PLOS ONE: surexpression du récepteur pour produits de glycation avancés (RAGE) est associée à un mauvais pronostic dans gastrique Cancer

Résumé

Contexte

Le récepteur pour produits de glycation avancée (RAGE) est un oncogénique récepteur trans-membraneuse multidisciplinaire, qui est surexprimée dans les cancers humains multiples. Récemment, il a été montré que le RAGE est également impliquée dans la carcinogenèse et l'invasion tumorale. Dans cette étude, nous avons étudié les niveaux d'expression et de la valeur pronostique de RAGE dans les cancers gastriques primaires (GC).

Méthodes

Nous avons étudié l'expression de RAGE GC primaire et appariés tissu gastrique normale par réel temps de RT-PCR quantitative (n = 30) et l'analyse par Western blot (n = 30). En outre, nous avons effectué immunohistochimie sur 180 spécimens GC paraffine, 69 spécimens normaux appariés.

Résultats

RAGE a été surexprimé dans GC par rapport aux tissus noncancerous adjacents ( P
<0,001), et plus l'expression de RAGE en corrélation significative avec le grade histologique ( P
= 0,002), le statut ganglionnaire ( P
= 0,025), le statut de la métastase ( P
= 0,002), et American Joint Committee sur la scène du cancer ( P
= 0,020). En outre, la régulation positive de l'expression de RAGE est un facteur pronostique indépendant en analyse multivariée en utilisant le modèle de régression de Cox ( P
= 0,001).

RAGE surexpression de conclusions peut être un utile marqueur pour prédire la progression de la GC et de mauvais pronostic

Citation:. Wang D, Li T, Ye G, Shen Z, Hu Y, T Mou, et al. (2015) La surexpression du récepteur pour produits de glycation avancés (RAGE) est associée à un mauvais pronostic dans le cancer gastrique. PLoS ONE 10 (4): e0122697. doi: 10.1371 /journal.pone.0122697

Academic Editor: Valli De Re, National Cancer Institute IRCCS, ITALIE

Reçu le 22 Novembre 2014; Accepté le 13 Février 2015; Publié 10 Avril, 2015

Droit d'auteur: © 2015 Wang et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes sont dans le papier

financement:. Ce travail a été soutenu par le programme de la nationale clé médicale clinique, le Fonds pour la recherche du bien-être public dans l'industrie de la santé (No.201402015), le programme majeur de la science et de la technologie Programme de Guangzhou (No.201300000087), et le national Key Technology R & D Program (No.2013BAI05B00). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le récepteur de produits terminaux de glycation (RAGE), une molécule de surface cellulaire exprimée dans une gamme de types de cellules, est un membre de l'multiligand superfamille des immunoglobulines [1]. RAGE a été impliqué dans un large éventail de réponses pathologiques, comprenant l'inflammation et le cancer, en fonction de la variété de ses ligands [2]. Comme un récepteur trans-membraneuse oncogénique nouvellement reconnu, il a été démontré d'être impliqués dans plusieurs cancers humains stimulant la croissance, la survie et la dissémination métastatique [3]. Plusieurs études ont démontré que RAGE est régulée positivement et perd son motif caractéristique granulaire dans les tumeurs primaires [4]. L'interaction AGE-RAGE joue un rôle crucial dans le développement du cancer de la prostate, et l'inhibition de cette interaction a un potentiel en tant que nouvelle cible moléculaire pour la prévention ou le traitement du cancer [5]. Co-expression de RAGE et de mobilité élevée des protéines du groupe B1 (HMGB1) a été sensiblement associée à l'invasion du cancer colorectal et des métastases [4,6,7]. En outre, l'expression de RAGE est en corrélation avec l'angiogenèse et la tumeur métastases par voie orale, le carcinome épidermoïde (CCCO) et peut être un facteur pronostique indépendant pour la récidive et le pronostic chez les patients CCCO [8,9]. En outre, le polymorphisme génétique du gène RAGE peut être un biomarqueur prédictif utilisé à l'écran pour les patients sensibles à la thermothérapie et d'évaluer le pronostic de cancer non à petites cellules du poumon (NSCLC) patients [10].

Cependant, le rôle de RAGE dans le cancer gastrique (GC) est resté inaccessible. RAGE a été indiqué précédemment étroitement associé à l'invasion et les métastases dans le cancer gastrique [11]. En outre, il a été rapporté que le blocage de la signalisation RAGE supprime la croissance et les métastases des cellules cancéreuses gastriques [12]. Dans une enquête sur le rôle de RAGE dans GC pathogenèse et la progression et les effets de ses polymorphismes géniques sur la fonction du récepteur, Gu et ses collègues [13] ont démontré que RAGE Gly ^{82Ser polymorphisme peut être associé à un risque accru d'initiation ou progression du carcinome gastrique. Cependant, à notre connaissance, la relation entre l'expression de RAGE et GC pronostic des patients est inconnue.}

Dans cette étude, nous avons analysé RAGE niveau d'expression dans GC en utilisant en temps réel RT-PCR quantitative (qRT-PCR), Western blot et immunohistochimie (IHC). Nous avons identifié une relation entre l'expression de RAGE et les caractéristiques clinico de GC, puis évalué la valeur pronostique de l'expression de RAGE pour la survie post-opératoire des patients du GC.

Déclaration d'éthique de matériaux et méthodes

Cette étude a été approuvée par le Comité d'éthique hôpital Nanfang et le consentement éclairé écrit a été obtenu par tous ces patients impliqués.

patients et échantillons de tissus

Trente appariés frais congelé gastrique cancéreux et tissu muqueux non cancéreuses correspondantes (excisé > 10 cm à partir du bord du CPG) ont été prélevés sur des patients en GC dans les 30 minutes après la résection et immédiatement stockés dans l'azote liquide jusqu'à utilisation. Un autre 180 paraffine GC blocs de tissus et 69 échantillons de contrôle de tissus gastriques normaux appariés prélevés sur la marge de résection distale ont été obtenues à partir des fichiers stockés du Département de chirurgie générale, Hôpital Nangfang, Southern Medical University, ont été recueillis chirurgicalement entre Janvier 2007 et Décembre 2008. Les 180 patients inclus 120 hommes et 60 femmes âgées de 22-78 ans (moyenne, 55,62 ans). Aucun de ces patients ont été traités par radiothérapie ou une chimiothérapie avant la chirurgie. Le type histopathologique et le stade des échantillons réséqués ont été déterminées selon les critères de la classification de l'Organisation mondiale de la santé et de la American Joint Committee on Cancer (AJCC) Cancer Staging Manual (la 7e édition, 2010). Parmi eux, 125 patients de stade I-III ont reçu une résection radicale (19, 25 et 81 pour les étapes I, II et III, respectivement), et 55 Stage-IV patients ont reçu la chirurgie et /ou la chimiothérapie palliative. Les organes distants de métastases chez les patients affectés Stade IV-inclus le péritoine, les ganglions lymphatiques distants, le foie, le côlon transverse, de l'ovaire ou de l'oviducte, le pancréas, les intestins, les os, les poumons, le cerveau et la veine cave inférieure. Les patients ont été suivis jusqu'à la mort ou la dernière date de suivi (30 Décembre 2013). La durée médiane de suivi était de 48 mois (de 2 à 82 mois).

extraction et de l'ARN total en temps réel
RT-PCR quantitative

L'ARN total a été extrait de tissus émincés avec le TRIzol réactif (Takara, Japon) et transcription inverse en ADNc premier brin avec le kit de transcription inverse TaqMan (Takara, Japon). Ensuite, des aliquotes de 0,5 à 1 ul de l'ADNc ont été utilisés comme matrices pour amplifier le fragment de RAGE (avant: 5- AAACATCACAGCCCGGATTG-3, à l'inverse: la 5- TCCGGCCTGTGTTCAGTTTCT-3) dans les conditions suivantes: 95 ° C pendant 30 s; 40 cycles de 95 ° C pendant 5 s; 60 ° C pendant 30 s; et fondant à 95 ° C pendant 5 secondes, suivi par 60 ° C pendant 1 min et refroidissement à 50 ° C pendant 30 secondes. collection PCR et les données ont été effectuées sur le système LightCycler480 (Roche, Suisse) avec 2 x SYBR Green kit master mix (Invitrogen, Carlsbad, Californie, USA). l'expression du RAGE a été étalonnée par rapport à celui de la GAPDH.

Analyse par Western Blot

Western Blot a été effectuée selon des procédés standard, comme décrit précédemment [14]. En bref, les tissus ont été broyés et lysées avec un tampon de lyse RIPA et les lysats ont été récoltées par centrifugation (12 000 tours par minute) à 4 ° C pendant 30 min. Les concentrations en protéines ont été déterminées en utilisant le kit Protein Assay Acid Bicinchoninic (Pierce, Rockford, IL, USA). Environ 50 pg d'échantillons ont ensuite été séparés par électrophorèse sur 10% de dodécylsulfate de sodium (SDS), des gels de Polyacrylamide et transférés sur une membrane de difluorure de polyvinylidène. Après avoir bloqué les sites de liaison non spécifiques, la membrane a été incubée avec un lapin polyclonaux anti-RAGE anticorps (Santa-Cruz, CA, USA) à une dilution de 1: 1000 à 4 ° C pendant la nuit. Après trois lavages avec du TBST (solution saline tamponnée au Tris avec du Tween-20) pendant 10 minutes, les membranes ont été incubées avec un anticorps secondaire à une dilution de 1: 3000 à la température ambiante pendant 60 min. Les protéines ont été détectées avec un système de chimioluminescence amélioré (Amersham Pharmacia Biotechnology, Piscataway, NJ, USA), et normalisée à la ß-actine détectés en utilisant un anticorps β-actine anti-humain de souris (dilution 1: 1000; Sigma, St. Louis, MO , États-Unis).

immunohistochimique test

Le test IHC a été réalisée comme décrit précédemment [12,14]. Brièvement, les lames ont été déparaffinées avec du diméthylbenzène et réhydratées par un gradient d'éthanol (100%, 95%, 90%, 80% et 70% d'éthanol) dans de l'eau. Après un lavage avec du PBS (solution saline tamponnée au phosphate) pendant trois heures, les lames ont été bouillis dans un tampon de récupération d'antigène, 0,01 M de citrate de sodium-acide chlorhydrique (pH = 6,0) pendant 30 min dans un four à micro-ondes. Après une activité de peroxydase endogène a été arrêtée avec 3% H _{2O 2, après trois lavages PBS, l'anticorps liaison non spécifique a été bloquée en incubant les lames avec 10% de sérum de chèvre normale non immun. Les sections ont ensuite été incubées à 4 ° C pendant la nuit avec l'anticorps polyclonaux de lapin RAGE (Santa-Cruz, CA, USA) à une dilution de 1: 400 et ensuite incubés avec la peroxydase de raifort (HRP) (kit de détection de EnVisionTM DAKO ChemMateTM) à la température ambiante pendant 30 min. Après lavage en PBS, les sections ont ensuite été développés en utilisant le 3,3-V-diaminobenzidine (Sigma), lavé à l'eau du robinet, et légèrement de contraste avec hématoxyline avant déshydratation et lamelle de montage. expériences de contrôle négatif ont été réalisées en remplaçant l'anticorps primaire avec du PBS.}

immunocoloration a été analysé par deux observateurs indépendants (Y.X. et L.Z.) qui ont été aveuglés à l'issue des patients et d'autres paramètres clinicopathologiques. Le système de détection RAGE a été décrit précédemment [12]. Tous les échantillons ont été classés par l'étendue de immunoréactivité: 0, < 5%; 1, 5% -10%; 2, 10% -50%; 3, 50% à 75%; 4, > 75%. intensité de coloration a été marqué comme 0, négative; 1, faible; 2, modérée; 3, forte. Pour chaque cas, le score total de immunocoloration aussi connu comme l'indice de coloration (SI), a été calculé en multipliant le pourcentage de cellules positives avec le score d'intensité de coloration, ce qui donne une valeur comprise entre 0 et 12. Pour cette étude, une valeur de coupure optimale était identifié comme suit: SI < 8 a été utilisé pour indiquer une faible expression de RAGE et SI≥8 haute RAGE expression

l'analyse statistique

l'analyse statistique a été effectuée à l'aide du logiciel statistique SPSS (version SPSS 19.0.; SPSS, Chicago, IL, USA). A-échantillons appariés t-test a été utilisé pour comparer les ARNm de RAGE et les taux de protéines dans les échantillons de tissus cancéreux et non cancéreux adjacents. Le test de Mann-Whitney U ou de test Pearson Chi-Square a été utilisé pour comparer les scores SI obtenus par analyse immunohistochimique du GC et des tissus de la muqueuse normale correspondante. La relation entre l'expression de RAGE et les caractéristiques clinico ont été analysées en utilisant le test chi carré de Pearson. Les courbes de survie ont été calculées selon la méthode de Kaplan-Meier et analysées en utilisant le test du log-rank. Le modèle des risques proportionnels de régression de Cox a été utilisé pour l'analyse univariée et multivariée pour évaluer le rapport de risque (HR) et identifier les facteurs qui permettent de prédire la survie. A deux côtés valeur p <. 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives
de

Résultats surexpression de RAGE en GC humaine

Pour élucider le rôle de RAGE dans le développement de GC et la progression, nous avons d'abord analysé l'expression dans des échantillons de tissus GC et apparié non cancéreuses adjacentes au niveau de l'ARNm. En temps réel une analyse RT-PCR quantitative a montré que le RAGE était surexprimé dans la majorité des tissus GC par rapport à leurs homologues normaux (19/30, 63,3%) (figure 1). RAGE était régulée positivement de façon similaire au niveau de la protéine dans CA, comme le montre par Western Blot et des essais IHC. niveau d'expression de RAGE Elevated a été trouvé par l'analyse Western blot 26 de 30 (86,7%) par rapport aux glucocorticoïdes tissus normaux (Fig 2). blocs paraffinés (n = 249) provenant de 180 patients atteints de GC ont été évalués pour l'expression de la protéine RAGE par IHC (tableau 1). coloration Absent ou faible (SI < 8) de la muqueuse gastrique normale a été observée dans 55 des 69 cas (79,7%), alors que la coloration élevée (SI≥8) a été noté dans la majorité des tissus GC (111/180; 61,7%). expression de RAGE était significativement plus élevée dans les tissus GC (n = 180; SI = 6,22) par rapport aux tissus gastriques normaux (n = 69; SI = 2,09; P
< 0,001). Des exemples représentatifs de faibles, modérées, une forte coloration (micrographies avec 200 × grossissement) sont présentés dans la figure 3.

Association d'expression de RAGE avec des caractéristiques clinico

Sur la base des catégories que nous avons définies dans le la section Méthodes, les données ont montré que l'expression élevée de RAGE était significativement corrélée avec le grade histologique ( P
= 0,002), le statut ganglionnaire (stade N, P
= 0,025), le statut de métastases (M stade, P
= 0,002) et le stade AJCC ( P
= 0,020), mais n'a pas été avec le sexe, l'âge, la taille de la tumeur, la localisation de la tumeur, la classification Lauren ou l'invasion tumorale (Tableau 2).

corrélation entre l'expression de RAGE sur la base de l'IHC et la survie des patients

La courbe de Kaplan-Meier a montré que les patients du groupe de haute RAGE avaient une survie globale significativement pire que les patients à faible RAGE groupe ( P
< 0,001; Fig 4A). Les patients présentant une expression élevée de RAGE ont également eu une survie globale significativement pires que celles avec une faible expression de RAGE dans le stade AJCC III /IV de sous-groupe (n = 136; P
< 0,001; la figure 4C), mais pas dans le stade AJCC I /II sous-groupe (n = 44; P
= 0,695; Fig 4B).

univariée et multivariée analyses

l'analyse univariée a montré une relation significative entre l'ensemble la survie et l'âge, l'invasion tumorale, le statut ganglionnaire, statut de métastases, le stade AJCC et d'expression de RAGE (voir le tableau 3). Tous ces facteurs sont inclus dans un multivariée de Cox modèle des risques proportionnels pour ajuster les effets des covariables. Sur la base de ce modèle, les niveaux d'expression de RAGE (rapport de risque (HR) = 2.143; intervalle de confiance à 95% (IC à 95%) = 1,357 à 3,383; P
= 0,001) et l'invasion tumorale (HR = 11,209; 95 % CI = 1,297 à 96,874; P
= 0,028) ont été confirmés comme des facteurs pronostiques indépendants (tableau 3)

Discussion

GC reste l'une des tumeurs malignes humaines les plus mortelles. , en particulier en Asie de l'Est. En dépit des avancées dans le diagnostic et la thérapie, le pronostic pour le cancer gastrique reste sombre et dépend d'une série de caractéristiques de carcinome, tels que la croissance tumorale, la différenciation, l'invasion et les métastases à distance [15]. tumorigenèse GC et la progression sont mal comprises, processus multi-étapes complexes réglementées par des signaux intrinsèques et extrinsèques cellulaires impliquant de multiples altérations des gènes et des protéines. Il est essentiel d'identifier et de comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents initiation et la progression tumorale de développer des approches rationnelles et spécifiques du cancer au diagnostic précoce et le traitement de la GC.

Dans cette étude, nous avons étudié le statut d'expression de RAGE en GC tant au niveau de la protéine et l'ARNm trouvé et que RAGE a été remarquablement upregulated dans les tissus humains GC par rapport à l'épithélium gastrique normale. l'analyse IHC a été réalisée pour valider davantage cette régulation positive de l'expression de RAGE dans GC primaire. Nous avons observé un niveau élevé d'expression de RAGE était significativement associée avec le grade histologique, le statut ganglionnaire, le statut de la métastase, et le stade AJCC en GC, similaire aux résultats précédents dans CCCO et NSCLC [9,10]. Pris ensemble, ces résultats suggèrent que RAGE peut être impliqué dans la progression de la GC.

Nous avons également déterminé pour la première fois que l'expression de RAGE est un fort prédicteur de mauvais pronostic pour les patients du GC, semblable aux résultats dans le cancer colorectal, hépatocellulaire cancer, CCCO et NSCLC [9,10,16,17]. Cependant, l'impact pronostique de l'expression de RAGE semble varier selon le stade du cancer (figure 4). Dans la présente étude, l'analyse de survie a suggéré que l'invasion tumorale et l'expression de RAGE prédit indépendamment de la survie globale médiocre. La taille relativement réduite de l'I de la scène et le groupe II échantillons pourraient être responsables de la différence. La plupart des patients avec GC en Chine sont diagnostiqués à un stade avancé en raison d'un manque de détection précoce efficace. En outre, l'expression de RAGE a une étroite IC à 95% et semble être aa meilleur prédicteur pour GC par rapport à l'invasion tumorale dans cette étude.

RAGE est un récepteur de reconnaissance de motif qui se lie à de multiples ligands dérivés d'un environnement de cellule endommagée, et joue un rôle crucial dans la promotion de la tumorigenèse gastro [18]. Aussi comme un médiateur inflammatoire important RAGE pourrait moduler la diaphonie entre les voies de survie et autophagie dans les cellules tumorales et favoriser la survie de la tumeur par le maintien autophagy et de limiter l'apoptose [19]. Kuniyasu et al
. [11] ont rapporté que, l'expression de RAGE est étroitement associée à l'invasion et les métastases chez les patients du GC, qui nous fournit une base expérimentale pour l'étude fonctionnelle de RAGE dans le cancer gastrique. Par la suite, Xu et al [12] ont démontré que l'effet de choc de RAGE réduit la prolifération des cellules GC et l'invasion de cancer de l'estomac, une diminution de l'expression de l'AKT, le PCNA et la MMP-2 et l'apoptose cellulaire induite et de l'arrêt du cycle. Par conséquent, l'inhibition de RAGE ou ses ligands peuvent servir de nouvelles cibles pour améliorer les thérapies actuelles du cancer ciblé.

À ce jour, la valeur de ciblage RAGE pour une éventuelle intervention précoce et la prophylaxie en GC reste incertaine. Cependant, plusieurs études ont mis en évidence le rôle de RAGE dans d'autres types de cancer et ont démontré que le blocus de RAGE a diminué la croissance et les métastases des deux tumeurs et les tumeurs implantées en développement spontanément chez les souris sensibles. L'inhibition de la prolifération diminuée RAGE dans les cellules cancéreuses du sein et de l'apoptose cellulaire induite et de la croissance du cancer de la prostate inhibée [20,21]. La dysfonction RAGE a également inhibé l'angiogenèse et la progression du cancer colorectal, et prolongé la survie dans le cancer du pancréas [22-24]. Blocus de RAGE avec RAGE soluble (sRAGE) atténué les lésions hépatiques, ce qui améliore la survie, la protection contre la nécrose hépatocellulaire, et le renforcement de l'expression du facteur-a de nécrose tumorale pro-régénérateur de cytokines [25]. Par ailleurs, Moy et al. [26] ont trouvé une association inverse statistiquement significative entre l'exposition à la limite de sRAGE continu et le risque de cancer du foie, ce qui suggère que sRAGE peut protéger contre les effets inflammatoires provoquées par l'activation de RAGE. Ces résultats indiquent que régulièrement RAGE pourrait aussi agir comme une cible thérapeutique potentielle dans GC. Etant donné ses caractéristiques biologiques, RAGE et ses dérivés ont été considérés comme un nouvel indicateur pour le potentiel malin y compris GC. Le RAGE Gly ^{82Ser polymorphisme a été montré pour être associé à un risque accru pour le développement de GC ou de la progression dans une étude cas-témoins en milieu hospitalier [13].}

Dans la présente étude, nous avons constaté que surexpression d'expression de RAGE était significativement associée à de mauvaises caractéristiques clinicopathologiques et la survie globale faible, ce qui suggère qu'il pourrait contribuer au potentiel malin de GC. Par conséquent, RAGE pourrait donc servir de nouveau biomarqueur utile pour prédire le pronostic et une cible thérapeutique potentielle pour les patients avec GC. Toutefois, d'autres études sont nécessaires pour clarifier les mécanismes sous-jacents de RAGE surexpression, contribuant ainsi à une meilleure compréhension et le développement de son utilisation potentielle plus loin.

Remerciements

Nous remercions le Dr Yan Xiao et le Dr Liang Zhao du Département de pathologie pour le diagnostic pathologique et la confirmation des résultats IHC.

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