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PLOS ONE: Tumeur contenu graphique assistée par analyse PCR numérique HER2 /CEP17 de cancer gastrique Biopsie Specimens

Résumé

Évaluation gene amplification de HER2 est une composante essentielle de la prise de décision thérapeutique pour avancée ou d'un cancer gastrique métastatique. Une méthode simple qui est applicable aux petits spécimens de biopsie inclus dans la paraffine fixés au formol est souhaitable en tant que complément ou en remplacement actuellement utilisé pour l'immunohistochimie et HER2 dans des protocoles d'hybridation in situ. Dans cette étude, nous avons développé une méthode PCR numérique basée microfluidique pour déterminer HER2
et le chromosome 17 centromère (CEP17) copie des numéros et l'estimation de ratio de contenu de la tumeur (TCR). Le rapport HER2
/de CEP17 est déterminé par trois variables: TCR et le nombre de copies absolues de HER2
et CEP17-en examinant les cellules tumorales; seul le rapport de ces deux derniers peuvent être obtenus par PCR numérique en utilisant l'ensemble des échantillons sans purifier les cellules tumorales. RCT a été déterminée par analyse d'image semi-automatique. Nous avons développé une tumeur graphique contenu, qui est un plan de coordonnées rectangulaires constitué de données HER2
/CEP17 numérique PCR et TCR qui délimite amplifiés, non-amplifié, et les zones équivoques. En appliquant cette méthode, 44 échantillons cliniques de biopsie gastrique du cancer ont été classés comme amplifié (n = 13), non amplifié (n = 25), ou équivoques (n = 6). Par comparaison, 11 échantillons étaient positifs, 11 étaient négatifs, et 22 étaient equivocally immunohistochimie. Ainsi, notre nouvelle méthode réduit le nombre d'échantillons équivoques 22-6, évitant ainsi la nécessité d'une confirmation par fluorescence ou à double sonde hybridation in situ à <en; 30% des cas. L'analyse par PCR numérique tumeur contenu graphique assistée est également applicable à des sites multiples dans les tissus résection chirurgicale. Ces résultats indiquent que cette analyse est une alternative utile à HER2 immunohistochimie dans les cancers gastriques qui peuvent servir de base pour l'évaluation automatisée de HER2 de statut

Citation:. Matsusaka K, Ishikawa S, Nakayama A, Ushiku T, Nishimoto A, Urabe M, et al. (2016) Tumor Content Chart-Assisted Analyse PCR numérique HER2 /
CEP17 de cancer gastrique Biopsie Specimens. PLoS ONE 11 (4): e0154430. doi: 10.1371 /journal.pone.0154430

Editeur: Yves St-Pierre, INRS, CANADA

Reçu: 7 Novembre 2015; Accepté le 13 Avril 2016; Publié le 27 Avril, 2016

Droit d'auteur: © 2016 Matsusaka et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données:. Tous pertinents les données sont dans le ses fichiers de renseignements à l'appui du papier et

financement:. Ce travail a été réalisé dans le cadre du projet BioBank Japon (http://www.src.riken.jp/english/project/person/) qui a été soutenu par le Ministère de l'Education, Culture, sports, science et technologie (http://www.mext.go.jp/english/), l'Agence japonaise pour la recherche et le développement médical (http: //www.amed.go .jp /fr /), et subventions-in-Aid pour la recherche scientifique (KAKENHI) de la Société japonaise pour la promotion de la science (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique est l'une des tumeurs malignes les plus courantes et la troisième principale cause de décès liés au cancer à travers le monde [1]. Les cas avancés sans intervention chirurgicale ont un mauvais pronostic et nécessitent des approches de traitement multidisciplinaires. HER2 est une glycoprotéine transmembranaire de 185 kDa qui est un membre de la famille des récepteurs du facteur de croissance épidermique et fonctionne comme un récepteur de tyrosine-kinase [2, 3]. Dans les cellules normales, la protéine HER2 agit en tant que transducteur de signal pendant la prolifération ou la différenciation cellulaire [4]; Cependant, il possède des propriétés oncogéniques lorsqu'elle est surexprimée. Cela est généralement causé par l'amplification du gène de HER2, ce qui a été rapporté dans plusieurs types de tumeurs malignes [5] y compris le cancer du sein [6, 7], des glandes salivaires adénocarcinome [8], le cancer de la vessie [9] et le cancer gastrique [10]. cancers gastriques HER2 surexprimant représentent 8% -31% de tous les cas [11-15]. Dans le trastuzumab pour le procès contre le cancer gastrique, le trastuzumab (Roche Diagnostics, Bâle, Suisse) -a anticorps augmenté le taux de survie anti-HER2 monoclonal humanisé des patients atteints de cancers gastriques HER2-positif lorsqu'il est administré en association avec une chimiothérapie [16], et a été également approuvé pour le traitement des cancers du sein [17, 18]. Évaluer le statut HER2 est donc un aspect essentiel de la thérapie du cancer gastrique.

Pour les patients atteints de cancers gastriques inopérables, le statut HER2 doit être examiné en utilisant un petit échantillon de biopsie. Comme représenté dans les dernières recommandations pour le test HER2 dans le cancer du sein par l'American Society of Clinical Oncology (ASCO) /College of American Pathologists (CAP), immunohistochimie (IHC) hybridation in situ et /ou (ISH) sont les méthodes standard pour l'évaluation de HER2 état [19], mais chacun a ses limites. Par exemple, l'efficacité de HER2 IHC est affectée par plusieurs facteurs tels que le processus de fixation de la formaline, et le système de pointage ne sont pas toujours reproductible, en particulier dans les cas ambigus, pour lesquels il est recommandé ISH [19-25]. Dans le champ lumineux double-sonde ISH de HER2 ( HER2
-Lave-vaisselle), HER2
et le chromosome 17 centromère (CEP17) copie les numéros peuvent être détectés en tant que signaux sous une lumière microscope sur toute la région du spécimen. Cependant, bien que cette méthode présente une sensibilité supérieure, elle est coûteuse et relativement temps

Dans cette étude, nous avons appliqué la technologie PCR numérique microfluidiques. (BioMark; Fluidigm, Cambridge, Royaume-Uni) [26] pour déterminer HER2
/CEP17 rapport du nombre de copies. Dans la PCR numérique, matrice d'ADN est divisé en 770 morceaux dans des chambres de réaction de nanolitre, avec une concentration attendue de 0-1 molécule par chambre. les gènes cibles et de référence à deux couleurs sont simultanément amplifiés par PCR et leur nombre de copie sont calculées en comptant les chambres avec des signaux positifs. Cette méthode très robuste permet la comparaison des HER2
et le nombre de copies CEP17 utilisant différents jeux d'amorces. L'objectif de cette étude était de confirmer la faisabilité de la technologie PCR numérique pour l'analyse des échantillons de biopsies gastriques de cancer. Cependant, un problème avec cette approche est que le tissu contient habituellement des cellules stromales non cancéreuses qui interfèrent avec les analyses moléculaires. Pour surmonter ce problème, nous avons développé diagramme de dispersion à deux dimensions appelé le contenu de la tumeur (TC) graphique qui alloue des données dans amplifié, non amplifié, et des catégories équivoques. L'objectif était de développer un moyen automatisé d'évaluation HER2 de statut, avec TC assisté chart- HER2
/CEP17 numérique PCR analyse servant la première étape.

Matériaux et Méthodes

Déclaration
éthique

Cette étude a été approuvée par le Comité d'éthique de l'Université de Tokyo institutionnel. Les échantillons cliniques avec le consentement éclairé ont été recueillies dans les Université de Tokyo directives institutionnelles pour l'étude des tissus humains.

échantillons de biopsie de cancer gastrique cliniques et prélèvements chirurgicaux

Au total, 44 gastriques spécimens de biopsie de cancer à partir de 32 patients traités par routine fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) étaient disponibles pour l'analyse. Tous les échantillons de biopsie ont été obtenus par endoscopie au Département de l'endoscopie et de la chirurgie endoscopique. Quatre échantillons chirurgicaux, qui ont été réséquées chirurgicalement au Département de chirurgie gastro-intestinale, ont également été analysés. Ces spécimens ont été fixés dans 10% du formol tamponné neutre. Tous les cas ont été diagnostiqués au Département de pathologie de l'Université de l'hôpital de Tokyo. Les coupes ont été coupées à une épaisseur de 4 um en utilisant des techniques histologiques classiques; ceux-ci ont été recueillies sur des lames de verre et utilisées pour l'hématoxyline-éosine (HE) coloration, HER2-IHC, et HER2 de la -Lave-vaisselle.

immunohistochimie

La coloration immunohistochimique a été réalisée sur le tissu FFPE en utilisant Ventana BenchMark XT (Roche Diagnostics) avec l'anticorps 4D5 anti-HER2. les modèles d'intensité et immunoréactivité de la membrane coloration ont été évaluées par le système de pointage selon les directives Dako ASCO /CAP [19]. Aucune coloration de la membrane a été marqué comme 0; faible ou à peine perceptible incomplète coloration /membrane a été marqué comme 1+; incomplètes et /ou faible modérée coloration de la membrane /périphérique a été marqué comme 2+; et complètement et intensément circonférentielle coloration de la membrane a été marqué comme 3+.

HER2-
DISH coloration et de l'évaluation

HER2 de la -Lave-vaisselle a été réalisée sur FFPE le tissu en utilisant le kit de PLAT HER2 ADN (Roche Diagnostics) selon les instructions et les échantillons du produit ont été évaluées par microscopie optique. Les signaux HER2 de apparus comme des points noirs ou des grappes et des signaux CEP17 est apparu comme des points rouges. Vingt non-chevauchement des noyaux de cancer ont été marqués pour HER2
et signaux CEP17 et gene amplification de HER2 a été classé comme recommandé par les lignes directrices de l'ASCO /CAP [19]; positif, [ HER
2 /CEP17 rapport ≥ 2.0] et /ou [moyenne HER
2 nombre de copies ≥ 6.0 signaux /cellule]; équivoque, [ HER
2 /CEP17 rapport < 2.0] et [moyenne HER
2 nombre de copies ≥ 4.0 et < 6.0 /signaux cellulaires]; négatif, [ HER
2 /CEP17 rapport < 2.0] et [moyenne HER
2 numéro de copie < 4,0 /signaux cellulaires].

Préparation de l'ADN à partir du matériel clinique FFPE

Pour extraire l'ADN à partir d'échantillons de biopsie, 10 sections de série coupées à une épaisseur de 10 um ont été placés sur une surface de verre pour HER2 -IHC et HER2 de la -Lave-vaisselle. le contenu de la tumeur a été confirmée avant et après la coupe par coloration des lames adjacentes avec SE. Etant donné qu'un seul bloc de paraffine contient habituellement plusieurs pièces d'échantillon de biopsie, les échantillons individuels ont été isolés en utilisant un dispositif de coupe de verre. Pour extraire l'ADN à partir d'échantillons réséqués chirurgicaux, 5 coupes en série de chaque tissu-bloc représentant ont été coupées à une épaisseur de 10 um, qui ont été placés sur une feuille à base de polytétrafluoroéthylène (PTFE, Sanplatec, Osaka, Japon). La membrane est la résistance chimique pour déparaffinage à base de xylène, et est facilement coupé en morceaux. Dans l'étude, les différentes parties ont été préhenseur de feuilles en fonction du profil HER2. Verre ou PTFE pièces ont été assemblées dans un tube de 2,0 ml, et l'ADN a été extrait en utilisant le kit de tissus FFPE QIAamp DNA (Qiagen, Valencia, CA, USA).

HER2
évaluation du nombre de copies par
PCR

ensembles numériques d'amorces pour amplifier HER2
et CEP17 sont présentés dans le tableau 1. Chaque amorce a été conçue de telle sorte que les produits de PCR obtenus ont été suffisamment court (59 et 65 pb) pour éliminer le influence de la fragmentation de l'ADN dans le processus FFPE. PCR numérique a été réalisée à l'aide d'un système EP1 avec un circuit de matrice numérique 48,770 intégré fluidiques (Fluidigm). Chaque puce contient 48 panneaux qui ont été en outre divisé en 770 chambres de réaction. Le nombre de signaux fluorescents positifs dans chaque groupe a été utilisé pour quantifier les différentes séquences d'ADN. Le protocole a été décrit précédemment [26]. En bref, les mélanges réactionnels de 4 pi ont été préparées pour chaque dosage contenant 1 × TaqMan expression du gène mélange maître, 1 × HER2-FAM et les sondes TaqMan chr17cent CIV et 1 × échantillon réactif de chargement (Fluidigm). Le mélange réactionnel a été réparti uniformément dans les chambres de réaction 770 et le réseau numérique a été thermo-cycleur cyclée sur un système EP1 FC1. Les deux régions cibles ont été amplifiées de manière indépendante et 6-carboxyfluorescéine et CIV teinture des signaux dans les chambres ont été enregistrés à la fin de chaque cycle de PCR. Le nombre de (CEP17) chambres 6-carboxyfluorescéine-positifs (HER2) et VIC-positifs dans chaque panneau a été compté et HER2
/CEP17 rapport du nombre de copies a été calculé [27].

Évaluation du rapport de la teneur de la tumeur (TCR)

image de diapositive plénier de HE sections, qui étaient celles juste avant les coupes en série pour l'extraction d'ADN, a été numérisé à l'aide Nanozoomer (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japon). Les données ont été importées dans Definiens Tissue Studio 2.0 (http://www.tissuestudio.com) pour la détermination du TCR. La région sélectionnée d'échantillons chirurgicaux a été numérisé à l'aide d'un microscope BZ-710 (Keyence, Osaka, Japon). Les données ont été importées dans le logiciel Hybrid Cell Count (BZ-H3C, Keyence). Les données détaillées du nombre de cellules dans les images importées et les cellules cancéreuses distingués de la non-cancéreuse basée sur la taille noyau ont été générées automatiquement

Des expériences pour le développement

Les lignées cellulaires des TC graphiques.

Pour les expériences témoins, le cancer du poumon H522 et SK-BR-3, les lignées cellulaires de cancer du sein ont été obtenus auprès de la American type Culture Collection (Manassas, VA, USA). On a obtenu GM18997 Epstein-Barr virus transformé lignée de cellules lymphoblastoïdes (LCL) à partir de Coriell banque d'échantillons (https://catalog.coriell.org/). H522 cellules et le LCL ont été cultivées dans un milieu Roswell Park Memorial Institute-1640 (Nacalai Tesque, Kyoto, Japon) contenant 10% de sérum de veau fœtal (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) et une solution de pénicilline-streptomycine 1% ( Nacalai Tesque). SK-BR-3, les cellules ont été cultivées dans un milieu modifié du milieu de Eagle /Hams F12 de Dulbecco (Nacalai Tesque, Japon) avec 10% de sérum bovin fœtal et 1% de pénicilline /streptomycine. Les cellules ont été cultivées à 37 ° C dans une atmosphère contenant 5% de CO 2. L'ADN a été extrait en utilisant un kit QIAquick DNA Mini (Qiagen). FFPE H522, SK-BR-3, et LCL blocs de cellules ont été préparés pour l'évaluation de HER2 -Lave-vaisselle.

mélange gradué avec LCL.

L'ADN génomique de H522 et SK BR-3 et des cellules LCL a été ajustée à une concentration de 50 ng /ul. L'ADN génomique H522 et LCL ont été mélangés en huit étapes à des rapports volumiques suivants: 8: 2, 7: 3, 6: 4, 5: 5, 4: 6, 3: 7, 2: 8 et 1: 9 (H522 : LCL). SK-BR-3 et l'ADN génomique LCL ont été mélangés en quatre étapes selon les rapports volumiques suivants: 8: 2, 6: 4, 4: 6 et 2: 8 (SK-BR-3: LCL).
statistique

des tests du chi carré ont été appliqués pour comparer les chiffres entre HER2 de la -Lave-vaisselle et PCR numérique dans H522 et SK-BR-3 cellules et LCL. Les différences ont été considérées comme significatives si p
< 0,05
de

Résultats de développement de la carte TC pour les données de PCR numériques

Le rapport HER2
/de CEP17 a été déterminée sur la base de trois variables:. TCR et nombres de copies absolue de HER2
et CEP17. Seuls les rapports relatifs de ces deux derniers peuvent être obtenus par PCR numérique en utilisant l'échantillon de tumeur, sans isoler des cellules individuelles. rapport HER2
/de CEP17 obtenu par un signal numérique de PCR [ r
] a été exprimé comme suit, sur la base de l'hypothèse selon laquelle le nombre de copies de gènes de cellules cancéreuses sont homogènes et que les cellules non cancéreuses sont génétiquement stable avec des chromosomes diploïdes (figure 1A et 1B) :( 1) où [ r
] est le rapport de HER2
à CEP17 obtenu par PCR numérique (0 < r
); [ x
] est TCR (0 ≤ x
≤ 1); [ A
] est le nombre de copies CEP17 dans une seule cellule cancéreuse (0 ≤ A
); et [ B
] est le nombre de copies de HER2 dans une seule cellule cancéreuse (0 ≤ B
). Ci-après, le nuage de points en deux dimensions représenté par l'équation (1) est désigné comme le tableau de TC.

Dans la présente étude, [ x
] a été déterminée à partir de HE-tachée spécimens en utilisant l'image logiciel d'analyse, tels que studio Tissue logiciel d'analyse d'image pour les échantillons de biopsie et un logiciel de comptage hybride cellulaire pour les échantillons chirurgicaux, respectivement; et [ r
] et [ x
] ont été déterminées à partir de mesures.

Eq (1) a été représenté graphiquement comme le tableau TC, avec [ r
] et [ x
] que les axes verticaux et horizontaux, respectivement (figure 1B). Le rapport de [ B
/ A
] était la valeur de référence pour la détermination de l'amplification du gène HER2
. En effet, le nombre de copies réelles de CEP17 [ A
] et HER2
[ B
] n'a pas pu être déterminée sans effectuer HER2 de la -Lave-vaisselle. Toutefois, une évaluation pratique de HER2
et CEP17 copier les numéros par DISH a constaté que [ A
] variait de 2,0 à 6,0 (entre 40 et 117 CEP17 signaux parmi les 20 cellules cancéreuses dans S1 et S2 Tables) et n'a jamais dépassé 8,0 dans les échantillons de cancer gastrique cliniques. Selon notre expérience de 164 cas consécutifs de cancer gastrique (Ushiku T et al.
Données non publiées), CEP17 nombre de copies est de 1,0 à 5,7, médiane 2,5 et monosomie, défini comme [ A
< 1.5], est assez rare dans deux cas seulement (1,2%). Ainsi, la gamme de [ A
] a été défini comme [2 ≤ A
≤ 8] avec une marge de sécurité.

Nous avons défini HER2
amplification négative [ B
/ A
< 2] ou [ B
< 2 A
]. [ Bx
+ 2 (1 - x
)] a ensuite été exprimé comme suit: (2)

Les deux côtés de l'équation (2) ont été divisés par [ Ax
+ 2 (1 - x
)] :( 3)

Combinant avec Eqs (1) et (3) a donné ce qui suit: (4) (5)

Eq (5) était une condition équivalente à [ B
/ a
< 2]. Le membre de droite de l'équation (5) indique une augmentation monotone en fonction de la variable [ A
] (2 ≤ A
≤ 8); incorporation de [ A
= 2], ce qui était la valeur minimale de [ A
], dans l'équation (5) a donné ce qui suit: (6)

Par conséquent, chaque fois que l'équation (6) est satisfaite, le l'état d'amplification négatif de HER2 [ B
/ A
< 2] était vrai pour toute valeur de [ A
] (2 ≤ A
≤ 8).

D'autre part, la définition de HER2
amplification positif était [ B
/ A
≥ 2] ou [ B
≥2 A
]. Dans ce cas, [ Bx
+ 2 (1 - x
)] a été exprimée comme suit: (7)

Eq (7) a été traité de la même manière comme Eqs (2) - (5) et a été exprimée comme suit: (8)

Eq (8) était une condition équivalente à [ B
/ a
≥ 2]; l'élément du côté droit de l'équation indique une augmentation monotone. Incorporation de [ A
= 8], qui était la valeur maximale de [ A
], dans l'équation (8) a donné ce qui suit: (9)

Ainsi, chaque fois que l'équation (9) a été satisfaite, le l'état d'amplification positif de HER2 [ B
/ A
≥ 2] était vrai pour toute valeur de [ A
] (2 ≤ A
≤ 8).

Lorsque Eqs (6) et (9) ont été tracées sur la carte TC, la zone au-dessus de la ligne incurvée vers le haut [ r
= (7 x
+ 1) /(3 x
+ 1)] ( A
= 8) a été désignée comme la zone positive, et la zone située sous la ligne droite [ r
= x
+ 1] ( A
= 2) était la zone négative. La zone délimitée par les lignes [ r
= x
+ 1] et [ r
= (7 x
+ 1) /(3 x
+ 1)] était une zone indéfinie dépendant de la valeur de [ A
], qui a été désigné comme la zone équivoque et défini comme suit (Fig 1B) :( 10)

Lorsque [ x
] était 0 (ne contenant pas de cellules cancéreuses), toutes les lignes ont convergé au point de coordonnées (0,1) basée sur l'hypothèse que les cellules non-cancéreuses sont génomiquement stable. Lorsque [ x
] a été de 1,0 (constitué de cellules cancéreuses seulement), les lignes passé à travers les coordonnées (1,2) indépendamment des valeurs pour [ A
] et [ B
].

Comparaison de la PCR numérique et HER2 de la -Lave-vaisselle dans des cellules cultivées

Nous avons validé l'équation théorique (1) et le tableau de TC par un système de mélange par étapes des lignées cellulaires. L'équation (1) a été obtenue en utilisant des valeurs réelles mesurées de [ A
] et [ B
] obtenu par HER2 de la -Lave-vaisselle dans des lignées cellulaires, ou en utilisant le calcule [ B '
] de [ A
] et mesuré [ r
].

nombre de copies relatif de HER2
et CEP17 ( HER2
/CEP17) dans LCL et H522 et SK-BR-3cells ont été évalués par HER2 de la -Lave-vaisselle en utilisant des blocs de cellules FFPE et par PCR numérique (tableau 2). Les signaux HER2 de apparut sous forme de points discrets dans les noyaux par HER2 de la -Lave-vaisselle (Fig 2A et 2B); Le nombre de copies de HER2 dans des cellules individuelles a été près de deux LCL et quatre en H522 cellules. En revanche, SK-BR-3 cellules ont montré regroupées Les signaux HER2 de qui étaient difficiles à distinguer individuellement (figure 2C); leurs numéros ont été arbitrairement fixés aux valeurs maximales de 7, 14 et 21 selon la taille des grappes. Ainsi, un plus faible rapport HER2
/de CEP17 a été obtenu par HER2 de la -Lave-vaisselle que par PCR numérique.

H522 et l'ADN génomique cellulaire SK-BR-3 a été mélangé avec celle de la LCL de manière progressive, et les mélanges ont été analysés par PCR numérique. Dans les cellules H522, HER2
[ B
] et CEP17 [ A
] Copie chiffres ont été calculés à partir de HER2 de la -Lave-vaisselle comme suit: [ A
= 41/20 = 2,05] et [ B
= 85/20 = 4,25]. Lorsque les valeurs de [ A
] et [ B
] ont été appliquées à l'équation (1), les données pourraient être décrits par la ligne de référence [ r
= ( 4,25 x
+ 2 (1 - x
)) /(2,05 x
+ 2 (1 - x
))] (figure 2D ). Dans le cas des cellules-BR-3 SK, CEP17 nombre de copies [ A
] était [ A
= 83/20 = 4,15]; cependant, comme décrit ci-dessus, Les signaux HER2 étaient regroupés de, qui a diminué le nombre de copies estimé. Par conséquent, l'application [ A
= 4.15], [ r
= 5,69] et [ x
= 1,0] à l'équation (1), l'estimation copie du numéro de HER2 [ B '
] a été présumé être [ B'
= 5,69 × 4,15 = 23,61]. Par conséquent, [ A
= 4,15] et [ B '
= 23.61] whilethe ligne de référence était [ r
= (23,61 x
+ 2 (1 - x
)) /(4.15 x
+ 2 (1 - x
))] (figure 2E). les données de PCR numériques Plotted de SK-BR-3 cellules mixtes avec le LCL conformes à cette ligne plutôt que de [ r
= (19,50 x
+ 2 (1 - x
)) /(4.15 x
+ 2 (1 - x
))], qui était basée sur données
HER2 -Lave-vaisselle pour lequel [ B
= 19,50]. Ces résultats démontrent la validité du TC tableau-à-dire, qu'il a quantitativité suffisant de PCR numérique pour distinguer HER2-amplifié à partir de cellules non-amplifié

Concordance entre tableau de TC pour le numérique PCR et HER2-IHC /. - DISH dans les échantillons de biopsie cliniques

gastriques échantillons de biopsie de cancer (n = 44) à partir de 32 patients ont été analysés par PCR numérique. Le HER2 de l'état de chaque échantillon a été déterminée par HER2-IHC et -Lave-vaisselle (Fig 3A-3C). Les valeurs estimées étaient conformes aux comptages manuels effectués par un pathologiste (KM). taux de TC a été déterminé à partir d'images en distinguant les noyaux de cancéreux de ceux des cellules non cancéreuses (Fig 3D).

Les données de PCR numérique et TCR de chaque cas ont été tracées sur le graphique de TC (figure 4), y compris les données pour -Lave-vaisselle-positif (rouge) de HER2, -equivocal (violet) et séronégatifs (bleu), ainsi que HER2-IHC-positive (losanges), -equivocal (triangles), et séronégatifs ( repères en croix) échantillons. informations clinicopathologique sur des cas représentatifs et le total est indiqué dans le tableau 3 et S1 Table respectivement. Il n'y avait pas HER2
cas de -Lave-vaisselle positif en dessous du seuil [ r
= x
+ 1]; cependant, un -Lave-vaisselle négatif de HER2 ( ), deux (n ° 8 et n ° 15), et trois positifs (,)et,) cas équivoques ont été observés dans la zone équivoque . En outre, il y avait un Le cas de -Lave-vaisselle négatif de HER2 dans la zone positive (!). Trois cas (,et*) ont présenté des valeurs de PCR numériques remarquablement élevé (28,25, 19,99 et 24,00, respectivement). Dans HER2 de la -Lave-vaisselle, ces cas ont montré une regroupés Les signaux HER2 de (figure 3C) qui étaient difficiles à quantifier, comme dans SK-BR-3 cellules. Eq (1) a également été exprimé comme suit: (11)

Théoriquement estimé [ B
/ A
] a été calculée par application de mesure [ r
] et [ x
] et mesuré [ A
], qui a été déterminé à partir du nombre de signaux CEP17 obtenus par HER2 de la -Lave-vaisselle dans 20 cellules cancéreuses (tableau 3 et S1 Table). [ B '
] a également été obtenue par la mesure de [ r
] et [ A
] et [ x
= 1], comme décrit pour SK-BR-3 cellules.

Plusieurs cas ont été évalués pour huit patients (figure 4 et S1 Tableau). Tous les cas de chaque patient ont montré les mêmes résultats pour DISH et PCR numérique, sauf pour-24 patients (Pt-24); l'un des cinq cas () était positif et deux (et) étaient négatifs pour les deux mesures. Deux cas négatifs pour DISH ont été alloués au positif (!) et équivoque ( ) zones dans le tableau de TC (tableau 3 et S1 Table).

Au total, 22 cas HER2-IHC avaient un score de 2+ (tableau 4), comprenant trois positifs, 15 négatifs, et quatre cas équivoques sur la base du tableau TC de PCR numérique. Des résultats positifs et négatifs ont été complètement concordant avec ceux de -Lave-vaisselle
HER2. Sur les quatre cas équivoques avec score IHC 2+, un (n ° 1) a été positive et les autres (, et)) étaient négatifs, tel que déterminé par HER2
-Lave-vaisselle. Le [ B
/ A
] valeur estimée était donc ≥ 2,0 dans le cas n ° 1 et < 2.0 dans les trois derniers, sauf pour le cas n ° 41, l'estimation [ B
/ A
] qui était 2.12.

Évaluation du intratumorale hétérogénéité HER2 dans des échantillons chirurgicaux

intratumorale HER2 hétérogénéité a été évaluée par une combinaison de HER2 CHI /-Lave-vaisselle et une PCR numérique (figure 5, figure S1 et S2 tableau). Case_1, 2 et 4 ont montré une hétérogénéité intratumorale distincte composée de lésions HER2-IHC-positifs et séronégatifs dans un cluster, tandis que Case_3 a montré en général un modèle d'expression HER2-IHC équivoque. Surtout, les lésions HER2 positifs sont accessibles à partir de la lumière de l'estomac dans Case_1 (-2,-3), Case_2 (-1, 2-2) et Case_4 (-4).

Tous les HER2-IHC /cas-positifs ont été -Lave-vaisselle tracées dans la zone positive. Trois échantillons de Case_3 (-1, -2 et -3) montrant HER2-IHC (équivoque) et HER2 de la -Lave-vaisselle (positif) ont été tracées dans la zone équivoque. Exemple-2 a été tracée dans la zone équivoque, car la région-2 couvrait une surface relativement importante contenant des composants à la fois HER2-positifs et séronégatifs. Exemple-2 a montré des divergences entre HER2-IHC (positif) et HER2 de la -Lave-vaisselle (négative) (S2 Table), avec les résultats de la PCR numérique correspondant à HER2 de la -Lave-vaisselle.

Discussion

l'étude est la première à tenter une catégorisation des cancers gastriques dans amplification négatif, -equivocal et -positifs les cas de HER2 en utilisant une dispersion à deux dimensions parcelle ou TC graphique, en fonction des valeurs mesurées de HER2
/rapport CEP17 obtenu par PCR numérique [ r
] et TCR [ x
] sans conventionnelle HER2
-Lave-vaisselle ou des informations HER2-IHC. Ainsi, une analyse par TC graphique est indépendante de CEP17 et HER2
nombre de copies ([ A
] et [ B
]) dans une seule cellule cancéreuse, qui peut normalement être obtenus par HER2
-Lave-vaisselle.

la méthode PCR numérique a été appliquée à l'évaluation du nombre de copies de virus [28], l'aneuploïdie chromosomique foetale [29] et dans plusieurs oncogènes les tissus de cancer [30, 31]. Un problème majeur qui doit être surmonté est la correction des données brutes en fonction du contenu de la tumeur des spécimens; les tissus de cancer gastrique contiennent généralement des quantités plus importantes de l'infiltration des cellules non cancéreuses, par exemple les cellules interstitielles ou inflammatoires. Dans la présente étude, nous avons utilisé l'analyse d'image pour obtenir une estimation semi-automatique du contenu des cellules de la tumeur et développé le tableau TC pour classer les données en trois catégories-i.e., Amplifié, non-amplifiés, et équivoques. Il pourrait être possible de purifier les cellules cancéreuses de coupes de tissus FFPE par microdissection, mais cela est trop laborieuse pour la pratique clinique de routine, même si elle est plus précise en théorie. En utilisant cette approche pour les échantillons de biopsie, le nombre de cas HER2-IHC-équivoques (2 +) a été réduit de 22 à six, ainsi la nécessité d'une confirmation par HER2 de la -Lave-vaisselle pourraient être évités à moins de 30% des cas. La fréquence de HER2 de l'amplification varie d'un cancer gastrique types histologiques, de 20% à 30% dans l'intestin à < 10% dans le type diffus [32]. Par conséquent, une méthode de dépistage efficace est nécessaire dans la pratique clinique de routine, en particulier dans les pays à forte prévalence du cancer gastrique. TC graphique peut également être utilisé avec une autre méthode basée sur la PCR, par exemple la PCR quantitative pour HER2 de l'amplification [33].

Il existe des avantages supplémentaires au protocole de PCR numérique. Tout d'abord, il est simple par rapport à ISH, qui exige des compétences et de main-d'œuvre, comprenant plusieurs étapes. Deuxièmement, le nombre de cas sont nécessaires pour la validation que sont nécessaires pour HER2
-Lave-vaisselle, ce qui rend rentable. Enfin, il est seulement nécessaire de concevoir des amorces spécifiques qui peuvent être appliquées à des gènes autres que HER2
, ce qui en fait une technique plus polyvalent que ISH ou IHC.

Un problème majeur avec HER2- actuelle IHC et protocoles ish est le fait que HER2-IHC 0/1 + cas peuvent montrer des signaux positifs par HER2 de l'ish [19]. Cela n'a pas été observé dans la présente étude, mais deux HER2-IHC 1+ échantillons (N ° 14 et N ° 15) avaient des valeurs de 1,98 et 1,89 par HER2
-Lave-vaisselle. Le nombre moyen de copies de HER2 dans les deux échantillons étaient 4.15 et 5.05 par HER2 de test de sonde unique, respectivement (S1 Table). La ligne directrice mise à jour ASCO /CAP pour le cancer du sein a adopté les critères d'équivoques pour HER2 de l'amplification, qui est, [ HER
2 /CEP17 rapport < 2.0] et la valeur absolue de [moyenne HER nombre de copies
2 ≥ 4,0 et < 6.0 signaux /cellule] par HER2 de la -Lave-vaisselle [19]. Si cela vaut pour les deux cas (N ° 14 et N ° 15), ceux-ci étaient HER2
-Lave-vaisselle équivoque. De plus, il y avait un cas ()) montrant négatif HER2
/rapport CEP17 et moyen positif Les signaux HER2 de dans une cellule cancéreuse (tableau 3). D'autres études sont nécessaires dans le cancer gastrique pour prouver si l'analyse de la sonde unique est suffisante ou non.

aneusomie du chromosome 17 (monosomie et polysomie) peuvent affecter amplification des mesures de HER2 par le HER2
/rapport CEP17, bien que son importance clinique est inconnue en l'absence de surexpression de HER2 sur IHC [19]. Dans cette étude, il n'y avait aucun cas montrant en moyenne le nombre de copies de CEP17 [ A
] moins de 2,0 (tableaux S1 et S2). Polysomie peut être plus fréquente dans le cancer gastrique, mais le nombre de copies moyen de CEP17 [ A
] ne pas dépasser 6,0. Depuis le biais de sélection n'a aucune incidence sur les régions chromosomiques sans oncogènes, CEP17 nombre de copies peut être relativement stable et facile à compter. Jacquemier et al
. rapporté concordance bien entre le poisson et le temps réel de PCR quantitative (qPCR) que les techniques alternatives dans une grande série de patients atteints de cancer du sein [33]. Ils ont souligné que la fiabilité de qPCR a été augmentée en préparant plusieurs jeux d'amorces pour les régions chromosomiques. Il est ainsi possible d'adopter un autre ensemble d'amorces pour CEP17 pour déterminer les valeurs moyennes de [ A
] par PCR numérique.

L'hétérogénéité histologique des tumeurs est un problème majeur associé à HER2
mesures d'amplification, en particulier dans le cancer gastrique. Cela a été illustré dans la présente étude par le patient 24 (cas-!) de l'examen de la biopsie. L'amplification a été mise en évidence par DISH seulement l'un des cinq échantillons qui présentaient le type histologique intestinal. D'autre part, l'analyse PCR numérique TC graphique assistée classé deux échantillons amplifiés, l'un comme équivoque, et seulement deux comme négatif. En tant que tel, ce procédé peut être en mesure de réduire le nombre d'échantillons requis pour la mesure.

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