol paraffine (10 tissus de cancer gastrique et 10 tissus normaux adjacents), ainsi que l'ARN total de 15 échantillons de dysplasie gastrique et 20 échantillons chirurgicaux du cancer gastrique ont été obtenus à partir de l'hôpital Xuanwu, Université médicale de la capitale à Beijing. L'ARN total et l'ADN génomique extrait de tissus gastriques adultes normaux humains ont été achetés chez Biochain (Hayward, CA, USA).

Topflash /Fopflash reporters de l'ADN des constructions contenant de type sauvage et mutant TCF /LEF les sites respectivement ont été aimablement fournies par le Dr Yeguang Chen (Université de Tsinghua, Beijing, Chine) contraignant. Un mutant CTNNB1 (S45Y) construction d'ADNc a également été aimablement fourni par le Dr Yeguang Chen (Université de Tsinghua, Pékin, Chine). vecteurs adénoviraux recombinants exprimant EMX2 et le vecteur de contrôle ont été achetés chez Vector Biolabs (Vector Biolabs, Burlingame, CA, USA).

spécifique à la méthylation PCR (MSP) et bisulfite Sequencing (BS)

la conversion au bisulfite à partir de tissus et de cellules ont été réalisées sans la condition préalable pour la purification de l'ADN en utilisant le kit EZ méthylation de l'ADN-direct (Zymo, orange, CA, USA). Les tissus FFPE ont d'abord été de-paraffinées dans le xylène (Sigma) et réhydraté dans de l'éthanol classé, avant le traitement au bisulfite selon les instructions du fabricant. Pour MSP, l'ADN modifié est amplifié en utilisant des amorces de MSP (énumérés ci-dessous), qui soit les séquences du promoteur de EMX2 méthylés ou non méthylés après traitement au bisulfite spécialement reconnues. PCR a été effectuée dans un volume final de 20 ul contenant 1 x MSP tampon de réaction [30], 0,5 uM de chaque amorce et 1 U de Zymo
Taq ™ DNA Polymerase (Zymo). état de PCR était le suivant: 10 min à 95 ° C; 40 cycles de 30 s à 95 ° C, 30 s à 50 ° C et à 30 à 72 ° C; et 7 min extension finale à 72 ° C. Pour BS, l'amplification de l'ADN bisulfite converti a été réalisée dans un volume final de 50 ul contenant 1 uM de chaque amorce de BS et 2 U de Zymo Taq
™ DNA Polymerase. état de PCR était le suivant: 10 min à 95 ° C; 40 cycles de 30 s à 95 ° C, 40 s à 55 ° C et 1 min à 72 ° C; et 7 min extension finale à 72 ° C. Les produits de PCR ont été clones dans PMD-18T (Takara, Dalian, Chine). Soit 5 ou 3 clones positifs choisis au hasard dans chaque groupe ont été séquencés à Shanghai Invitrogen (Shanghai, Chine). Amorces étaient les suivantes:

MSP-M (avant): 5' '

MSP-M (inverse)
: 5'GAATTAAAATAAACGCCCCTACCGAC-3' TAGTTTTTTGTTCGTTTCGCGTTTC-3

MSP-U (en avant): 5'-GTTTTTTGTTTGTTTTGTGTTTTGA-3 '

MSP-U (inverse): 5'-CCAAATTAAAATAAACACCCCTACCAAC-3'

BS-A (avant): 5 ' -GTTTGTAAATTTTTTTGGAAGGATTT-3 '

BS-A (inverse): 5'-AACAAAAAACTATCCTTAACCACCA-3'

BS-B (vers l'avant): 5'-GGTTAGGGATTTTGTAGGGAT-3 '

BS-B (inverse): 5'-AAAATCACATAAACAACTTCCTCC-3 '

immunohistochimie (IHC)

IHC a été réalisée en suivant le protocole standard. Les anticorps utilisés dans l'étude comprenaient Ki67 souris anti-humaine (1:100; BD, San Jose, CA, USA) et de la souris EMX2 anti-humain (1:500; Pierce, Rockford, IL, USA), et Alexa 594 conjugué anticorps de chèvre anti-souris secondaire (1:200; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Les lames ont été également de contraste avec hochest 33342 (Invitrogen). Zeiss LSM 710 microscope confocal (Oberkochen, Allemagne) a été utilisé pour examiner la coloration. L'intensité de Ki67 a été quantifiée en utilisant l'image Pro® Plus. EMX2 coloration a été visualisée avec le kit Histostain plus DAB (large spectre, Invitrogen) selon les instructions du fabricant, de contraste avec l'hématoxyline (Sigma), et photographié en utilisant un Leica SCN400 slide scanner (Leica, Allemagne).

Luciferase Assay

Les cellules à une densité de 5 x 10 ^{3 par puits ont été ensemencées dans des plaques à 24 puits avant transfection. Topflash ou Fopflash plasmides ont été co-transfectées avec PRL-TK plasmide. Après que les cellules ont été cultivées pendant 18 heures, l'activité luciférase a été mesurée par bi-Glo Luciferase Assay Système (Promega, Madison, USA). Le rapport entre l'activité luciférase de luciole (Topflash /Fopflash) et l'activité de Renilla a été utilisé pour l'activité TCF /LEF de transcription.}

immunotransfert

Les deux protéines totales (20 ug) et des extraits de cytoplasme (40 ug) ont été soumises à un immunotransfert. Les anticorps primaires anti inclus EMX2 (1:500; Pierce), anti-β-actine (1:5000; Sigma) et anti-cycline D1 (1:500; BD) et anti-c-Myc (1:200; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA).

Essai de prolifération

la croissance cellulaire a été déterminée par CellTiter 96 aqueuse prolifération Assay Kit (Promega). Les lignées de cellules ont été étalées dans des plaques à 96 puits de culture avec le nombre de 5 x 10 ^{2 cellules /puits. Après que les cellules ont été cultivées pendant plusieurs jours 0, 2, 3 et 4, les solutions de MTS ont été ajoutés au milieu et on a incubé pendant 1,5 h. L'absorbance à 490 nm a été mesurée en utilisant le modèle de lecteur de microplaques 680 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).}

Formation Colony Assay

Cellules (1 × 10 ^{3) infecté avec adénoviral vecteur exprimant EMX2 ou vecteur vide ont été ensemencées en triple dans des boîtes de 100 mm. Du milieu frais a été changé tous les 3 jours. Après avoir mis en culture pendant 3-4 semaines, les cellules ont été fixées avec 4% de paraformaldehyde pendant 10 minutes, on l'a lavé avec du PBS, colorées avec du violet cristal à 0,1% pendant 20 min et photographiés.}

Extraction de l'ARN et quantitative en temps réel après transcription inverse -PCR (RT-PCR)

extraction de l'ARN et en temps réel, une RT-PCR ont été effectuées comme décrit précédemment [31]. Les séquences d'amorces ont été décrites précédemment [22].

Modèle animal et vecteur adénoviral Livraison

Toutes les expériences de souris ont été réalisées dans des conditions exemptes d'agents pathogènes spécifiques dans l'animalerie de l'Université Tsinghua et approuvés par le Institutionnel animal Care et utilisation Comité de l'Université Tsinghua. xénogreffes de cancer gastrique ont été établies dans des souris nude femelles BALB /c 5 semaines d'âge. En bref, après avoir cultivé jusqu'à la confluence, MKN28 ou de cellules AGS sont trypisnized et remises en suspension dans du PBS (pH 7,4), puis mélangés 01:01 (v /v) avec du matrigel (Vigoureuse) à 4 ° C pour injecter une souris dans un volume total de 150 ul. Le mélange a été s.c. injecté dans le flanc droit de 16 souris femelles avec 10 ^{7 cellules par souris (jour 0). Au jour 7, les souris portant des tumeurs locales allaient de 50 à 100 mm 2 a reçu une injection intra-tumorale directe de 1 × 10 9 unités formant des plaques de l'adénovirus indiqué (dilué avec du PBS dans un volume total de 100 ul). La formation de la tumeur a été surveillée pendant jusqu'à 1 mois et demi. La taille des tumeurs a été mesurée en utilisant l'étrier et déterminé en multipliant par 0,5 x largeur 2 × longueur. La méthode de Kaplan-Meier a été utilisée pour estimer la survie des deux groupes d'animaux traités. A la fin de l'expérience, les tumeurs de chaque traitement ont été recueillies dans 10% de formaline tamponnée, noyés dans la paraffine et coupés en 5 um d'épaisseur des tranches pour plus Ki-67 détection. protéines cytosoliques et lysat de cellules entières ont également été extraites de ces tumeurs pour l'analyse Western.}

Analyse statistique

Toutes les données ont été calculées en moyenne ± écart-type. Les différences entre les groupes ont été comparés avec le test t de l'étudiant deux côtés. A P
valeur de 0,05 ou moins a été considérée comme significative.
de

Résultats de la régulation négative EMX2 dans Human Cancer gastrique

Nous avons examiné l'expression de EMX2 dans neuf lignées humaines gastriques de cellules cancéreuses, ainsi que des tumeurs et des tissus normaux appariés adjacents provenant de dix patients atteints d'un cancer de l'estomac (figure 1). En utilisant le temps réel RT-PCR, nous avons découvert que l'expression de EMX2 était significativement régulée à la baisse dans huit des neuf lignées cellulaires examinées par rapport à celle dans le tissu gastrique normale (P < 0,01, figure 1A). D'autre part, une lignée cellulaire AZ521 a montré niveau similaire d'expression de EMX2 que dans la commande normale (figure 1A). Afin de détecter l'expression de la protéine EMX2 dans des échantillons de tissus de patients, immunohistochimie (IHC) a été réalisée et l'intensité de la coloration IHC a été quantifié par l'image Pro® Plus. Tous les dix échantillons analysés se sont révélés présenter soit l'absence d'expression de EMX2 ou une diminution des niveaux d'expression de EMX2 dans les tissus cancéreux par rapport à leurs homologues normaux (P < 0,01, figure 1B). Pour établir le rôle éventuel de EMX2 dans la progression pathologique du cancer de l'estomac humain, nous avons analysé l'expression EMX2 en utilisant l'ARN total que nous avons obtenu à partir de quinze échantillons de dysplasie gastrique et vingt échantillons chirurgicaux du cancer gastrique. Nous avons découvert que l'expression de EMX2 était significativement régulée à la baisse dans les échantillons de dysplasie (P < 0,05). Presque perdue dans les échantillons de cancer par rapport à celle de l'adulte tissu gastrique normale (figure 1C), suggérant que EMX2 la régulation négative peut se produire à un stade précancéreux non invasif

correction entre l'expression de EMX2 et son état méthylation du promoteur

Nous avons examiné l'état de méthylation du promoteur de EMX2 dans neuf lignées cellulaires de cancer gastrique et le tissu gastrique normal. Régions d'îlots CpG (CGI) ont été identifiés avec MethPrimer -800 à -470 et -55 à 459 par rapport aux sites de départ de transcription attendus (+1) du gène EMX2 (figure 2A). l'état de méthylation a été analysée en utilisant le séquençage au bisulfite (BS) (figure 2B) et la PCR (MSP) spécifique de la méthylation (figures 2C-2D). Notre station de base et les résultats MSP ont montré que le promoteur EMX2 dans les cellules des tissus et AZ521 gastrique normale était méthylée, alors que les huit autres lignées cellulaires examinées, il a été fortement méthylée (Figures 2B-2C). Ces résultats sont cohérents avec les niveaux d'expression de EMX2 dans ces lignées cellulaires: élevés dans les tissus normaux et AZ521, mais faible au cours des huit autres lignées cellulaires étudiées. Un mélange de bande méthylé et non méthylé a été trouvée dans plusieurs lignées cellulaires, y compris MKN28, N87 et SNU16 indiquant une méthylation partielle. En outre, nous avons constaté que l'état de méthylation des échantillons de tissus de patients révélés par MSP est compatible avec les niveaux d'expression de EMX2 dans ces échantillons (figure 2D, quatre des dix paires d'échantillons de tissus ont été examinés en raison de l'indisponibilité de l'ADN génomique à partir des six autres paires ). Ces données suggèrent que la régulation négative de l'expression de EMX2 peut être le résultat de son promoteur hyper-méthylation dans le cancer gastrique.

Pour étudier davantage la corrélation entre l'expression de EMX2 et la méthylation du promoteur, nous avons traité des lignées de cellules MKN28 et AGS avec inhibiteur de la méthyltransférase DAC et un inhibiteur TSA histone déacétylase. La lignée cellulaire AZ521 a été utilisé comme témoin négatif que sa région de promoteur est méthylé. Nous avons observé que la bande spécifique de méthylation a été augmenté de façon significative (figure 3A) avec des niveaux d'expression de EMX2 surexprimés en conséquence (figure 3B) lors du traitement du CAD dans les deux AGS et des cellules MKN28, tandis que ceux dans les cellules AZ521 est resté inchangé (figure 3). Le traitement de la TSA a eu des effets minimes sur la fois le statut de méthylation et les niveaux d'expression EMX2. Pris ensemble, nos résultats suggèrent fortement la régulation négative de l'expression EMX2 était significativement corrélée avec l'hyperméthylation de promoteur EMX2 dans le cancer gastrique humain.

L'inhibition de la croissance cellulaire par adénovirus livré EMX2 in vitro

nous avons ensuite examiné le rôle de EMX2 sur la croissance cellulaire des cellules cancéreuses gastriques. La croissance des cellules AGS et MKN28 a été supprimée de manière significative lors de l'infection par l'adénovirus exprimant EMX2 (Ad-EMX2) par rapport à un contrôle de vecteur vide (Ad-ctrl) (P < 0,001, figure 4A), tandis que la croissance des cellules AZ521 n'a pas été affectée (P > 0,05, figure 4A). Ces observations ont également été confirmées par la formation de colonies de dosage (figure 4B). Nos résultats démontrent la fonction anti-prolifération des EMX2 dans les cellules cancéreuses gastriques

Suppression de la signalisation Wnt Pathway par adénovirus livré EMX2

La fonction de EMX2 a été liée à la voie de signalisation Wnt. donc nous avons étudié la relation entre EMX2 et signalisation Wnt dans le cancer gastrique. Nous avons utilisé un dosage de rapporteur Topflash /Fopflash pour mesurer TCF /activité de transcription LEF-dépendante réglementé par voie Wnt canonique. Nous avons constaté que l'activité de transcription de TCF /LEF-dépendante a été inhibée de manière significative par Ad-EMX2 dans les cellules AGS et MKN28 dépourvues d'expression de EMX2 endogène (P < 0,05), mais pas dans les cellules AZ521 exprimant EMX2 endogène (P > 0,05, figure 5A). Constante, les niveaux de β-caténine cytosolique et la voie Wnt canonique des cibles en aval de c-myc et de la cycline D1 ont été supprimées dans les AGS et les cellules MKN28 infectées avec Ad-EMX2, mais pas dans les cellules AZ521 (restauration de l'expression EMX2 dans ces lignées cellulaires après protéiniques infection Ad-EMX2 a été confirmée par Western) (figure 5B). Pour examiner davantage la pertinence de Wnt voie régulation à la baisse et à la suppression de la prolifération par Ad-EMX2, nous transfecté et exprimé β-caténine stabilisée (S45Y de mutation) dans ces cellules de cancer gastrique infectées par Ad-EMX2. Nous avons observé que surexprimant β-caténine a significativement atténué l'effet de suppression de la croissance de Ad-EMX2 dans les cellules AGS et MKN28 (P < 0,01), mais pas dans les cellules AZ521 (figure 5C). Pris ensemble, ces résultats confirment un rôle important de EMX2 dans la suppression de la voie Wnt dans le cancer gastrique.

Suppression de la croissance du cancer gastrique par adénovirus livré EMX2 in vivo

Nous avons établi le MKN28 et AGS modèles de xénogreffes d'explorer le potentiel thérapeutique de EMX2 adénovirus-rendu pour le cancer gastrique in vivo
. Une semaine après l'inoculation, les souris portant des tumeurs locales allant de 50 à 100 mm ^{2 a reçu une injection intratumorale directe de 1 × 10 9 unités de l'adénovirus indiqué formant des plaques. La croissance des tumeurs chez les souris infectées par Ad-EMX2 étaient significativement plus lente que celle du groupe de contrôle (P < 0,05, figure 6A a laissé deux panneaux). À la fin de la masse expérience de la tumeur chez des souris infectées Ad-EMX2 aussi beaucoup moins que dans le groupe témoin (P < 0,05 pour MKN28 tumeur, P < 0,01 pour AGS tumeur, figure 6A panneau de droite). Tacher l'intensité d'un marqueur de prolifération Ki67 des échantillons de tumeur à la fin de l'expérience a montré que l'administration d'Ad-EMX2 a diminué de manière significative le Ki-67 coloration (P < 0,01, figure 6B), ce qui suggère une inhibition de la prolifération cellulaire dans les tumeurs. En outre, la survie du groupe Ad-EMX2 infectés était significativement meilleure que celle du groupe de contrôle (P = 0,014, Figure 6C). Conformément à notre in vitro
analyse, β-caténine cytosolique et la voie canonique Wnt cibles en aval c-myc et cycline D1 ont également été downregulated dans Ad-EMX2 infectées MKN28 et les tumeurs AGS (restauration de l'expression de EMX2 dans ces in vivo tumeurs a également été confirmée par Western) (Figure 6D). Pris ensemble, nos résultats démontrent un potentiel thérapeutique de EMX2 adénovirus délivré pour traiter le cancer gastrique.}

Discussion

gènes de boît ont été bien connue pour son importance dans le développement depuis des décennies, alors que l'étude de ces gènes au cours de l'oncogenèse est encore à ses balbutiements. l'expression des gènes de homeobox aberrants ont été documentés dans divers cancers [32], [33], ce qui indique les changements d'expressions hemeobox pourrait être important pour l'oncogenèse. Cela peut fournir une base moléculaire pour les applications cliniques potentielles. Cependant, plusieurs questions fondamentales doivent encore être pleinement pris en compte, y compris les mécanismes moléculaires qui conduisent l'expression aberrante et des cibles en aval et les voies qui favorisent l'oncogenèse de signalisation. Dans cette étude, nous fournissons des idées sur ces questions en étudiant EMX2 dans le cancer gastrique humain.

Notre étude fait état d'une diminution et la perte d'expression de EMX2 dans des lignées cellulaires de cancer gastrique et les tissus tumoraux primaires importants, et ont montré que la régulation négative était significativement corrélée avec hyper-méthylation du promoteur EMX2, suggérant silence épigénétique comme un mécanisme important pour EMX2 dysrégulation dans le cancer gastrique humain. En effet, la modification épigénétique a été proposée comme un mécanisme essentiel responsable de la régulation négative des gènes à homéoboîte ou silençage dans d'autres types de tissus cancéreux où la fonction de ces gènes dans la suppression des tumeurs [14], [32]. De plus, notre observation de EMX2 dowregulation dans la dysplasie gastrique non-invasive prend en charge un éventuel rôle important de EMX2 dans la progression pathologique du cancer de l'estomac humain. Une limitation de notre étude est le nombre d'échantillons de tissus analysés. Un plus grand nombre d'échantillons de patients doivent être examinés afin de valider davantage la constatation de la méthylation-silençage de EMX2 dans le cancer gastrique. Néanmoins, nos résultats fournissent une première preuve directe de ce mécanisme dans le cancer gastrique et identifier EMX2 comme un roman suppresseur de tumeur putatif dans le cancer gastrique.

En outre, nous avons étudié les voies oncogéniques importants par lesquels EMX2 a fonctionné dans le cancer gastrique , et a constaté que la voie de signalisation Wnt peut jouer un rôle clé de médiateur de la fonction EMX2. Nous avons montré dans des essais de prolifération que la forte expression de EMX2 exogène de manière significative la croissance supprimée de lignées cellulaires de cancer gastrique dépourvues d'expression du gène endogène (cellules AGS et MKN28), en accord avec les rapports précédents que la différence dans l'expression de EMX2 est négativement corrélée à la prolifération d'autres types de cellules cancéreuses [ ,,,0],24], [25]. Nous avons également démontré que la voie de signalisation Wnt a été considérablement inhibée par EMX2 in vivo
et in vitro
, fournissant une preuve supplémentaire que la voie de signalisation Wnt peut médier la fonction EMX2 dans le cancer tel que proposé précédemment [22 ].

Finalement, nos résultats indiquent le potentiel d'utilisation de la thérapie génique EMX2 pour le traitement du cancer gastrique. Infection des tumeurs avec Ad-EMX2 supprimé de manière significative la prolifération et plus important encore, l'amélioration de la survie globale. Il est à noter que le système de distribution, nous avons utilisé pour le traitement est un adénovirus recombinant de serotype 5 (Ad5), le vecteur le plus fréquemment utilisé dans plusieurs types de thérapie génique du cancer [11], [12], [34], [35]. Par rapport aux virus adéno-associé (AAV) et des systèmes de délivrance rétroviraux, des vecteurs adénoviraux, tels que Ad5, ont clairement de nombreux avantages. Par exemple, des vecteurs adénoviraux ont un large tropisme permettant ciblage efficace sur de nombreux tissus d'intérêt, une grande capacité de charge utile et de haute efficacité de transduction par rapport au système de AAV [10] et aussi un non-intégration des caractéristiques qui, autrement, induisent le risque de mutagenèse aléatoire du génome [ ,,,0],10], [36] [36], [37], [38]. De plus, les vecteurs adénoviraux peuvent être conçus pour un cancer virus oncolytiques sélectifs [39], [40], [41], qui sont essentiels pour l'application clinique de la thérapie génique du cancer. Cependant, il y a encore de nombreux défis de l'utilisation de vecteurs adénoviraux pour délivrer les thérapies géniques chez les patients. Par exemple, ils peuvent être rapidement perdues à partir de cellules qui se divisent rapidement après l'infection. D'autres facteurs qui influent sur l'application clinique de livraison adénoviral comprennent la capacité de l'emballage et la gamme d'hôtes de vecteurs adénoviraux, leur profil d'expression génique et la tendance à induire une réponse immunitaire, particulièrement important si l'administration répétée est nécessaire [42], [43]. Néanmoins, notre vivo
étude de l'infection par Ad-EMX2 suggère que la thérapie génique de EMX2 peut avoir le potentiel pour devenir une stratégie thérapeutique anti-tumorale clinique pour le traitement du cancer gastrique dans l'avenir.

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